Лепка ежик: Лепка в 1 младшей группе тема "Ежик"

  • Home
  • Разное
  • Лепка ежик: Лепка в 1 младшей группе тема «Ежик»

Содержание

Лепка в 1 младшей группе тема «Ежик»

Лепка в 1 младшей группе

тема: «Ежик»

Цель: развивать у детей интерес к лепке; совершенствовать умение скатывать глину круговыми движениями, учить оттягивать пальцами отдельные детали. Детей 4 лет учить лепке ежа по представлению, добиваться выразительной передачи образа.

Материал: Иллюстрации с изображением ежа, игрушечный ежик, пластилин, доска для лепки, мелкая вермишель для иголок, черный перец горошек для глаз и носа, макет полянки, длинные и короткие полоски. Аудиозапись: пение птиц.

Ход занятия:

Воспитатель рассказывает:

«Однажды мама-зайчиха заказала ежику новое платье для Запа. Пришел срок, и они пошли на примерку.

Стучали в дверь ежинова дома, стучали — никто не открывает. Потом слышат, ежик слабым голосом говорит:

— Толкните дверь, она не заперта.

Вошли в дом — ежик лежит в постели, болеет. В комнате

не прибрано. Еда не приготовлена. Даже воды больному подать некому , нет у ежика ни жены, ни детей.

-Ах ты, беда какая! говорит мама-зайчиха. Что же вы нас не позвали, мы бы давно пришли вам помочь и лекарство бы принесли и еду приготовили.

— А как я позову? отвечает ежик. Я же болею. Я даже дверь вам не смог открыть.

— Приходите к нам жить, говорит мама-зайчиха. Одному нельзя — скучно и помочь некому.

— Спасибо вам большое за приглашение, — сказал ежик. Плохо жить одному. Только у вас ведь своя семья, заячья. Вот если бы у меня дети были, я бы их научил шить платьица и шубки. А на ночь рассказывал бы сказки. Подарки бы им дарил на день рождения и просто так. Очень жалко стало зайцам ежика. У них-то самих семья большая и дружная».

Воспитатель спрашивает, не хотят ли дети вылепить из глины много ежат, чтобы у лесного портного тоже была своя большая и дружная семья. Получив согласие, предлагает научить их лепить ежат.

Воспитатель: перед тем ,как лепить разомнем пальчики.

пальчиковая гимнастика » Наша семья»

(По очереди разгибайте пальчики, начиная с большого)

Этот пальчик большой —

Это папа дорогой.

Рядом с папой — наша мама.

Рядом с мамой — брат старшой.

Вслед за ним сестренка —

Милая девчонка.

И самый маленький крепыш —

Это славный наш малыш.

Показ способа лепки осуществляется после того, как дети вместе с воспитателем рассмотрят ежа-игрушку или ежа — скульптуру малых форм. В процессе восприятия педагог обращает внимание детей на форму тела, маленькую мордочку, короткие лапки.

Когда дети закончат лепку, воспитатель делает вид, что берет телефонную трубку и с кем-то разговаривает. Сообщает, что звонит еж, который очень волнуется и спрашивает, на самом ли деле у него теперь будет много умных, красивых и послушных детей. Узнав от детей (хоровой ответ), что это правда, он выражает желание немедленно приехать и забрать ежат в свой лесной домик.

Воспитатель организует приезд ежа (игрушка) на большой грузовой автомашине. Еж благодарит детей и спрашивает совета, какие имена дать ежатам. Затем говорит, что, к сожалению, у него в домике нет ни кроваток, ни скамеек, ни тарелок, и просит детей сделать из строительного материала все необходимое для его семьи.

Когда дети начинают терять интерес к игре, воспитатель берет ежа и начинает беседовать с ними. Еж спрашивает, как его зовут, сколько ему лет. Советуется, чем ему лучше всего кормить своих детей, где можно взять еду. Интересуется, во что можно поиграть с ежатами. Просит назвать самые интересные сказки и самые красивые стихи. В конце беседы еж спрашивает, что ребенок построил для его сына (дочки). Затем благодарит и приглашает приехать приехать к нему в лес на поезде.

Конспект занятия по лепке в младшей группе «Ежик» (Младшая группа)

Конспект занятия по лепке в младшей группе «Ежик» (Младшая группа)

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ДЕПАРТАМЕНТ ОБРАЗОВАНИЯ КОМИТЕТА ПО СОЦИАЛЬНОЙ ПОЛИТИКЕ И КУЛЬТУРЕ АДМИНИСТРАЦИИ г. ИРКУТСКА МУНИЦИПАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ ДОШКОЛЬНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ г. ИРКУТСКА ДЕТСКИЙ САД №173 (МБДОУ г. Иркутска детский сад №173)

Составила и провела Воспитатель: Лебедева Екатерина Константиновна

Занятия изобразительной деятельности помогают ребенку овладеть элементарными приемами лепки, а так же благотворно влияют на общее развитие ребенка: воспитывают чувство прекрасного, развивают мышление, воображение, внимание, память, формируют трудолюбие.

Цель: Учить детей делать большой шар из пластилина, скатывая его круговыми движениями на доске для лепки. Учить оформлять поделку. Развивать мелкую моторику рук и координацию движения пальцев рук. Воспитывать отзывчивость и доброту.

 

Задачи:

1. Художественно эстетическое развитие:

  • прививать у детей интерес к творческой деятельности
  • развивать усидчивость, собранность, старательность, аккуратность и внимательность
  • развивать мелкую моторику рук

2. Развитие речи:

  • активизация словаря по теме

3. Познавательное развитие:

  • закреплять знание о среде обитания ежей.

Демонстрационный материал:

  • игрушечный ежик (резиновый), картинки с изображением ежика.

Раздаточный материал:

  • пластилин, спички, картонка-подставка для готового изделия, доска для лепки.

Ход занятия:

Воспитатель: — Посмотрите ребята, кто к нам в гости пришел из леса маленький ежик. Но только он почему то грустит. А давай те его развеселим- сами превратимся в ежиков. Для этого нам нужно сцепить вместе пальцы рук. Прямые пальчики- «колючки» торчат вверх. Пальчики согнутые- ежик свернулся в клубочек

(повторяем несколько раз).

Воспитатель: — Ребята, ежик по-прежнему очень грустный. Чем же он так расстроен? (воспитатель отвечает за ежика): — Мне скучно в лесу, у меня совсем нет друзей и мне не с кем поиграть. Помогите мне, пожалуйста, ребята!

Воспитатель: — Ну что ребята, поможем ежику? Давайте сделаем ему друзей.

Показываем детям, как нужно круговыми движениями между ладоней скатать большой шар из пластилина. Если у ребенка не получается — помогаем. Пусть дети выполняют трудоемкую работу, втыкая в спинку ежика спички, а так же катают маленькие шарики для глаз, ножек и носика.

Воспитатель: посмотрите ребята, какие у нас получились замечательные ежики. Как много у нашего ежика новых друзей! Теперь нашему ежику будет не скучно в лесу.

Ребята, вам нравятся получившиеся ежики? Какие именно ежики вам понравились? Почему они вам понравились? Что нового вы сегодня узнали? Понравилось вам?

< Предыдущая   Следующая >

«Ежик» Художественно-эстетическое развитие (лепка).

Конспект НОД «Ежик» (возраст 6-7 лет)

Образовательная область: Художественно-эстетическое развитие (лепка).

Цель: развитие художественно – творческих способностей детей.

Задачи:

Образовательные: Совершенствовать умение лепить из целого куска, правильно передавать пропорции тела, придавать линиям плавность, делить целое на части, соединять элементы между собой.

Развивающие: Повышать сенсорную чувствительность, развивать воображение.

Воспитательные: Воспитывать самостоятельность и целенаправленность в работе, умение доводить начатое дело до конца

Предварительная работа:

— рассматривание иллюстраций с изображением ежика;

— чтение стихотворений про ежика, загадывание загадок;

— дидактические игры «Узнай по описанию»;

— наблюдение за ежиком в парке.

Оборудование: пластилин, дощечки, стеки, салфетки, иллюстрации с изображением ежика, ежик.

Методы и приемы:

 игровая мотивация, художественное слово, рассматривание иллюстраций, словесное объяснение и показ приемов работы, показ образца, самостоятельная деятельность детей, анализ работ.

Ход:

1.Организационный момент (мотивация детей). Ребята, сегодня к нам в гости пришел гость, но чтобы узнать кто это, сначала отгадайте загадку.

2.Вступительная беседа

Загадка: Идет, иглы на себе несет,

Чуть кто подойдёт,

Свернется в клубок –

Ни головы, ни ног. (Еж)

Воспитатель показывает игрушку, обращает внимание на иллюстрации с изображением ежика.

Затем дети рассматривают ежа, уточняют форму тела (туловище, иголки, лапки).

Вопросы к детям (закрепление знаний детей о внешнем виде ежика).

Ёжик — один из самых известных лесных жителей. Любимое место обитания ежа – лиственные и смешанные леса. Болотистых местностей и исключительно хвойных массивов этот лесной житель избегает.

Всё тело ежа покрыто иголками (кроме брюшка, мохнатой мордочки и пушистых лапок). Глаза у колючего – словно две черные блестящие бусинки. Видит он плохо. Нос у ежа всегда влажный.

3.Основная часть:

Сообщение темы (определение темы и цели деятельности)

Показ образца: — У меня есть один ежик. Он грустит.

— Что мы можем сделать, чтобы поднять ему настроение? (Очень хорошая идея – найти нашему ежику друзей.) Сегодня я предлагаю вам сделать слепить ежей.

Показ и анализ образца

Ёжик – серенький клубок.

Прибежал, не видно ног.

Убери иголочки,

Колкий, словно ёлочка

И, как дедушка репей!

Дай, поглажу, поскорей.

Испугался, запыхтел.

Я же поиграть хотел…

Затем дети рассматривают ежа, уточняют форму тела (туловище, иголки, лапки). Воспитатель объясняет приемы лепки ежа.

— Сначала лепим туловище. Раскатываем шар, разрезаем его пополам. Вытягиваем мордочку. Стекой делаем ямки для иголок, намечаем рот и глаза. Вставляем семечки – это у нас будут иголки. Лепим глаза, нос и язык, лапки. При сборке нужно плотно прижимать детали друг к другу. Прикрепляем глаза, нос, язычок. Примазываем лапки. Можно на иголках разместить одно яблочко или маленький гриб.

В конце занятия предложить сравнить изображение с натурой.

Дети играют в пальчиковую игру «Дружные пальчики».

Этот пальчик маленький,

Мизинчик удаленький.

Безымянный – кольцо носит,

Никогда его не бросит.

Ну, а этот – средний, длинный,

И как раз посередине.

Этот указательный,

Пальчик замечательный.

Большой палец, хоть недлинный,

Среди братьев самый сильный.

Пальчики не ссорятся,

Вместе дело спорится.

Организационное окончание:

Что мы делали сегодня?

Что вам особенно понравилось?

Вы сегодня хорошо справились с заданием, молодцы.


 

Поделка нарисованный ежик из семечек. Лепка ежика из пластилина и семечек своими руками поэтапно

Евгения Валь

В гости осень пришла со своими подарками, чудесами, разноцветьем! В лесу происходят чудеса: медведь готовится ко сну, птицы собираются в дальнюю дорогу, белка запасы делает на зиму, а вот и наш ежик . Он не простой, а волшебный из осенней сказки.

Предлагаю вашему вниманию мастер-класс по изготовлению коллективной аппликации «Ёжик из семечек».

Для того чтобы сделать такого ежика из семечек вам понадобиться:

Лист ватмана с готовым силуэтом ёжика;

Семечки;

Листья, засушенные и вырезанные из бумаги;

Клей карандаш.

Подготовительная работа:

Сначала нужно на листе ватмана нарисовать силуэт ёжика. Спинка более круглая и заостренный носик. Вот теперь можно приступить к работе.

Перед началом работы проведем беседу с детьми и вспомним всех диких животных. Предложим детям вспомнить кто из них самый колючий, конечно дети ответят ежик. Но мы с вами будем делать не совсем обычного ежика и его иголки совсем не будут колоться, потому, что вместо иголок мы будем использовать семечки.

Простым карандашом рисуем нос, рот и глаз. Вот такой у нас получился ежик, но ему не хватает иголок. А иголки мы сделаем из семечек. Берем семечки и по одной начинаем приклеивать. Клеем как можно ближе друг к другу, чтобы не оставались просветы.




Ну, вот и все, посмотрите какой замечательный получился ежик. Осталось прицепить к его колючкам листики. Берем клей и также как и семечки, клеем небольшие листочки. Они будут отличным дополнением нашего ежика.


Вот такой ежик у нас получился! Я желаю педагогам и их воспитанникам новых творческих успехов в новом учебном году!

Всем заранее спасибо за внимание! Всем приятного творчества!

Публикации по теме:

. » Зернышки арбузные. Ветерку послушные. Превратились в опавшие листья красные!» Аппликация для детей 2 младшей и средней группы.

Совсем недавно мы впервые столкнулись в работе с чудеснейшим материалом -фетром. И пришли к выводу, что это -исключительный материал для.

Образовательные области: художественно-эстетическое развитие, познавательное развитие, речевое развитие. Задачи: -учить создавать образ.

Вот и пришла долгожданная осень. Есть что то волшебное и очаровательное в этом времени года. Деревья меняют наряды, ветер играет желтой.

Мастер-класс «Кукла из фоамирана» Уважаемые родители, представляю вашему вниманию мастер-класс по созданию мини-куклы из фоамирана на магните.

Добрый день, Коллеги! Вот и пришло время предновогодней подготовки к новогоднему празднику. Сегодня вашему вниманию хочу представить мастер-класс.

Муниципальное автономное дошкольное образовательное учреждение детский сад №12 муниципальное образование Славянский район Мастер-класс.

Любые материалы, которые есть у вас дома, пригодятся для создания необыкновенной поделки аппликация ёжик. Выберете один из доступных (или несколько) материалов – и смело приступайте к труду со своим ребенком. Подготовьте ножницы, клей и хорошее настроение.

Объёмная поделка из бумаги

Создать такую работу очень просто – подготовьте однотонную цветную бумагу нескольких цветов. Придумайте композицию и приступайте к реализации. Мы вырежем несколько заготовок (например, для иголок ежа), согнем их пополам и склеим, чтобы получилась объемная композиция.

Также изготовьте облака, грибок. На место глазика приклейте бусинку. Это занятие подходит для детей от 3 до 5 лет.

Поднлка из карандашной стружки

Казалось ненужные отходы – а получается хороший материал для композиции. Соберите большое количество «юбочек» карандашной стружки и наклейте на трафарет. Это будут колючки ежа.

Для создания яблочка хорошо подходят ниточки. Глазки сделайте бумажные.

Игольчатый из семечек

Нарисуйте или распечатайте трафарет. Выложите иголочки из семечек подсолнуха, соблюдая текстуру настоящих иголок. Более длинный, но натуралистичный путь – ставить семечки вниз закругленной стороной. Но на такое потребуется гораздо больше времени. Маленьким детям кропотливое занятие быстро наскучит. Их можно украсить маленькими грибами или яблоками из пластилина.

Фон украсьте по своему желанию. Красиво смотрится осенний еж. Фон для него может быть из гербария и других природных материалов: круп, шишек. Тельце выкладывают мелкой крупой (например, манкой), а можно его просто покрасить гуашью.

Простое изделие для самых маленьких

Этот же тип – бумажный. Плоская поделка, которую можно использовать как открытку. Вырежьте следующие заготовки.

Наклейте розовый овал на оранжевый. Под розовый элемент перед этим подклейте лапки (раздвоенные полоски).

Делаем глазки, носик, задние лапки.

Делаем надрезы, относительно прямые. Дорезаем до розового круга. Не мельчите. Из прямых полосок делаем острые треугольники. Лапки сцепляем между собой и вставляем туда палочку или леденец.

Таков результат работы:

Он отлично подойдёт в качестве подарка своими руками на день Святого Валентина или на день рождения.

Еще один вариант подойдет для малышей. Для этого вырежьте бумажные полоски длиной 10 см и шириной 1-1,5 см. Согните их пополам (дугой) и наклейте полукругом.

Вырежьте 2 мини-круга и 1 большой круг. Наклейте на заготовку.

Маркером нарисуйте улыбку и носик. для их создания можно использовать обыкновенные листы А4 или другие подручные материалы. Иголки украсьте цветными осенними листьями.

Ёж из вязальных ниток

Для этого изделия нужны будут:

  • толстые вязальные нитки коричневого или черного цвета;
  • картон школьный;
  • клей ПВА;
  • ножницы.

Эта работа скорее кропотливая, чем сложная. Из нитей нарежьте много коротких отрезков. Чем меньше будут отрезки, тем изящнее будет выглядеть. Для детей оптимальная длина 5 см. Так ребенку не надоест трудиться.

Готовые отрезки наклеиваем на картонную заготовку.

Добавляем глазки и рисуем карандашом красные щечки и глазик. Корректором или краской делаем блик на носу.

Выгодно смотрится полуобъёмное творение из осенних листьев. Собирая гербарий, вы можете встретить настоящего колючего друга, и тогда у ребенка точно появится желание потрудиться над такой поделочкой.

Практически все способы сотворить игольчатого животного простые и подходят для детей разного возраста. Усидчивые смогут собрать сложные объемные поделки, а для непосед подойдут простые бумажные открытки.

Видео мастер класс “Аппликация ёжик”

Ежик из арбузных семечек: поделка для детей. Пошаговый мастер-класс с примерами детских работ, творческие задания.

Арбуз — любимое лакомство детей и взрослых. А что делать с арбузными семенами? Из них делают арбузное масло, арбузную муку и, конечно же, детские поделки. Давайте сегодня сделаем вместе с детьми своими руками ежика из арбузных семян.

Материалы и инструменты для изготовления ежика

Для работы Вам необходимо приготовить:

  • цветной картон,
  • пластилин,
  • клей ПВА,
  • семена арбуза,
  • черный фломастер.

Пошаговое описание изготовления ежика из арбузных семечек

Шаг 1. Подготовка заготовки для выполнения ежика

Что нужно сделать на этом этапе:

— Вырезать по шаблону заготовку для ежика из картона желтого цвета.

— Карандашом наметить линию, разделяющую туловище от головы.

— Вырезать кружок из бумаги или картона черного цвета, наклеить на заготовку носик.

Вот что у Вас получится в результате выполнения первого шага.

Шаг 2. Готовим на силуэте ежика слой, к которому будем прикреплять арбузные семечки

Скатать шарик из пластилина черного или темно-серого цвета, растянуть его пальчиками по заготовке в области туловища. Слой не должен быть очень тонким, иначе арбузные семечки не прикрепятся.

Шаг 3. Украшаем ежика колючками из арбузных семечек. Оформляем фигурку ежа.

— Воткнуть семечки в пластилин с наклоном в сторону спины, потому что под таким направлением растут у ёжика иголочки. Начинать их крепление нудно с хвостовой части и так ряд за рядом постепенно дойти до линии, разделяющей туловище от головы.

— Черным фломастером нарисовать глаз и бровь.

Шаг 4. Лепим грибочки для ежика.

Для изготовления грибочков нам нужно:

— скатать из коричневого пластилина небольшие шарики.

— скатать из белого пластилина колбаски.

— соединить шарики с колбасками, слегка приплюснув шарик.

Получим вот такие грибочки.

Шаг 5. Прикрепить грибочки на спинку ежику.

Прикрепить грибочки на спинку ёжика легкими вдавливающими движениями. Ёжик готов!

Примеры детских работы: наши ежики из арбузных семечек

Творческие задания для детей

  • Из каких природных материалов можно сделать иголочки ежику?
  • Чем питаются ежи? Что можно дать нашему ежику? Что бы вы прикрепили ему на спинку?
  • Подумайте, из каких материалов вы сможете сделать подобного ёжика? Что вы прикрепите ему на иголочки? Сделайте ёжика по вашему воображению!

Удачи в творчестве! До новых встреч в рубрике «Своими руками» сайта «Родная тропинка».

Получите НОВЫЙ БЕСПЛАТНЫЙ АУДИОКУРС С ИГРОВЫМ ПРИЛОЖЕНИЕМ

«Развитие речи от 0 до 7 лет: что важно знать и что делать. Шпаргалка для родителей»

Кликните на или на обложку курса ниже для бесплатной подписки


Поделки из зерен, крупы и различных семян своими руками – отличный способ занять детей с пользой, ведь работа с таким натуральным материалом прекрасно тренирует мелкую моторику рук, что способствует улучшению общего и речевого развития. Также такие занятия помогают воспитывать в детках терпение, старание и усидчивость.


Особенности творчества с использованием природных материалов

Поделки из крупы своими руками могут сделать не только школьники, ведь такое совместное творчество подойдет даже для маленьких детей. Правда, с малышами потребуется находиться неотлучно, чтобы они никак себе не навредили.

Итак, в качестве материала вам могут пригодиться:

  • всевозможные виды круп и зерен ‒ гречка, рис, просо, манка;
  • бобовые – горох, чечевица и разноцветная фасоль;
  • любые семена и семечки – арбузные, тыквенные, дыни и подсолнечника и т. д.

Можно взять даже . Также в процессе работе будут нужны: плотная бумага или картон, клей, ножницы, ткань, пластилин, шаблоны различных узоров, украшения (по вашему желанию).

Самые лучшие поделки из крупы, семян и семечек своими руками ‒ это аппликации и картины. Вы можете придумывать сюжеты с ребенком самостоятельно или же использовать какие-то готовые шаблоны и переносить их на бумагу. Сложность работ должна зависеть от возраста детей, учитывайте, что малышу должно быть интересно сделать поделку именно самостоятельно, пусть и с вашей помощью, но не быть совсем в стороне.

Создаем аппликации и картины своими руками

Тема работ может быть какой угодно. Но очень красивыми и оригинальными получаются поделки из зерен и других натуральных материалов на тему весны. Весенние пейзажи (поделки из арбузных семечек и круп), пышные цветы (особенно хорошо получаются цветы из тыквенных семечек – астры, подсолнухи, подснежники) ‒ прекрасные идеи для детского творчества.

Чем больше вы задействуете различных круп, семечек и семян, тем лучше, ведь все они не только разнятся по своим размерам и форме, но еще и по цвету и фактуре. То есть, у вас будет огромное пространство для фантазии и творчества. А если для вашей поделки из зерен нужны какие-то особенные цвета, то вы всегда можете покрасить свои материалы, используя акварельные краски или гуашь.

Попробуйте начать с несложной аппликации. К примеру, в качестве поделки из тыквенных семечек можете сделать корзинку с цветами.

  1. Нарисуйте контуры корзинки на листе плотной бумаги или картона и намажьте их клеем.
  2. Далее выкладывайте по этим контурам тыквенные семечки, чтобы из них получилась объемная корзинка.
  3. Внутри точно таким же образом нарисуйте цветы – это могут быть подсолнухи, астры, маки, ромашки, подснежники или любые другие. Используйте для их создания семечки различных размеров ‒ тыквенные, арбузные, семена подсолнуха.
  4. Серединки цветочков можно сделать из бусинок или засыпать мелкой крупой.
  5. Разрисуйте ваш букет и покрасьте корзинку в коричневый цвет. Можно украсить аппликацию блестками или наклейками, добавить какие-то детали из пластилина.

На тему весны легко сделать и вазу с цветами – точно так же, как и корзинку. Чтобы детские поделки из семечек долго хранились и не осыпались, можете побрызгать их лаком для волос или покрыть прозрачным лаком для ногтей.

Любимым занятием для детей станет создание аппликаций и картин с изображением различных зверюшек, птичек или рыбок. Придумайте вместе с ребенком сюжет и воплотите сказку с помощью поделки из тыквенных или арбузных семечек, а также других всевозможных материалов.

Невероятно милыми получаются рыбки, ежики, пчелки, улитки, уточки, кошки и другие зверюшки. Посмотрите, как легко сделать в качестве поделки из семечек картину с ежиком.

  1. Распечатайте рисунок с изображением ежика или нарисуйте его самостоятельно.
  2. Нанесите ему на спину хороший слой клея и начинайте постепенно прикреплять на него семечки (это могут быть арбузные семечки или семена подсолнуха).
  3. Приклеивать семечки нужно так, чтобы они все были направлены острыми кончиками в одну сторону.
  4. Остальные части тела ежика можно просто раскрасить, а на колючки прикрепить ему грибочки или фрукты, сделанные из пластилина.

А вот какую можно создать интересную картину с павлином с помощью арбузных семечек, а также манной и кукурузной крупы.

  1. Рисуем павлина на плотной бумаге или распечатываем готовый шаблон (подойдут даже обычные раскраски).
  2. Намажьте клеем круглые концы перьев и засыпьте их кукурузной крупой. То же самое проделайте с лапками птички.
  3. Когда она немного подсохнет, отряхните с листа остатки.
  4. Украсьте перья арбузными семечками, плотно приклеивая каждую из них.
  5. Через некоторое время покройте клеем все оставшееся изображение павлина, кроме головки, и засыпьте его манной крупой, расчищая при этом контуры с помощью зубочистки.
  6. Головку можно разрисовать, а картину украсить по своему усмотрению. Как видите, поделки из арбузных семечек делаются очень просто.

Сайт КШИ — Конспект Лепка

Конспект занятия

составлен воспитателем

высшей категории

Буцких Н.И.

Лепка.

Цель: Учить детей делать игрушку-поделку. Вылепливая ежика из пластилина, вдавливая в него семена подсолнуха. Для носа использовать косточки винограда. Закреплять умение выполнять круговые и прямые движения ладоней во время лепки туловища и оттягивания во время лепки мордочки.

Развивать общую и мелкую  моторику рук. Формировать умение работать с различными материалами. (пластилин, семена), повышать познавательную активность.

Воспитывать интерес к работе. Эмоционально положительное отношение к собственной поделке.

Оборудование: Картина.где изображен ежик, образец, пластилин, дощечка, карточки, на которых изображена последовательность лепки, семена подсолнуха, косточки от винограда, лесная поляна (панно приготовленное заранее), сухие тряпочки для рук.

 

Ход занятия

 

Воспитатель: Дети послушайте, я вам загадаю загадку:

 

 Шубка – иголки,

Свернется он – колко,

Рукой не возьмешь,

Кто это? (ежик)

Воспитатель показывает картинку, где изображен ежик и говорит:

                   Я ежик на коротких ножках,

                   В лесу живу, иголки на спине нашу.

(Рассматривает картинку)

Воспитатель: Дети, а вызнаете загадку про ежа?

Дети загадывают:

Под кустом, под елками,

Лежит мешок с иголками.

В клубок свернется

А взять не даётся.

 

Иголки лежали, лежали,

И под стол убежали.

 

Воспитатель: Сегодня мы с вами будем делать ежика. Посмотрите, какого ежика сделала я. Вам нравится мой ежик? Вы хотите такого сделать?

Давайте рассмотрим ежика, которого сделала я.

Вот это что у ежика? (показывает на туловище)
Какая форма у туловища?
А что есть еще у ежа? (мордочка)
А мордочка какая? (вытянутая)
А чем покрыто туловище?
Для чего нужны ежику иголки?
А что есть на мордочке?

Воспитатель: Посмотрите, у вас на столе все есть, чтобы сделать такого ежика?

Ваня перечили, что у тебя есть на столе? Теперь давайте вспомним с чего мы начинаем делать ежика.

Дети отвечают:

                      Сначала лепим туловище.

Воспитатель: Какая форма у туловища?

                  — Чтобы слепить овал, что надо сначала слепить? (шарик)

                  — Когда слепили туловище, что будем делать? (вытягивать мордочку)

                  — Сережа повтори, как ты будешь лепить ежика? (Сережа рассказывает последовательность лепки, а воспитатель на доску ставит карточки, где изображена последовательность лепки ежика)

             Воспитатель: Кристина, а как ты будешь лепить шарик? (круговыми движениями ладоней)

                 — Коля, а как ты будешь лепить овал? ( Из шарика прямыми движениями ладони)

                 — Денис, а как лепить мордочку? (вытягиваем)

                 — Ежика слепили, а теперь, что надо сделать? (воткнуть в туловище семечки, а на мордочке сделать глаза и нос из косточек от винограда)

                 — А теперь, дети, начинаем работать.

                 — Фахрад, с чего начнешь делать?

Дети выполняют поделку.

После окончания спросить у детей:

                  — Какую игрушку вы сегодня делали?

                  — Из чего вы ее делали?

(Ответы детей).

Воспитатель: А сейчас, дети возьмем свою поделку –ежика и пойдем выпустим их в лес на поляну гулять.

Дети берут своих ежиков, воспитатель свою поделку-ежика и несут их на лесную полянку, заранее приготовленную.

(PDF) Моделирование передачи сигналов ежа с помощью механизмов, насыщенных потоком

32

7. Dessaud E, Yang LL, Hill K, Cox B, Ulloa F,

Ribeiro A et al (2007) Интерпретация He

Sonic градиент морфогена с помощью механизма временной адаптации

. Nature

450:717–720

8. Stecca B, Ruiz i Altaba A (2010) Зависимая от контекста

регуляция кода GLI в раке с помощью сигналов Hedgehog и не-Hedgehog.

J Mol Cell Biol 2(2):84–95

9. Jessell TM (2000) Спецификация нейронов спинного мозга: индуктивные сигналы и транскрипционные коды. Nat Rev Genet 1:20–29

10. Guerrero I, Chiang C (2007) Консервативный

механизм формирования градиента ежа путем

модификаций липидов. Trends Cell Biol 17:1–5

11. Vyas N, Goswami D, Manonmani A, Sharma P,

Ranganath H, VijayRaghavan K, Shashidhara L

et al (2008) Наноразмерная организация

Hedgehog необходима для сигнал дальнего действия-

лин.Cell 133:1214–1227

12. Zeng X, Goetz JA, Suber LM, Scott WJ Jr,

Schreiner CM, Robbins DJ (2011) Свободно распространяемая форма Sonic Hedgehog

сигнализация. Nature 411:716–720

13. Greco V, Hannus M, Eaton S (2001)

Аргосомы: потенциальное средство распространения

морфогенов через эпителий. Cell 106:

633–645

14. Panákova D, Sprong H, Marois E, Thiele C,

Eaton S (2005).Nature 435:58–65

15. Callejo A, Culi J, Guerrero I (2008) Patched,

рецептор Hedgehog, представляет собой рецептор липопротеина

. Proc Natl Acad Sci U S A 105:

912–917

16. Gurdon JB, Mitchell A, Mahony D (1995)

Прямая и непрерывная оценка клетками

их положения в градиенте морфогена. Nature

376:520–521

17. Саха К., Шаффер Д.В. (2006) Динамика передачи сигналов в паттернировании тканей Sonic hedgehog.

Development 133:889–900

18. Kornberg TB (2012) Необходимость контекста и контура для дисперсии морфогенов.

Biophys J 103:2252–2256

19. Ramirez-Weber FA, Kornberg TB (1999)

Цитонемы: клеточные отростки, которые проецируются на

основной сигнальный центр в имагинальных дисках дрозофилы. Cell 97:599–607

20. Bilioni A, Sánchez-Hernandez D, Callejo A,

Gradilla AC, Ibáñez C, Mollica E et al (2013)

Balancing Hedgehog, удержание и высвобождение

равновесие Далли, Айхог, Бой и

перешли/DmWif.Dev Biol 376:198–212

21. Callejo A, Bilioni A, Mollica E, Gorfinkiel N,

Andrés G, Ibáñez C et al (2011) Dispatted

опосредует базолатеральное высвобождение Hedgehog с образованием

морфогенетический градиент в эпителии крылового диска

дрозофилы. Proc Natl

Acad Sci USA 108:12591–12598

22. Gradilla AC, González E, Seijo I, Andrés G,

González-Méndez L, Sánchez V et al (2014) Exoneged asge incytosome носитель —

опосредованный транспорт и секреция.Nat

Commun 5:5649

23. Roy S, Hsiung F, Kornberg TB (2011)

Специфичность цитонем дрозофилы для различных

сигнальных путей. Science 15:354–358

24. Sanders TA, Llagostera E, Barna M (2013)

Специализированные филоподии направляют транс-

порт Shh на большие расстояния во время формирования паттерна ткани позвоночных.

Nature 497:628–632

25. Bischoff M, Gradilla AC, Seijo I, Andrés G,

Rodríguez-Navas C, González-Méndez L,

Guerrero I (2013) Цитонемы необходимы для 9003 установление нормального градиента морфогена Hedgehog

в эпителии дрозофилы.Nat

Cell Biol 15:1269–1283

26. Verbeni M, Sánchez O, Mollica E, Siegl-

Cachedernier I, Carleton A, Guerrero I et al

(2013) Морфогенетическое действие ограничено до

3 распространение. Phys Life Rev 10:457–475

27. Zheng X, Mann RK, Sever N, Beachy PA

(2010) Генетическое и биохимическое определение

рецептора Hedgehog. Genes Dev 24:57–71

28. Izzi L, Lévesque M, Morin S, Laniel D, Wilkes

BC, Mille F et al (2011) Boc и Gas1 каждый по

образуют отдельные комплексы рецепторов Shh с

Ptch2 и необходимы для Shh-опосредованной пролиферации клеток

.Dev Cell 20:788–801

29. Yan D, Wu Y, Yang Y, Belenkaya TY, Tang X,

Lin X et al (2010) Белки клеточной поверхности

Dally-подобные и Ihog дифференциально регулируют

Сила сигнала Hedgehog и диапазон во время разработки

. Development 137:2033–2044

30. Cardozo MJ, Sánchez-Arrones L, Sandonis A,

Sánchez-Camacho C, Gestri G, Wilson SW,

Guerrero IP (2014) Bovolenta, Cdon действует как

dgehog рецептор-ловушка во время проксимально-

дистального паттернирования глазного пузырька.Nat

Commun 5:4272

31. Brand AH, Perrimon N (1991) Генерация

специфичных для линии маркеров для изучения развития дрозофилы

. Dev Genet 12:238–252

32. Torroja C, Gornkiel N, Guerrero I (2004)

Patched контролирует градиент Hedgehog с помощью эндоцитоза

в зависимости от динамики,

, но эта интернализация не играет существенной роли.

роль в передаче сигнала.Development

131:2395–2408

33. Tanimoto H, Itoh S, ten Dijke P, Tabata T

(2000) Hedgehog создает градиент активности DPP

в крыловых имагинальных дисках дрозофилы. Mol

Cell 5:59–71

Оскар Санчес и др.

Понижающая регуляция передачи сигналов Hedgehog снижает почечный кистогенный потенциал мышиных моделей

Abstract

Кистозные заболевания почек являются основной причиной почечной недостаточности. Мутации, связанные с почечными кистозными заболеваниями, находятся в генах, кодирующих белки, локализующиеся в первичных ресничках.Эти цистопротеины могут нарушать структуру ресничек или опосредованную ресничками передачу сигналов, хотя молекулярные механизмы, связывающие функцию ресничек с почечным кистогенезом, остаются неясными. Ресничный ген, Thm1(Ttc21b) , негативно регулирует передачу сигналов Hedgehog и чаще всего мутирует при цилиопатиях. Мы сообщаем, что потеря мышиного Thm1 вызывает кистозную болезнь почек с постоянной пролиферацией почечных клеток, повышенными уровнями цАМФ и повышенной экспрессией сигнальных генов Hedgehog.Примечательно, что цАМФ-опосредованный цистогенный потенциал Thm1 нулевых эксплантатов почек был снижен путем генетической делеции Gli2 , основного транскрипционного активатора пути Hedgehog, или путем культивирования с низкомолекулярными ингибиторами Hedgehog. Эти ингибиторы Hedgehog действовали независимо от ингибиторов протеинкиназы A и Wnt. Кроме того, одновременная делеция Gli2 ослабляла почечную кистозную болезнь, связанную с делецией Thm1 . Наконец, транскрипты генов-мишеней Hedgehog увеличивались в кистозных почках двух других ортологичных мутантов мышей, jck и Pkd1 , а ингибиторы Hedgehog снижали цистогенез в культивируемых почках jck и Pkd1 .Таким образом, повышенная активность Hedgehog может играть общую роль в почечном кистогенезе и, таким образом, представляет собой новую терапевтическую мишень.

Кистозная болезнь почек представляет собой широкий спектр заболеваний, характеризующихся заполненными жидкостью кистами, которые разрушают окружающую почечную паренхиму. Спектр поражает взрослых при наиболее распространенном опасном для жизни наследственном заболевании, аутосомно-доминантном поликистозе почек (АДПБП), а также детей в форме аутосомно-рецессивной поликистозной болезни почек (обзор Torres and Harris 1 ).Инфантильная или ювенильная кистозная болезнь почек также проявляется синдромами болезни, вызванными мутацией цилиарных генов, которые в совокупности называются цилиопатиями. К ним относятся нефронофтиз, синдром Барде-Бидля, синдром Меккеля-Грубера, синдром Жене и синдром Жубера. 2 Гены PKD кодируют белки, которые также локализуются в первичных ресничках. 3 В совокупности эти данные привели к предположению, что нарушенная функция ресничек может быть объединяющей этиологической основой кистозной болезни почек.

Первичные реснички выступают из апикальной поверхности эпителиальных клеток почечных канальцев и, как предполагается, функционируют как механосенсоры, изгибаясь в ответ на поток мочи и инициируя сигнальные каскады. 4 Внутрижгутиковый транспорт (IFT), двунаправленный транспорт мультипротеиновых комплексов вдоль ядра на основе микротрубочек ресничек, строит и поддерживает реснички и является неотъемлемой частью передачи сигналов. 5 Антероградная IFT доставляет белки к дистальному концу реснички и опосредована в основном кинезиновым мотором и белками IFT комплекса B, в то время как ретроградная IFT возвращает белки к основанию и опосредована цитоплазматическим динеином-2 мотором и IFT комплексом A белков.

У мышей потеря белков IFT вызывает структурные дефекты ресничек, которые влияют на регуляцию передачи сигналов Hh, 6 путь, фундаментальный для правильного развития и поддержания тканей. 7 Три лиганда Hh млекопитающих — Sonic Hh, Indian Hh и Desert Hh — могут инициировать передачу сигналов при связывании 12-трансмембранного рецептора Patched в ресничке. Будучи связанным, Patched выходит из реснички, обеспечивая цилиарную транслокацию семитрансмембранного преобразователя сигнала Smoothened (SMO). 8,9 Внутри реснички активируется SMO, что завершается активацией транскрипционных факторов полноразмерной глиобластомы (GLI1, GLI2, GLI3). В большинстве тканей GLI2 действует как первичный активатор транскрипции (обзор Eggenschwiler and Anderson 10 ), хотя в некоторых тканях активатор GLI3 (GLI3A) или репрессор GLI3 (GLI3R), который образуется путем расщепления полноразмерного GLI3 белок, играет преобладающую роль из-за избыточности и/или тканевой специфичности белков GLI. 11,12 Тем не менее, баланс между активностью активаторов GLI и репрессора GLI3 определяет уровень передачи сигналов Hh внутри клетки. 10,13

Несмотря на связь между первичными ресничками и передачей сигналов Hh, роль передачи сигналов Hh при кистозной болезни почек широко не изучалась. Тем не менее, несколько исследований, связанных с передачей сигналов Hh при кистозной болезни почек, весьма убедительны. В первом случае у 50% Shh -нулевых эмбрионов мышей сформировалась одна эктопическая диспластическая почка. 14 Во втором случае потеря фактора транскрипции Glis2 , члена подсемейства белков цинковых пальцев типа Круппеля C2h3, которое включает белки GLI, приводила к нефронофтизу у людей и мышей. 15 Профилирование экспрессии Glis2 -/- почек выявило повышенную регуляцию Gli1 , прямой мишени пути, предполагая усиленную передачу сигналов Hh. Наконец, исследование, изучающее влияние чрезмерного воздействия кортикостероидов на развитие метанефроса, показало, что добавление гидрокортизона к культуре органов метанефроса неожиданно вызывает почечные кисты, а также активирует транскрипты Ihh . 16 Добавление ингибитора Hh, циклопамина, уменьшает кисты, индуцированные гидрокортизоном, не влияя на рост органов, что указывает на усиление передачи сигналов Hh в этом механизме цистогенеза.

Мы идентифицировали N -этил- N -производный нитрозомочевины мутант мыши, чужеродный ( aln) , как первый мутант IFT комплекса A млекопитающих. 17 Этот дефект нарушает ретроградное IFT, вызывая накопление белков в луковицеобразных структурах на дистальных концах ресничек и усиление передачи сигналов Hh, опосредованное усиленной транскрипционной активностью активаторов GLI2 и GLI3, что приводит к дефектам формирования паттерна конечностей и нервной трубки.Генетическое поражение в чужеродном приводит к отсутствию Thm1 (TPR-содержащий модулятор Hh 1; также называемый Ttc21b ), ортолога белка комплекса A Chlamydomonas , IFT139. Другой мутант мыши A комплекса IFT, sob /IFT122, также проявляет усиленную передачу сигналов Hh 18 ; это контрастирует с большинством мутантов IFT и ресничек, которые теряют способность отвечать на сигнал Hh (rev. Eggenschwiler and Anderson 10). Дефицит генов мышиного комплекса IFT B, включая гипоморфный аллель Ift88 19 и почечно-специфическое удаление Ift20 или Kif3a, , который кодирует субъединицу кинезина, вызывает почечные кисты. 20–22 Поскольку потеря комплексных белков B приводит к потере ответа Hh, это может частично объяснить, почему передача сигналов Hh не была широко изучена при кистозной болезни почек.

В одном сообщении охарактеризована роль белков IFT комплекса A в почечной функции; почечная делеция Ift140 вызывала почечные кисты. 23 Однако мутации THM1 были обнаружены у 5% пациентов с цилиопатиями, что делает ген THM1 наиболее часто мутировавшим при цилиопатиях 24 и тем самым вовлекает этот ген в почечную болезнь.Мы исследовали последствия делеции Thm1 в почечном цистогенезе, используя мутант развития Thm1 aln/aln и недавно разработанную мышь с условным нокаутом Thm1 . Далее мы изучили прямую роль передачи сигналов Hh у этого и двух других ортологичных мутантов мышей с кистозной болезнью почек, частично путем изучения эффектов ингибиторов Hh на кистогенный потенциал мутантных почек, культивируемых с цАМФ, анализ, предложенный в качестве общей модели кистозной болезни почек. 25 и полезен для проверки эффективности потенциальных фармацевтических методов лечения. 26

Результаты

Потеря THM1 вызывает кисты почек На E16.5 и P0, в последний день, когда выживают мутанты

Thm1 aln/aln , гистологический анализ почек выявил кистозные расширения клубочков и окружающих канальцев (рис. 1А). Коиммуноокрашивание срезов почек на Lotus tetragonolobus лектин (LTL) и Na + K + АТФаза ( α 6F) продемонстрировало, что Thm1 aln/aln Thm1 aln/aln расширения почечных канальцев Хенле (рис. 1B).

Рисунок 1.

Потеря THM1 вызывает почечные кисты. (A) Изображения гематоксилина и эозина E16.5 и P0 wt и почек Thm1 aln/aln . Квадраты с черными точками на панелях первого ряда показаны при большем увеличении, чем на панелях второго ряда. Стрелки указывают на расширенные канальцы Thm1 aln/aln почек. (B) Маркерный анализ сегментов нефрона дикого типа и Thm1 aln/aln . Срезы почек были совместно иммуноокрашены для конъюгированных с флуоресцеином LTL (зеленый) и для Na + K + аденозинтрифосфатазы (красный).(C) Тотальные и гистологические срезы почек 6-недельного дикого типа и Thm1 cko. (D) %KW/BW, (E) уровни BUN и (F) уровни цАМФ в почках 6-недельного дикого животного и Thm1 cko. Столбцы представляют среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 4 мышей дикого типа и 3 мышей Thm1 cko. * Р <0,05.

Поскольку мутанты Thm1 aln/aln умирают вскоре после рождения, мы создали Thm1 мышей с условным нокаутом (cko) для анализа роли THM1 в поддержании целостности почечных канальцев.Повсеместная делеция Thm1 на E17.5 привела к кистозной болезни почек у 6-недельных мышей Thm1 cko (рис. 1C) с повышенным отношением процентной массы почек к массе тела (%KW/BW) и уровнями азота мочевины. (Рисунок 1, D и E). Уровни цАМФ также были выше в кистозных почках Thm1 cko (рис. 1F), аналогично другим моделям мышей, таким как модель cpk с аутосомно-рецессивной PKD и модель Pkd1 с ортологичной ADPKD. Thm1 cko почечные кисты, помеченные положительно на LTL, белок Таммса-Хорсфолла (THP) и агглютинин Dolichus biflorus (DBA), что указывает на то, что кисты происходят из проксимальных канальцев, петель Генле и собирательных трубочек, соответственно (рис. 2, Б-Г).В почках мышей Thm1 cko первичные реснички были заторможены и демонстрировали накопление белка IFT88 в луковицеобразных структурах на дистальных концах (рис. 3, A-C), что характерно для мутантного фенотипа IFT комплекса A. Сканирующая электронная микроскопия показала, что в собирательных трубочках длина первичных ресничек Thm1 cko составляет 60% от длины первичных ресничек дикого типа (wt) (рис. 3D).

Рисунок 2.

Пролиферация повышена в Thm1 cko кистозных почках. (A) Иммуноокрашивание 6-недельных почек дикого типа и Thm1 cko для PCNA отдельно или в сочетании с (B) LTL, (C) THP или (D) DBA.(E) Скорость пролиферации 6-недельных диких животных и почек Thm1 cko. Количество клеток PCNA + делили на количество клеток DAPI для конкретного канальца. (F) Иммуноокрашивание почек P15 wt и Thm1 cko для PCNA отдельно или в комбинации с (G) LTL, (H) THP или (I) DBA. (J) Скорость пролиферации почек P15 wt и Thm1 cko. Все линейки масштаба представляют 500 μ м. n = 3 мас.; n =3 Thm1 cko для каждого момента времени.

Рисунок 3.

Thm1 cko почечные первичные реснички демонстрируют мутантный фенотип комплекса A IFT. (A) Иммуноокрашивание первичных ресничек почек дикого типа и Thm1 cko на ацетилированный α -тубулин (красный) и IFT88 (зеленый). Масштабная линейка соответствует 25 μ м. (B) Сканирующие электронные микрофотографии собирательных трубочек дикого типа и Thm1 cko (исходное увеличение, × 2000). Масштабная линейка соответствует 15 μ м. (C) Сканирующие электронные микрофотографии первичных ресничек дикого типа и Thm1 cko собирательных трубочек (исходное увеличение, ×15 000).Масштабная линейка соответствует 3 μ м. (D) Длина дикого типа и Thm1 cko собирательных трубочек первичных ресничек. Столбцы представляют среднее значение ± стандартная ошибка среднего для n = 23 ресничек от трех мышей дикого типа и n = 25 ресничек от двух мышей Thm1 cko. * P <5×10 −8 .

Клеточный признак поликистозной болезни — повышенная пролиферация эпителиальных клеток, выстилающих кисты. Используя иммуноокрашивание пролиферирующего клеточного ядерного антигена (PCNA) для оценки пролиферации, мы наблюдали заметно более высокие уровни клеток PCNA + в кистозных почках Thm1 cko (рис. 2А).Аналогичный процент клеток PCNA + наблюдался в Thm1 cko LTL, THP и кортикальных DBA-меченых канальцах (рис. 2, B-E), что свидетельствует о том, что повышенная пролиферация не коррелирует со специфическими почечными канальцами.

Чтобы определить, когда начинается кистозная болезнь почек, мы исследовали почки Thm1 cko в более ранние моменты времени и обнаружили, что к P15 присутствовали дилатации проксимальных канальцев и петель Генле в корковом веществе (рис. 2, G и H, дополнительный рисунок). 1).Поскольку пролиферация была предложена в качестве инициирующего фактора почечного кистогенеза, мы иммуноокрашивали почки P15 и P20 для PCNA. На P15 процент клеток PCNA + был одинаковым между почками wt и Thm1 cko (рис. 2J). От P15 до P20 количество клеток PCNA + было заметно уменьшено в мозговом веществе почек дикого типа, но не в мозговом веществе Thm1 cko (дополнительная фигура 2). Эти данные свидетельствуют о том, что цилиарный дефект может задерживать созревание почки, продлевая почку в развивающемся состоянии.

Предполагается, что состояние развития почки играет важную роль в предрасположенности к кистогенезу, поскольку потеря цистопротеинов до P12–P14 приводит к тяжелой кистозной болезни почек, тогда как потеря цистопротеинов после этого окна вызывает очень легкую кистозную болезнь почек, очевидную только через 6 месяцев. 27,28 Чтобы определить, влияет ли потеря THM1 на состояние развития, мы удалили Thm1 в возрасте 5 недель. Как и во всех других зарегистрированных цистопротеинах, делеция Thm1 на зрелой стадии не приводила к кистам через 3 месяца (дополнительная фигура 3).

Генетическое и фармакологическое ингибирование передачи сигналов Hh снижает почечный цистогенный потенциал

Thm1 aln/aln Культивированные почки

отражая повышенную активность GLI2. 17 В соответствии с этим делеция Gli2 у эмбрионов Thm1 aln/aln обращает эффект мутации aln в пластинке дна, подтверждая, что THM1 является негативным регулятором передачи сигналов Hh.Мы задались вопросом, может ли дефицит Gli2 аналогичным образом спасти фенотип почек Thm1 aln/aln , и исследовали генетическое взаимодействие Thm1, Gli2 с использованием анализа культуры почек эмбриона. 25 E13.5 wt, Thm1 aln/aln и Thm1 aln/aln ,Gli2 -/- почки культивировали в присутствии цистогенного реагента дней. Thm1 aln/aln почки показали в 3 раза больший цистогенный потенциал, чем дикий дикий тип (рис. 4A), что согласуется с ролью потери THM1 в почечном цистогенезе.Важно отметить, что Thm1 aln/aln ,Gli2 -/- почки показали в 2 раза более низкий цистогенный потенциал, чем Thm1 aln/aln почки, предполагая, что повышенная активность GLI2 опосредуется почечный кистогенез.

Рисунок 4.

Генетическое или фармакологическое ингибирование передачи сигналов Hh снижает кистогенез в эксплантатах почек Thm1 aln/aln и почках Thm1 cko. (A) E13.5 wt, Thm1 aln/aln и Thm1 aln/aln , Gli2 -/- почки инкубировали со 100 мкл 2 мкМ 4 бромо-сАМФ 9024-4. дней.Количественная оценка изображений почек показала в 3 раза больший цистогенный потенциал в почках Thm1 aln/aln , чем у диких животных, и снижение цистогенного потенциала в 2 раза у Thm1 aln/aln , Gli2 -/- почек относительно Thm1 aln/aln почек. Столбцы представляют среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 4 wt, 6 Thm1 aln/aln и 8 Thm1 aln/aln , Gli2 -/- почек из двух экспериментов.(B) E13.5 wt и Thm1 aln/aln почки культивировали в присутствии 100 мк М 8-бром-цАМФ в комбинации с 10 мк М Gant61, 5 мк М Sant2, или контроль ДМСО в течение 4 дней. Графики представляют собой количественную оценку изображений почек после 4-дневного культивирования. Gant61 или Sant2 снижают цистогенный потенциал как нормальных, так и и почек. Столбцы представляют среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 11 контрольных и 7 Thm1 aln/aln почек из 3 экспериментов для Gant61 и 9 контрольных и 3 Thm1 aln/aln почек из 3 экспериментов для Sant2.(C) Окрашивание гематоксилином и эозином срезов почек 6-недельного дикого типа, Thm1 cko и Thm1 ; Gli2 двойные мыши cko. (D) кратность KW/BW у мышей 24 wt, 11 Thm1 cko и 7 Thm1; Gli2 двойных cko мышей. (E) BUN 8 мышей wt, 6 Thm1 cko и 3 Thm1; Gli2 двойных мышей cko. * Р <0,05; ** Р <0,005; *** Р <0,0005.

Чтобы определить вклад белков GLI2 и GLI3 в почечный цистогенез Thm1 aln/aln , мы проанализировали белковые экстракты E13.5 Thm1 aln/aln культивированные почки и E18.5 Thm1 aln/aln почки для GLI1, GLI2 и GLI3. Однако исследование этих экстрактов целых почек не показало очевидных различий в уровнях GLI между почками дикого типа и Thm1 aln / aln (дополнительная фигура 4).

Чтобы фармакологически воспроизвести генетическое взаимодействие Thm1, Gli2 , мы оценили эффекты низкомолекулярного антагониста GLI, Gant61, на почки дикого типа и Thm1 aln/aln , культивированные в присутствии 8-Br-цАМФ.В концентрации 10 мк М Gant61 предотвращал расширение канальцев в культивируемых почках Thm1 aln/aln (рис. 4В). Чтобы дополнительно изучить роль передачи сигналов Hh в почечном кистогенезе, мы также исследовали эффект низкомолекулярных антагонистов SMO, Sant2. Подобно Gant61, 5 мк M Sant2 предотвращал образование кист в мутантных почках, культивируемых с 8-Br-цАМФ (фиг. 4B). Т.о., ингибиторы Hh, действующие на двух разных стадиях сигнального пути, могут противодействовать эффектам цАМФ и предотвращать образование кист.

Чтобы оценить функциональную роль GLI2 в почечном кистогенезе in vivo , мы удалили Thm1 и Gli2 одновременно на E17.5. В 6-недельном возрасте Thm1; У мышей Gli2 с двойным cko наблюдалась кистозная болезнь почек в более легкой форме, чем у мышей Thm1 cko (рис. 4C), со сниженным соотношением KW/BW (рис. 4D) и уровнями мочевины (рис. 4E), что подтверждает роль повышенной активности GLI2 у Thm1. cko почечный кистогенез in vivo .

Низкомолекулярные ингибиторы Hh не действуют через передачу сигналов протеинкиназы A или Wnt для снижения цистогенного потенциала

Роль пути Hh в передаче сигналов цАМФ, ведущей к образованию кист, неизвестна.Уровни цАМФ повышены в почках, пораженных ПКП, 29–31 , что приводит к активации протеинкиназы А (ПКА). Это, в свою очередь, фосфорилирует и активирует регулятор трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR), выводя ионы Cl в просвет, что сопровождается секрецией жидкости, основной клеточной аномалией при поликистозной болезни. Соответственно, добавление ингибитора PKA H89 или ингибитора CFTR 172 к почкам, культивируемым с 8-Br-cAMP, прекращало образование кисты. 25 Чтобы определить, был ли эффект ингибиторов Hh опосредован этим путем, мы исследовали влияние ингибитора PKA H89 по сравнению с Gant61 и Sant2 на почки CD1 дикого типа, культивируемые в присутствии 8-Br-цАМФ.Мы обнаружили, что ингибиторы Hh предотвращали образование кист в той же степени, что и H89 (рис. 5, A и B). Чтобы изучить влияние ингибиторов Hh на активность PKA, мы проанализировали обработанные почки на уровни белка, связывающего элемент ответа цАМФ (CREB) и фосфо-CREB (P-CREB), мишени PKA. Как и ожидалось, мы обнаружили высокие уровни P-CREB в почках, культивированных с цАМФ, в то время как уровни P-CREB были резко снижены в экстрактах почек, культивированных как с цАМФ, так и с H89. Напротив, уровни P-CREB не снижались в почках, обработанных Gant61 или Sant2 (рис. 5C).Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что, несмотря на снижение образования кист, почки, обработанные Gant61 и Sant2, имеют высокие уровни активности PKA.

Рисунок 5.

Низкомолекулярные ингибиторы Hh действуют независимо от ингибиторов PKA и Wnt, снижая цистогенный потенциал почечных эксплантатов. (A) Почки E13.5 CD1 культивировали в присутствии 100 мк М 8-бром-цАМФ в сочетании с ДМСО, 10 мк М Gant61, 5 мк М Sant2 или 10 мк М ингибитора ПКА Н89 в течение 4 дней.В качестве контроля использовали необработанные контралатеральные почки. (B) Количественная оценка изображений почек после 4-дневного культивирования. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 6 почек на каждую небольшую молекулу. (C) Вестерн-блот для P-CREB, CREB, GLI1, GLI2 и GLI3. Культивированные почки объединяли и гомогенизировали с образованием белковых лизатов. В почках, обработанных H89, наблюдается резкое снижение P-CREB. Напротив, в почках, обработанных Gant61 и Sant2, этого снижения не наблюдается. Почки, обработанные Sant2, демонстрируют снижение GLI1, небольшое снижение GLI2 и повышение GLI3R.В почках, обработанных Gant61, не наблюдается изменения уровней белка GLI. Почки, обработанные H89, демонстрируют небольшое снижение GLI1 и GLI3A. (D) MEF, полученные от мышей E14.5 wt и Thm1 aln/aln/aln , несущих аллель BAT-gal, обрабатывали L- (контрольной) или Wnt3a-кондиционированной средой в течение ночи и анализировали на активность β -галактозидазы. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 3 экспериментов. и MEF демонстрируют повышенный ответ на лиганд Wnt3a. (E) Обработка культивируемых почек Thm1 aln/aln 40 мкМ M IWR-1 не снижает цистогенный потенциал.(F) Количественная оценка изображений почек после 4-дневного культивирования. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n =8 контроль и n =3 Thm1 алн/алн из 2 опытов. * Р <0,05; ** Р <0,005; *** Р <0,0005.

Активность PKA необходима для процессинга полноразмерных белков GLI3 с образованием репрессора GLI3 (GLI3R). 11 Чтобы определить, действуют ли ингибиторы Hh путем повышения уровней GLI3R, мы исследовали уровни белка GLI в обработанных культивируемых почках.В почках, обработанных Sant2, GLI1 был заметно снижен, GLI2 был слегка снижен, а GLI3R повышен (рис. 5C). Эти изменения уровней белка GLI согласуются с подавлением пути Hh на уровне SMO. Увеличенный GLI3R также согласуется с представлением о том, что более высокие уровни активности PKA обеспечивают улучшенный процессинг GLI3. Gant61, который ингибирует на уровне GLI1- и GLI2-опосредованную транскрипционную активность, 32 , не показал изменений в уровнях белка GLI (рис. 5C).Интересно, что уровни активаторов GLI1 и GLI3 были снижены в белковых экстрактах почек, обработанных ингибитором PKA H89 (рис. 5C). Таким образом, в дополнение к тому, что H89 ингибирует молекулу CFTR, ответственную за секрецию жидкости, 25 H89 может также частично ингибировать активность Hh.

В отличие от передачи сигналов Hh, передача сигналов Wnt широко изучалась при кистозной болезни почек с предположением, что сверхактивная каноническая передача сигналов Wnt способствует почечному кистогенезу. 22,33 Нарушение IFT у Kif3a -/- мутантов или в клетках гипоморфного комплекса B IFT88 orpk/orpk мутантов может привести к усилению канонической передачи сигналов Wnt.34 Однако роль ресничек в обеспечении передачи сигналов Wnt остается спорной, т.к. IFT мутантные эмбрионы обнаруживают скорее мутантные фенотипы Hh, чем фенотипы, характерные для неправильно регулируемой передачи сигналов Wnt (rev. Eggenschwiler and Anderson 10). В настоящее время о роли белка IFT-комплекса A в передаче сигналов Wnt не сообщалось, и контрастирующий фенотип Hh Thm1 aln/aln из IFT-комплекса B и мутантов моторной мыши дополнительно вынудил нас исследовать влияние THM1 на каноническая передача сигналов Wnt.Мы создали мышей дикого типа и Thm1 aln/aln , которые несут репортерный аллель Wnt β -катенин-активированный трансген (BAT)-gal, и создали линии мышиных эмбриональных фибробластов (MEF). В присутствии лиганда Wnt3a клетки Thm1 aln/aln MEF показали более высокую активность β -галактозидазы, чем клетки дикого типа (фиг. 5D). Т.о., клетки, лишенные THM1, реагируют на лиганд Wnt сходным образом с клетками, дефицитными по Kif3a и IFT88.

Затем мы исследовали, могут ли низкомолекулярные ингибиторы Wnt снижать почечный цистогенный потенциал.В культивируемых клетках наномолярные количества ингибитора продукции Wnt-2 (IWP-2) и ингибитора реакции Wnt-1 (IWR-1) ингибировали продукцию лиганда Wnt и реакцию Wnt соответственно, в то время как 10 мк М IWR -1 подавляет регенерацию хвостового плавника у рыбок данио, что требует канонической активности Wnt. 35 В нашем первоначальном анализе 10 мк 90 242 М, 20 90 241 мк 90 242 М и 40 90 241 мк 90 242 М IWR-1 или IWP-2 не уменьшали, а скорее увеличивали расширение канальцев в почках CD1, культивируемых с 8 -Br-цАМФ (дополнительная фигура 5).Более того, 40 мк М IWR-1 не снижали цистогенный потенциал культивируемых почек Thm1 aln/aln (рис. 5, E и F).

Маленькая молекула HH ингибиторы снижают почек цистогенный потенциал культивируемого

jck / jck и pkd1 m1bei / m1bei почек

интригативно, ч.х ингибиторы GANT61 и SANT2 предотвращают трубчатые расширения не только в THM1 ALN / ALN ALN / ALN ALN / ALN почках, но и в почках дикого типа (рис. 4B, дополнительная рис. 6 [Sant1]), что свидетельствует об общей роли активности Hh в цистогенезе, индуцированном цАМФ.Поэтому мы задались вопросом, может ли путь Hh участвовать в других моделях кистозной болезни почек. С помощью количественной ОТ-ПЦР мы наблюдали повышенную экспрессию Ptch3, Gli1 , Gli2, и Gli3 в почках 6-недельных мышей Thm1 cko (рис. 6А). Точно так же мы исследовали экспрессию Gli у мутантов jck и Pkd1 . Мутант jck фенотипически напоминает ADPKD 29 и несет мутацию киназы Nek8 . 36 Мутации в гене NEK8 были выявлены у пациентов с нефронофтизом-9 37 и у крыс с поликистозной болезнью Льюиса. 38 В возрасте 7 недель мышей jck/jck показали среднее (±SEM) %KW/BW 4,9±0,33 ( n =11) по сравнению с 1,3±0,04 у мышей дикого типа ( n = 19). Количественная ОТ-ПЦР с использованием лизатов РНК из почек 7-недельных диких животных и jck/jck показала повышенную экспрессию генов-мишеней Hh, Ptch3, Gli1, и Gli3, в кистозных почках jck/jck (рис. 6Б).

Рисунок 6.

Экспрессия сигнальных генов Hh повышена в Thm1 cko, jck и Pkd1 cko кистозных почках. (A) Количественный анализ ОТ-ПЦР с использованием лизатов РНК почек 5 wt и 5 Thm1 cko, (B) почек 5 wt и 5 jck или (C) почек 5 wt и 4 Pkd1 cko. Столбцы представляют среднее значение ± стандартная ошибка среднего для кратности экспрессии Ptch и Gli , нормализованной по отношению к гену домашнего хозяйства Oaz1 , предложенному в качестве одного из наиболее стабильных и надежных контрольных генов для количественной ПЦР. 44 * P <0,05; *** Р <0,0005; **** Р <0,00005.

Используя условный аллель Pkd1, вместе с вездесущей рекомбиназой Cre, индуцируемой тамоксифеном, мы делетировали Pkd1, ортолог наиболее часто мутирующего гена в ADPKD, на P2. На P23 %KW/BW мышей wt ( n = 11) и Pkd1 cko ( n = 4) составляли 1,80 ± 0,21 и 7,60 ± 1,55 соответственно. Количественный анализ ОТ-ПЦР показал повышенную экспрессию Gli1 , Gli2, и Gli3 в почках мутанта Pkd1 (рис. 6C), что свидетельствует об усилении передачи сигналов Hh.

Затем мы исследовали, могут ли ингибиторы Hh снижать цистогенный потенциал культивируемых мутантных почек jck/jck , которые показали повышенное образование кист в анализе почечного эксплантата цАМФ. 26 Точно так же мы наблюдали в 2 и 3 раза более высокие цистогенные потенциалы в культивируемых почках jck/+ и jck/jck по сравнению с дикими животными (рис. 7А). Важно отметить, что этот повышенный кистогенез был заметно снижен при лечении Gant61 или Sant2.

Рисунок 7.

Низкомолекулярные ингибиторы Hh снижают цистогенный потенциал культивируемых почек jck/jck и Pkd1 m1Bei/m1Bei . (A) почки E13.5 jck/jck и (B) E14.5 Pkd1 m1Bei /Pkd1 m1Bei культивировали в присутствии 100 мкМ М 8-бром-цАМФ в комбинации с 10 μ M Gant61, 5 м м или 10 μ M или 10 μ m Sant2 (для JCK / JCK или PKD1 M1BEI / PKD1 M1BEI M1BEI почек, соответственно), или Control DMSO в течение 4 дней.Графики представляют количественную оценку изображений почек после 4-дневного культивирования. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n =3 wt, n =9 jck/+ и n =5 jck/jck почки из 3 экспериментов для Gant61; n =5 wt, n =9 jck/+ и n =8 jck/jck почки из 4 экспериментов для Sant2; N = 6 WT, N = 12 N = 12 PKD1 M1Bei / + , и N = 9 N = 9 PKD1 M1BEI / PKD1 M1BEI от 4 экспериментов для GANT61; N = 7 WT, N = 10 N = 10 PKD1 M1BEI / + и N = 6 N = 6 PKD1 M1BEI / PKD1 M1BEI от 4 экспериментов для Sant2.* Р <0,05; ** Р <0,005; *** Р <0,0005; **** Р <0,00005.

Чтобы определить влияние ингибиторов Hh на культивируемые почки мутанта Pkd1 , мы использовали N -этил- N -нитрозомочевину, полученную из Pkd1 m1Bei/m1Bei , которая несет мутацию missense у мыши. ПКД1 . 39 Аналогично Pkd1 -/- мутанты, Pkd1 m1Bei/m1Bei эмбрионы отечны с дилатацией почечных канальцев и погибают на поздних стадиях развития.В цистогенном анализе цАМФ аллель Pkd1 m1Bei увеличивает цистогенный потенциал. 25 Мы наблюдали в 2 и 3 раза более высокие цистогенные потенциалы в культивируемых почках Pkd1 m1Bei/+ и Pkd1 m1Bei/m1Bei соответственно по сравнению с диким животным (рис. 7B). Как видно из Thm1 aln/aln и jck/jck , обработка Gant61 или Sant2 резко снижала цистогенный потенциал культивируемых почек Pkd1 m1Bei/m1Bei .

Обсуждение

В этом отчете мы демонстрируем роль потери THM1 в почечном кистогенезе. Аллель Thm1 aln увеличивает цистогенный потенциал почек и вызывает расширение почечных канальцев у гомозиготных эмбрионов. Этот почечный фенотип в сочетании с полидактилией и экзэнцефалией мутантов Thm1 aln/aln 17 моделирует клинические испытания синдрома Меккеля-Грубера. 40 Клиническая значимость THM1 подчеркивается открытием, что THM1 вносит вклад в наиболее патогенные аллели у пациентов с младенческой и педиатрической цилиопатией. 24 Кроме того, абляция Thm1 во время позднего эмбриогенеза приводит к кистозной болезни почек во взрослом возрасте, показывая, что потеря THM1 может вызывать формы кистозной болезни почек как у детей, так и у взрослых.

Поскольку THM1 отрицательно регулирует передачу сигналов Hh, 17 мы исследовали роль повышенной передачи сигналов Hh в почечном кистогенезе, которая в значительной степени не изучена. Уменьшение дозировки Gli2 или культивирование с ингибиторами Hh снижало почечный кистогенный потенциал в почках Thm1 aln/aln и удаление Gli2 ослабляло кистозную болезнь почек у мышей Thm1 cko, что указывает на причинную роль 9 H04h в усилении передачи сигнала Thm1 почечный кистогенез.У мышей потеря GLI2 не приводит к почечному фенотипу, но повышенная экспрессия GLI3R в мышиной модели синдрома Паллистера-Холла вызывает необструктивный гидронефроз. 12 Эти данные указывают на избыточность среди активаторов GLI в почках и подчеркивают важную функцию GLI3R в поддержании соответствующих уровней активности Hh. Поскольку GLI2 обычно не играет функциональной роли в развитии почек, ослабление почечного цистогенеза Thm1 за счет потери GLI2 предполагает, что дефект ресничек Thm1 усиливает функцию GLI2 в постнатальной почке.Сходным образом повышенная активность GLI2 является очевидной и является причиной дефектов нервной трубки у мутанта развития Thm1 aln/aln . Повышенная активность GLI3A также способствует дефектам нервной трубки, а вестерн-блоттинг зачатков передних конечностей показал, что потеря THM1 увеличивает уровни GLI3A, не изменяя уровни GLI3R. 17 Такие различия в уровнях белка GLI не были обнаружены в экстрактах целых почек.Вполне возможно, что анализ экстрактов целых почек ослабляет различия в экспрессии, которые могут возникать в зависимости от типа клеток. Наконец, ингибиторы Hh также предотвращают образование кист в культивируемых почках jck и Pkd1 m1Bei , указывая на то, что повышенная передача сигналов Hh может играть общую роль в дилатации почечных канальцев и образовании кист.

Подобно мутантным клеткам IFT комплекса B, клетки Thm1 -null демонстрировали повышенный ответ на лиганд Wnt3a, отражающий усиление канонической передачи сигналов Wnt.Однако низкомолекулярные ингибиторы Wnt не уменьшали количество кист в анализе эксплантата почки. В двух сообщениях предполагается, что сверхактивная каноническая передача сигналов Wnt не способствует почечному кистогенезу у мутантов Pkd1 , Pkd2, и inversin мышей. 41,42 Таким образом, наши данные могут отражать возможность того, что каноническая передача сигналов Wnt не играет роли в опосредованной цАМФ дилатации канальцев. С другой стороны, наши результаты могут свидетельствовать о том, что изучение роли передачи сигналов Wnt в почечном кистогенезе in vivo является более подходящим.Несмотря на это, отсутствие предотвращения почечных кист в этом анализе культуры цАМФ предполагает, что профилактический эффект ингибиторов Hh не проявляется через канонический путь Wnt.

Ингибиторы Hh также не проявляли своих положительных эффектов, ингибируя PKA. Наоборот, ингибитор PKA H89 снижал уровни GLI1 и GLI3A, предполагая, что помимо регуляции CFTR и секреции жидкости, H89 может также частично ингибировать путь Hh. Хотя было показано, что Gant61 ингибирует связывание GLI1 и GLI2 с сайтами ДНК-мишеней 32 и предотвращает локализацию GLI2 на дистальном кончике реснички в клеточных исследованиях (данные не показаны), что необходимо для активации GLI2, 43 Gant61 обработанные почки не изменили уровни белка GLI.Помимо компонентов Hh, которые также являются мишенями пути, анализы ChIP выявили Pax2 и Cyclin D1 как транскрипционные мишени передачи сигналов Hh (N. Rosenblum, личное сообщение). Изучение таких целей поможет в оценке действия Gant61.

Молекулярный механизм, с помощью которого передача сигналов Hh может способствовать почечному кистогенезу, остается неясным. Возможно, что передача сигналов Hh вносит непосредственный вклад в усиление пролиферации эпителиальных клеток, выстилающих кисты.Альтернативно было высказано предположение, что низкие уровни активности Hh в зрелых почках поддерживают клетки почечного эпителия в дифференцированном состоянии. 44 Измененный гомеостаз Ca 2+ является еще одним отличительным признаком PKD, и несколько исследований предполагают, что передача сигналов Hh модулирует уровни Ca 2+ . Было показано, что в клеточной линии рака легкого ингибитор SMO, GDC-0449, увеличивает устойчивые уровни Ca 2+ . 45 Наоборот, SMO может действовать как рецептор, связанный с G-белком, и визуализация Ca 2+ эмбриональных клеток спинного мозга Xenopus показала, что лиганд Sonic HH резко увеличивает пиковую активность Ca 2+ посредством активации SMO. 46 Хотя эти исследования показывают разные эффекты активности Hh на Ca 2+ , возможность взаимодействия между сигналами Hh и Ca 2+ в клетках почек может заслуживать изучения.

Если повышенная передача сигналов Hh играет роль в почечном кистогенезе Thm1 , то молекулярные механизмы должны различаться между Thm1 и мутантами комплекса B, которые не могут полностью активировать путь Hh (rev. Eggenschwiler and Anderson 10).Даже среди мутантов IFT комплекса B у мышей существуют вариации, в которых ветвь Wnt — каноническая или неканоническая — нарушается до возникновения кист и после того, как кисты сформировались. 20,21,33,47–49 Таким образом, несмотря на объединяющую гипотезу первичных ресничек в почечном кистогенезе, между моделями мышей появляются различия в изменении сигнальных путей, которые, вероятно, отражают гетерогенность патогенеза кистозной болезни почек. Это подчеркивает важность лучшего понимания молекулярных механизмов, с помощью которых реснички/IFT опосредуют передачу сигналов Hh и Wnt.

Кистозные почки комплекса A IFT140 cko мыши также показали повышенную экспрессию Gli . 23 Таким образом, данные из пяти модели мыши — IFT140 , IFT140 , 29 , GLIS2 , 15 THM1 , JCK , PKD1- Предлагают повышенную сигнализацию HH в кистовых почках. Кроме того, глобальный анализ экспрессии генов в почках пациентов с ADPKD выявил повышенную экспрессию компонентов передачи сигналов Hh, включая GLI2 , Ptch2 и GAS1 . 50 В то время как дефект ресничек Thm1 и, вероятно, дефект IFT140, напрямую активирует путь Hh, а Glis2 репрессирует передачу сигналов Hh в почках, потребуются дальнейшие исследования, чтобы определить механизм, с помощью которого активируется передача сигналов Hh в мутантных почках jck и Pkd1 .

Таким образом, наши данные показывают роль потери THM1 в почечном кистогенезе и защитную роль для подавления передачи сигналов Hh у мышей Thm1 cko и в культивируемых почках трех независимых генетических мышиных моделей кистозной болезни почек.Это заставляет провести анализ того, снижают ли ингибиторы Hh почечный кистогенез у этих моделей мышей in vivo . Если эти ингибиторы Hh эффективны in vivo , несколько ингибиторов Hh проходят клинические испытания на рак (обзор Tran et al , 51 ), что облегчит перевод этих экспериментов в терапевтическое применение.

Краткое описание

Генерация

Генерация

THM1 и PKD1 и PKD1 Условные выбивки Mice

A THM1 -LACZ Knockout Mouse (TTC21B TM2A (KOMP) WTSI ) была приобретена из KOMP (нокаут-проект мыши).Основные компоненты целевого вектора состояли из гена LacZ , фланкированного сайтами Frt в интроне 3 Thm1 , и сайтов loxP, фланкирующих экзон 4. Мышей Thm1 -lacZ скрещивали с мышами FLPeR (подарок Susan Dymecki, Гарвардская медицинская школа), которые экспрессируют рекомбиназу FLPe. Полученное потомство, экспрессирующее рекомбиназу FLPe, показало вырезание Frt-фланкированного гена lacZ и продолжение транскрипции Thm1 от экзона 3 до экзона 4.Этих мышей Thm1 flox/+ скрещивали для получения мышей Thm1 flox/flox . Мышь ROSA26CreERT , индуцируемая тамоксифеном, была приобретена в The Jackson Laboratory (004847) и скрещена с мышами Thm1 aln/+ для создания Thm1 aln/+ ; ROSA26Cre ERT+ мыши. Мужской Thm1 aln/+ ; Мышей ROSA26Cre ERT+ скрещивали по времени с самками Thm1 flox/flox .Беременным самкам Е17.5 внутрибрюшинно вводили тамоксифен (Sigma) в дозе 9 мг/кг массы тела мыши для образования Thm1 aln/- ; ROSA26Cre ERT/+ (или Thm1 cko) мыши. Альтернативно, 5-недельный дикий зверь и Thm1 aln/- ; Мышам ROSA26Cre ERT/+ внутрибрюшинно вводили тамоксифен для изучения эффектов удаления Thm1 в полностью развитых почках. Мыши

Pkd1 flox/flox были получены от Jackson Laboratories (010671). Pkd1 флокс/флокс самки были скрещены с Pkd1 флокс/+ ; ROSA26-Cre ERT /+ самцов для создания Pkd1 флокс/флокс ; ROSA26-Cre ERT/+ мыши. На P2 кормящим матерям Pkd1 flox/flox вводили 10 мг тамоксифена/кг массы тела мыши, чтобы вызвать делецию Pkd1 у детенышей.

Генотипирование мышей

Биоптаты хвоста (1–2 мм) или желточные мешки использовались для выделения ДНК путем щелочного лизиса.Хвосты кипятили в 50–200 мкл л 50 мМ NaOH в течение 10 минут и кратковременно встряхивали. Добавляли одну десятую объема 1 М Tris-HCl (pH 8,0) с последующим центрифугированием при 14000 об/мин в течение 6 минут. Один микролитр супернатанта использовали для последующего генотипирования. Мышей Thm1 aln/aln генотипировали, как описано в других источниках, 17 с использованием праймеров alndiag-F и alndiag-R с последующим расщеплением ампликона с помощью Ava II. Мышей jck генотипировали с использованием праймеров jck-F и jck-R и последующего расщепления ампликона с помощью BseYI.Мыши Pkd1 m1Bei были генотипированы с использованием анализа Taqman, как описано ранее. Аллель 25 Pkd1 flox был генотипирован с использованием праймеров Pkd1f-F и Pkd1f-R, как описано в лаборатории Джексона. Последовательности праймеров и зондов перечислены в дополнительной таблице 1.

Гистология

Были вскрыты почки и удалены почечные капсулы. Затем почки продольно разрезали пополам и фиксировали в растворе Буэна на несколько дней. Ткань обезвоживали через серию этанола, ксилола (две замены), парафина (две замены), затем заливали в парафин.Срезы размером 7 мк м получали с помощью микротома и окрашивали гематоксилином и эозином.

Измерения мочевины и цАМФ

Собирали кровь из ствола и получали сыворотку с использованием пробирок Microvette CB 300 Blood Collection System (Kent Scientific). Уровень мочевины в сыворотке измеряли с использованием набора для анализа мочевины QuantiChrom (BioAssay Systems) в соответствии с протоколом производителя.

Рассеченные почки делили пополам или на четверти и быстро замораживали. Кусочки почек гомогенизировали в 0.1 М HCl с использованием Bullet Blender Storm (MidSci). Уровни цАМФ определяли из гомогенатов почек с использованием набора для иммунологического анализа ферментов цАМФ, Direct (Sigma-Aldrich) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрации белка в гомогенатах почек получали с использованием анализа белка BCA (Pierce).

Сканирующая электронная микроскопия

Шестинедельные почки вырезали в PBS и фиксировали в 2% глутаральдегиде в 0,1 М буфере какодилата натрия при 4°C. Почки были обезвожены в этаноле, высушены в сушилке критической точки EMS, закреплены на металлических заглушках и покрыты в устройстве для нанесения покрытий методом распыления Pelco SC-6.Первичные реснички почек визуализировали с использованием сканирующего электронного микроскопа Hitachi S-2700, оснащенного цифровой камерой Quartz PCI.

Иммунофлуоресценция

После удаления почечных капсул почки разрезали пополам и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи при 4°C. Ткань обезвоживали серией этанола, ксилола и парафина, а затем заливали в парафин. Срезы размером 7 90 241 мк 90 242 м были получены с помощью микротома. Выделение антигена проводили с использованием цитратно-натриевого буфера (pH 6).Ткань блокировали 1% BSA в PBS в течение 1 часа, затем инкубировали с лектинами, LTL и DBA (1:50; Vector Laboratories) или первичными антителами против α 6F (1:1000; Developmental Studies Hybridoma Bank), Tamms. –Horsfall Protein (1:500; Santa Cruz Biotechnology), PCNA (1:2000; Cell Signaling Technology), ацетилированный α -тубулин (1:4000; Sigma-Aldrich). Срезы трижды промывали PBS, а затем инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с AlexaFluor 488 или AlexaFluor 594.После трех промывок PBS срезы покрывали Vectashield с 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (Vector Laboratories). Окрашивание визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Axiophot и отображали с помощью камеры Leica DFC 350 или флуоресцентного микроскопа Nikon 80i, оснащенного камерой Nikon DS-Fi1.

Количественная оценка скорости пролиферации

Клетки PCNA + и ядра, окрашенные DAPI, подсчитывали вручную с помощью подключаемого модуля Cell Counter программного обеспечения ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Культура образования почек

Почки были рассечены от E13.5 THM1 ALN / ALN ELN / ALN или JCK / JCK Embryos или из E14.5 PKD1 M1BEI / M1BEI Embryos и культурный на 1- μ Вставки с порами мкм в шестилуночный планшет со средой DMEM/F12 (Life Technologies), содержащей пенициллин и стрептомицин. Почки культивировали в присутствии 100 мкл М 8-бром-цАМФ (Sigma-Aldrich), с или без Sant1 (Sigma-Aldrich), Sant2 (Alexis Biochemicals), Gant61 (Alexis Biochemicals), IWR-1 (Sigma-Aldrich). -Aldrich), IWP (Sigma-Aldrich) или H89 (Sigma-Aldrich) на 4 дня.Среды и малые молекулы обновлялись ежедневно. Почки визуализировали с помощью стереоскопа Leica MZ12.5 и камеры DFC500. Изображения были количественно оценены с использованием программного обеспечения ImageJ. Для каждой почки были рассчитаны площади кисты и суммированы, а затем разделены на общую площадь рассматриваемой почки.

Количественная ОТ-ПЦР

РНК экстрагировали с использованием Trizol (Life Technologies) в соответствии с протоколом производителя. Один микрограмм РНК был преобразован в кДНК с использованием супермикса кДНК qScript Quanta Biosciences (VWR International).Количественный ПЦР-анализ проводили с использованием Quanta Biosciences Perfecta qPCR Supermix (VWR International) и системы обнаружения ПЦР в реальном времени Bio-Rad CFX Connect. Праймеры, используемые для обнаружения Ptch2 , Gli1 , Gli2, Gli3, и гена домашнего хозяйства Oaz1 (предложен как один из наиболее стабильных и надежных контрольных генов для количественной ПЦР) 52 , были разработаны с использованием Roche Applied Science RT-qPCR Assay Design Center (http://www.roche-applied-science.com/shop/CategoryDisplay?catalogId=10001&tab=&identifier=Universal+Probe+Library&langId=-1&storeId=15006). Все ампликоны охватывают интрон и были отожжены при 60°С. Последовательности праймеров перечислены в дополнительной таблице 1.

Вестерн-блоттинг

Белковые экстракты получали путем объединения четырех культивируемых почек и их гомогенизации с использованием пассивного лизирующего буфера (Promega), содержащего смесь ингибиторов протеиназ (Pierce). Вестерн-блоты проводили, как описано, 17 с использованием первичных антител против CREB, P-CREB, GLI1 (Cell Signaling Technology), GLI2 (щедрые подарки от Drs.J. Eggenschwiler и B. Wang), GLI3 (R&D Systems) и α-тубулин (DM1A от Sigma-Aldrich). Сигнал регистрировали с использованием фемтохемилюминесцентного субстрата SuperSignal West (Pierce).

Анализы BAT-gal

Thm1 aln/+ гетерозиготных мышей скрещивали с мышами, несущими трансген β -галактозидазы (B6.Cg-Tg[BAT-lacZ]3Picc/J; The Jackson Laboratories; The Jackson Laboratories; 005317). Затем MEF были выделены из E14,5 wt; BAT-lacZ и Thm1 алюминий / ; Эмбрионы BAT-lacZ , затем обрабатывали средой, кондиционированной либо L (контроль), либо средой, кондиционированной Wnt3a, как описано ранее. 34 Активность BAT-gal измеряли с помощью системы Galacto-Light Plus (Applied Biosystems).

Статистический анализ

Статистическая значимость была рассчитана с использованием теста t (Excel; Microsoft, Редмонд, Вашингтон).

Благодарности

Мы благодарим Барбару Фегли из Центра электронной микроскопии Медицинского центра Канзасского университета (KUMC) и Цзин Хуан из Центра гистологии KUMC за их техническую помощь. Мы благодарим сотрудников Beier Lab, Гарвардского центра исследований поликистозных болезней и Института почек KUMC за полезные обсуждения.

Эта работа была поддержана премией за экспериментальный и технико-экономический проект Гарвардского центра исследований ДОК (PI: Jing Zhou), R21DK088048, премией ASN Gottschalk Research Scholar Award, Центром передового опыта в области биомедицинских исследований Национального института здравоохранения (NIH) (P20- GM104936-06, PI: Дейл Абрахамсон) и NIH K-INBRE (P20-GM103418, PI: Джоан Хант) в PVT, постдокторскую стипендию NIH T32 (DK71496-6 A1, PI: Jared Grantham) в DTJ и R01- HD36404 в DRB

  • Copyright © 2014 Американского общества нефрологов

Модель «два ежа», идеально подходящая для маркетинга стартапов на ранних стадиях |

Прежде чем вы начнете, я хотел бы отметить, что в этом посте вы найдете расширенную версию той же модели/концепции.(март 2020 г.).

Одна вещь, которая вас не сдерживает в маркетинге стартапов, — это отсутствие вариантов моделей, фреймворков и мнений о том, на что тратить время. Есть модель AARRR Дейва МакКлюра. Фреймворк Буллсай. Подход «Бросьте спагетти на стену и посмотрите, что прилипнет». Список можно продолжить.

Так зачем этот пост? Если у вас мало данных и времени, как у многих стартапов на ранней стадии, эти модели не помогут вам сосредоточиться на 1-2 вещах, которые могут иметь значение.И так многие слишком тонко распределяются между слишком многими каналами.

Я думаю, что для стартапов на ранней стадии есть более простая модель. (На самом деле это настолько просто, что вы, возможно, уже используете его, и я был последним человеком на Земле, который наткнулся на него.)

Маркетинговая модель «Два ежа» с упором на рекомендации и возможности поиска

Около года назад я выполнил упражнение по созданию портрета клиента для Pipedrive и поговорил примерно с 35 клиентами в течение часа в течение интенсивного двухнедельного периода. (Это то, что я рекомендую сделать любому начинающему маркетологу).Один из немного нестандартных вопросов, которые я задал, был следующим: как вы впервые узнали о Pipedrive? Большинство людей ответили «от друга или коллеги» , а другие сказали, что искали в Интернете к чертям собачьим. Я послушно записала ответы и продолжила работу над своей персоной.

Только через несколько месяцев до меня дошло. То, что я получил от этих хороших людей, было не просто представлением о том, кто является клиентами Pipedrive, но и очень практичной маркетинговой моделью.

Рекомендации друзей и возможность поиска в поиске .По сути, это простая «модель», которая позволила Pipedrive увеличить число платных клиентов от 0 до более чем 10 000 человек. Эта модель работала или будет работать почти во всех стартапах на ранних стадиях, которые я продвигал или у знакомых продавал.

Я назову модель Two Hedgehog Model , снимая шляпу перед Джимом Коллинзом и популяризируемой им «концепцией ежа». (Это тот, где вы делаете только одну вещь, и делаете это очень хорошо.) Здесь вам нужно делать две вещи очень хорошо, поэтому вам понадобится еще одно из этих маленьких животных.Очень креативно, я знаю.

Короче говоря, если вы сосредоточитесь только на двух вещах и сделаете их очень хорошо, т.е. если вы убедитесь, что ваши клиенты рассказывают своим друзьям и что люди находят вас, когда они ищут ключевые слова, относящиеся к вам, вы рассортируете свои маркетинговые приоритеты на ранней стадии стартапа.

Стратегия ежа №1: как заставить людей рекомендовать вас?

Это «легко». Иметь отличный продукт, который сам по себе является наукой и искусством, и я не лучший человек, чтобы писать о создании отличных продуктов.

В контексте маркетинга это означает две вещи. Во-первых, не сосредотачивайтесь на коммуникационной стороне маркетинга, пока не достигнете определенного уровня соответствия продукта рынку. Продукт с блестящей стратегией контент-маркетинга или платным маркетинговым бюджетом, который имеет большую проблему оттока, не улетит далеко. Вам лучше носить свою негламурную шляпу по развитию клиентов, а не кричащую шляпу маркетолога.

И, во-вторых, помимо достижения соответствия продукта рынку, это означает потратить некоторое время на то, чтобы убедиться, что у ваших клиентов есть мотивация и триггеры, чтобы рекомендовать вас.Я бы сказал, что создание простой реферальной программы — хорошая идея после первых нескольких тысяч клиентов/пользователей. Именно тогда мы в Pipedrive добавили его, и программа продолжает оставаться для нас одним из самых эффективных каналов.

Если вы хотите узнать больше, я уже писал о реферальном маркетинге ранее и ReferralSaasquatch опубликовал несколько полезных советов в своем блоге.

Стратегия ежа №2: как вас найти?

Ответ на этот вопрос более тонкий, чем просто покупка рекламы в Google и оптимизация.

Покупка кликов, безусловно, самый простой вариант, но маркетинг с оплатой за клик стал и дорогим, и довольно сложным из-за того, что абсолютно все используют этот канал, от других стартапов до крупных хорошо управляемых компаний и невежественных компаний, которые тратят большие суммы. в AdWords по сомнительным причинам.

Было бы неплохо, если бы ваш сайт занял первое место в Google (или в ближайшем магазине приложений, или в любом другом месте, где выполняется поиск по вашей работе) бесплатно, но это легче сказать, чем сделать.Можно начать ранжироваться по некоторым ключевым словам с более длинным хвостом в первые 6 месяцев, но со свежим брендом и доменом вы вряд ли получите желаемые первые места в поиске «лучше всего, что вы делаете».

Взгляните на поиск целостно, а не только с точки зрения SEO или цены за клик.

Я бы посоветовал не начинать с какого-то одного канала, а начать с исследования ключевых слов, упражнения, которое определяет, что ищут люди, где кроется самый большой потенциал и где самые низкие плоды.Исследование ключевых слов также помогает решить, какой канал (каналы) удвоить.

Предположим, вы продаете веб-сервис «конструктор веб-сайтов». Я не проводил полного исследования ключевых слов, но быстрый поиск показывает, что каждый клик стоит 23 доллара и что для ранжирования по этому ключевому слову вам нужно конкурировать с такими, как Wix, Squarespace и WordPress.com. Я плохо знаю этот район, но уверен, что это будет не прогулка в парке. Прогулка в Парке Юрского периода, может быть.

Но эй, что это за штука там на месте №3? Это обзорный/партнерский сайт, который уже проделал необходимую работу для высокого рейтинга. Хотя вы не можете начать ранжироваться на первой странице Google со своим собственным сайтом, вы можете быть представлены в статьях, сообщениях и сайтах сравнения, которые уже ранжируются.

Чтобы косвенно присутствовать на первой странице Google, вам может потребоваться:

  • заниматься PR/ведением блога
  • Разместите свое приложение на сайте обзора/сравнения/каталога, который может быть бесплатным, но все чаще становится платным
  • Заявите о себе на соответствующих неосновных сайтах социальных сетей, таких как Quora или Angellist
  • Я бы не стал заходить так далеко/низко, чтобы рекомендовать вам добавить комментарий или попросить клиента добавить комментарий о вас на сайтах, которые высоко ранжируются по релевантным для вас терминам.Эта тактика, вероятно, перестала работать во время инаугурации Обамы. (Насколько мне известно, здесь нет прямой причинно-следственной связи, только корреляция.)

В Pipedrive мы хотим присутствовать не только на нашей собственной целевой странице или в рекламе, но практически во всех списках поисковых запросов, имеющих отношение к нам.

Совет от профессионалов: в длинном хвосте много возможностей

Я писал совет выше и подумал: «Чувак, это какой-то серьезный общий совет, мне следует стать консультантом или что-то в этом роде».Дело в том, что попадание в список сайтов, которые уже ранжируются по релевантным для вас ключевым словам, не так уж и ново.

Итак, вот профессиональный совет: вы найдете лучшие возможности, если лучше определить как «клиенты начнут быстрее вас находить», когда вы посмотрите на длинный конец раздела исследования ключевых слов. В примере с  конструктором веб-сайтов это может означать удвоение  многоязычного конструктора веб-сайтов или конструктора веб-сайтов для художников  вместо этого.

Несмотря на то, что объем поиска на несколько порядков ниже для ключевых слов с более длинным хвостом, вы можете быстрее и дешевле получить доступ к большому количеству терминов, что в сумме дает приличный объем трафика.

Как применить модель «Два ёжика»

Используя здравый смысл и здоровый скептицизм, как и все модели.

Эта модель помогает найти фокус в большинстве областей, где определена категория и люди активно ищут решения. Это может сработать, если вы создаете новую категорию. Никто не искал «лучший способ заказать такси», пока не появились Uber и Taxify. (Но, как оказалось, половина рекомендаций модели является ключевым фактором для этих приложений.)

Кроме того, по прошествии первых нескольких лет эта модель может стать слишком упрощенной. Когда вы создали два основных способа, с помощью которых клиенты могут найти вас, вы, вероятно, добились достаточного успеха, чтобы найти третий и четвертый. Затем вы захотите найти дом для обоих ежей в более комплексной маркетинговой стратегии.

Наконец, он не принимает во внимание ваши сильные стороны и возможности. Если у вас есть большой список рассылки или подписчиков в социальных сетях, вы захотите использовать их, даже если они не являются частью модели.

шт. Если вы планируете маркетинг и, среди прочего, хотите обновить свой стек, обратите внимание на Outfunnel, маркетинговую платформу, ориентированную на продажи, над которой я сейчас работаю.

Найдите 2,5 миллиона страниц статей по математике и статистике

О нас
Проект

«Евклид» находится под совместным управлением библиотеки Корнельского университета и издательства Университета Дьюка. Первоначально он был создан, чтобы предоставить платформу для небольших научных издателей журналов по математике и статистике, чтобы они могли экономично перейти от печатных изданий к электронным.Более 20 лет спустя Евклид продолжает поддерживать независимые публикации и стремится противостоять консолидации и коммерциализации научных коммуникаций.

Project Euclid содержит более 100 публикаций со всего мира, в том числе некоторые из наиболее выдающихся в своих областях. Благодаря сочетанию поддержки подписных библиотек и участвующих издателей 80% статей, размещенных в Project Euclid, находятся в открытом доступе.

Кто мы есть


Annals of Mathematics присоединяется к проекту Euclid в 2022 году

Annals of Mathematics , один из ведущих математических журналов мира, теперь размещается на платформе Project Euclid. Annals издается математическим факультетом Принстонского университета в сотрудничестве с Институтом перспективных исследований. Он будет распространяться в партнерстве с издательством Duke University Press.


Project Euclid и SPIE объявляют о партнерстве в области издательских технологий

Project Euclid и SPIE, международное общество оптики и фотоники, объявили сегодня о партнерстве в области издательских технологий для запуска новой платформы Project Euclid в конце 2020 года.Project Euclid, совместно управляемый библиотекой Корнельского университета и издательством Университета Дьюка, представляет собой онлайн-хостинг и агрегатор более 100 научных журналов, серий книг и материалов конференций по математике и статистике. SPIE будет разрабатывать и поддерживать новую платформу Project Euclid в инновационной технологической модели, которая объединяет некоммерческие организации для совместного развития крупной издательской инфраструктуры.

В течение следующего года Project Euclid будет тесно взаимодействовать с библиотекарями, исследователями, издателями и исследовательскими службами, чтобы обеспечить плавную миграцию платформы.

Читать полный пресс-релиз


Бумага с блестками и паста для лепки, а также подарок TCW » Hedgehog Hollow

Привет Пустоши!

Не могу поверить, насколько загружена эта неделя! Тем не менее, сегодняшний день еще более захватывающий, так как у нас есть розыгрыш в нижней части сегодняшнего поста, так что оставайтесь со мной! Прежде всего, у нас есть отличный урок для вас, мы делаем золотую металлическую пасту для моделирования, а также нестандартную блестящую бумагу…

Это все так эффективно, но так просто, давайте посмотрим на урок…

Я очень надеюсь, что вы захотите попробовать, я думаю, что у вас такой большой потенциал, вот список для вас…

Посмотрите на эти снимки блестящей бумаги крупным планом…

Плюс еще одна карта из другого угла…

 

А теперь то, чего вы так долго ждали, наш розыгрыш! TCW очень любезно дал мне призовой пакет, чтобы отпраздновать нашу веху в 10 000, мы не совсем там, но я обещал вам событие в октябре, так что у нас есть (почти) 10 000 подписчиков, я пересек все, что мы сделали в этом месяце!

Должен сказать огромное спасибо за то, что TCW выставила этот замечательный призовой пакет стоимостью 50 долларов! Чтобы войти, используйте виджет ниже, чем больше вы поделитесь, тем больше записей вы получите!

Rafflecopter в подарок

У вас есть одна неделя, чтобы принять участие, победители будут опубликованы в виджете и в нашей прямой трансляции на Facebook, плюс мы добавим страницу победителей, которая появится в верхнем меню, как всегда, у вас есть 48 часов, чтобы получить свой приз или новый победитель(и) будут выбраны.Удачи!

Не забудьте также принять участие в розыгрыше WCMD, нажмите здесь! У нас есть еще много таких замечательных подарков, так что следите за обновлениями!

Удачной штамповки!

 

Родственные

Эффекты нейтрализующего лиганда хэджхог антитела 5E1 в мышиной модели эндометриоза | BMC Research Notes

Материалы и методы

Этика животных

Все животные содержались в виварии Медицинского центра Монаша и содержались на 12-часовом цикле свет/день с доступом к обычному корму и воде ab libitum .Одобрение всех описанных процедур было получено от Комитета по этике животных Медицинского центра Монаш A.

Модель эндометриоза на мышах

Фоновые мыши C57BL/6J в возрасте 8–12 недель подвергались модели эндометриоза на мышах, как опубликовано ранее [18]. Вкратце, мышам-донорам удаляли яичники, а затем им вводили подкожные инъекции β-эстрадиола (1 мкг/мл) на 7–9 дни. Осадок, секретирующий прогестерон, вводили подкожно с 13 по 19 день (500 нг/день) в сочетании с подкожными инъекциями β-эстрадиола с 13 по 15 день (50 нг/мл).На 15-й день была произведена искусственная децидуализация эндометрия путем введения 20 мкл масла в просвет матки. Прогестероновая поддержка была удалена на 19-й день, а через 4 часа менструальноподобный эндометрий был удален из наружного миометрия, измельчен на фрагменты приблизительно 1 мм 3 и введен в овариэктомированную эстроген-праймированную (таблетку, секретирующую β-эстрадиол, 100 нг/день в день). 7–19) реципиенты (примерно 20 фрагментов, 200 мг ткани в 200 мкл PBS). Повреждениям давали развиваться в течение 21 дня (19–40 дней) перед сбором на 40 день.В течение этого 21-дневного периода мышей случайным образом распределяли в одну из двух групп и лечили два раза в неделю либо 250 мкг антитела против SHH 5E1 (n = 15, DSHB), либо контрольного антитела, соответствующего изотипу (n = 18, BioXCell, MOPC -21 IgG1) в 200 мкл стерильного PBS. Введенная доза 5E1 была основана на предыдущих сообщениях, в которых это антитело использовалось для блокирования передачи сигналов hedgehog в моделях опухолей мышей in vivo [19].

Сбор и фиксация очагов поражения

Мышей-реципиентов подвергали эвтаназии с использованием повышающихся концентраций углекислого газа и смещения шейных позвонков.При вскрытии все полости тела фотографировали, регистрировали количество обнаруженных поражений и измеряли их размеры. Поражения осторожно удаляли из органов брюшины и погружали в 4% масс./об. параформальдегида в PBS на ночь при 4°C и подвергали криозащите в 30% масс./об. сахарозе в PBS на ночь при 4°C. Ткани были заморожены в среде с оптимальной температурой резания и сделаны криосрезы толщиной 8 мкм.

Иммунофлуоресцентный анализ

Если не указано иное, все срезы подвергались окрашиванию в соответствии со следующим протоколом.Срезы пермеабилизировали в 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 15 минут, блокировали в блокирующем растворе DAKO в течение 1 часа, а затем окрашивали для активации hedgehog (GLI1 Rabbit monoclonal Thermo MA5-32553 10 мкг/мл), эпителиальные (EpCAM-PE крысиные антимышиные eBioscience 12-5791-81 2 мкг/мл), маркеры пролиферации (Ki67-EF660 крысиные антимышиные eBioscience 50-5698-80 2 мкг/мл) и апоптоза (Caspase 3 Rabbit polyclonal R&D AF835 5 мкг/мл) маркеры для 1 ч при комнатной температуре в 1 % бычьего сывороточного альбумина в PBS. Для неконъюгированных первичных антител срезы инкубировали со вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре (осел против кролика Alexafluor 568 LifeTech A10042, 4 мкг/мл).Ядра контрастно окрашивали 5 мкг/мл Hoescht 33258 в PBS в течение 3 мин. Изображения были сняты на конфокальном микроскопе Olympus FV1200 с использованием объектива 20 × и скорректированы по яркости и контрасту линейным образом с использованием программного обеспечения FIJI [20].

Анализ поражений
Гистологический анализ

Окрашивание гематоксилином и эозином выполняли в соответствии со стандартными протоколами на 15-м предметном стекле каждого поражения (2 среза на предметное стекло × 8 мкм × 15 слайдов = глубина 240 мкм). Площадь поперечного сечения поражения измеряли с помощью FIIJ, используя инструменты контура контура и измерения площади.

Перед анализом эпителиальных маркеров, маркеров пролиферации и апоптоза слайды ослепляли, чтобы уменьшить любую систематическую ошибку во время анализа. Маркеры подсчитывались вручную в FIJI. Общее количество ядер клеток рассчитывали путем подсчета количества ядер с использованием функций «порог», «водораздел» и «анализ частиц». На группу лечения анализировали минимум 6 поражений. Было визуализировано как минимум 3 поля зрения на срез, и для каждого поражения был рассчитан средний процент положительных типов клеток в общей клеточной популяции.Затем результаты были раскрыты, и каждое поражение было нанесено на график как одна точка данных.

Статистический анализ

Размеры групп были определены с использованием программного обеспечения G*Power. Для количества поражений мы приняли наблюдаемый размер эффекта 0,5, альфа 0,05 и мощность 0,8, требуемый общий размер выборки составил 26. Для изменений в характеристиках поражения мы приняли размер эффекта 0,65, альфа 0,05 и мощность 0,8, общий требуемый размер выборки составлял 13.

Все статистические анализы проводились в Graphpad Prism 8.0. Необработанные данные были подвергнуты тесту на нормальность Д’Агостино-Пирсона перед статистическим анализом. Непараметрический анализ проводился, когда один из наборов данных не прошел проверку на нормальность. Все анализы поражений подвергались непарному двустороннему тестированию Манна-Уитни. Значимость принималась там, где P ≤ 0,05, а данные представлялись графически в виде отдельных точек данных и медианы.

Результаты и обсуждение

Расположение и частота поражений

Поражения были обнаружены в различных местах в группе изотипического контроля и анти-SHH (рис.1а). Возникновение поражений, указывающих на эндометриоз, составляло 100 % в группе, получавшей изотипический контроль, и 80 % в группе, получавшей анти-SHH (p = 0,08) (рис. 1b). В соответствии с другими отчетами с использованием этой модели, независимо от лечения, большинство поражений было обнаружено в брыжейке (83% в группе контроля изотипа, 67% в группе 5E1) [18]. Поражения также были обнаружены на стенке тела, на внешней поверхности матки и в пищеварительном тракте (включающем желудок, тонкую кишку, толстую кишку) (рис.1с). После лечения анти-SHH наблюдалось значительное снижение количества поражений на реципиента, обнаруженных в брыжейке, по сравнению с изотипическим контролем (p < 0,01) (рис. 1d). Этого снижения не наблюдалось в других местах, но эти поражения были нечастыми, а набор данных был небольшим (рис. 1d). Учитывая уменьшение количества поражений брыжейки, мы оценили площадь их поражения независимо от других поражений, но обнаружили, что в этой подгруппе не было различий по площади (p = 0,0932, данные не показаны).

Рис. 1

Распространенность эндометриоза и локализация поражения после лечения анти-SHH антителами. a Поражения (пунктирные кружки) были идентифицированы на различных органах в полости тела, включая стенку тела, брыжейку, матку и кишечник. Масштабные линейки 3 мм. b Заболеваемость эндометриозом рассчитывали как процент мышей с обнаруживаемыми поражениями через три недели, изотипический контроль n = 18, анти-SHH n = 15. Данные представлены как среднее ± SEM. c Процент мышей с поражениями в разных местах. d Количество поражений/реципиентов на каждом участке. Изотип v анти-SHH для каждого сайта тестировали с использованием непарного двустороннего теста Манна-Уитни. ***р < 0,001. Розовая линия обозначает медиану

Экспрессия Gli1 как индикатор активации hedgehog.

Gli1 исследовали с помощью иммунного окрашивания для обнаружения активации hedgehog в собранных поражениях. Gli1 был легко обнаружен в мозге мышей, известном месте передачи сигналов hedgehog [21]. В изотипических и анти-SHH очагах на модели эндометриоза был обнаружен очень слабый сигнал или его отсутствие (рис.2а, представитель 3 животных). Это говорит о том, что эндометриоидные поражения не имеют высокого уровня активации хэджхог, обнаруживаемого в некоторых опухолях [5, 22, 23, 24]. Экспрессия GLI1 повышена в эндометрии женщин с эндометриозом по сравнению со здоровым контролем [6] и в эндометриомах яичников [25], но экспрессия в очагах поражения человека в других местах еще предстоит оценить. Наша модель на мышах не касается эндометриом яичников из-за реципиентов, подвергшихся овариэктомии, поэтому мы не можем комментировать, приведет ли расположение яичников к различной экспрессии GLI1.Кроме того, в исследовании на людях использовали поликлональные антитела, тогда как антитела, использованные в наших исследованиях на мышах, были моноклональными (клон JF09-08), что может объяснить расхождения в результатах.

Рис. 2

Экспрессия пути SHH и маркеры клеточной идентичности не изменились при лечении анти-SHH. экспрессия Gli1 (красный) была обнаружена в мозгу мыши, но почти не была обнаружена в очагах поражения в обеих группах. Вставка контроля изотипа IgG1 кролика. b Двойная иммунофлуоресценция для EpCAM (красный) и Ki67 (белый), вставьте изотипический контроль. c Иммунофлуоресценция для каспазы 3 (красный), вставьте изотипический контроль. количественная оценка B + C; EpCAM, Ki67 и каспаза 3, выраженные в процентах от общей клеточной популяции, контроль изотипа (черные кружки) и анти-Shh (белые кружки). Данные проанализированы с помощью непарного двустороннего критерия Манна-Уитни

Характеристики поражения

Возникновение поражения и выживаемость зависят от перекрестных помех между эпителиальными клетками и окружающей стромой [26]. Поражения исследовали на экспрессию маркера эпителиальных клеток EpCAM, маркера пролиферации Ki67 и маркера апоптоза каспазы 3 (фиг.2б и в). Вариабельная экспрессия EpCAM была идентифицирована в группе изотипического контроля. Пятьдесят восемь процентов изотипических поражений (7 из 12) имели обнаруживаемую экспрессию EpCAM в диапазоне от 0,17 до 26% положительных клеток в общей популяции. В группе анти-SHH только 37,5% поражений имели обнаруживаемую экспрессию EpCAM (3 из 8 поражений), только 1 поражение имело обнаруживаемый уровень более 1% положительных результатов в общей клеточной популяции. Несмотря на отсутствие значительного снижения экспрессии EpCAM, наблюдаемая тенденция к снижению согласуется с другим сообщением, в котором ингибитор хэджхог уменьшал пролиферацию эпителиальных клеток эндометрия in vitro [27].

Не было выявлено существенных различий между изотипическим контролем и группами анти-SHH для Ki67 и каспазы 3 (рис. 2b и c), что позволяет предположить, что 5E1 не оказывает прямого влияния на общую пролиферацию или апоптоз эндометриоидных поражений.

Выводы

Различия в активации пути hedgehog были обнаружены у женщин с эндометриозом и на мышиных моделях эндометриоза [6, 7, 28]. Это исследование было направлено на то, чтобы увидеть, будет ли нейтрализующее хэджхог антитело 5E1 предотвращать возникновение и прогрессирование поражения в мышиной модели эндометриоза.Значительно меньше поражений было обнаружено в брыжейке животных, получавших два раза в неделю 5E1. Однако существенных различий в размерах и морфологии образовавшихся поражений не наблюдалось. Эти данные свидетельствуют о том, что передача сигналов hedgehog не является неотъемлемой частью прогрессирования поражения, но может играть роль в выживании менструальных фрагментов в брюшной полости и инициации поражения.

лисьих ёжиков: Винн Годли и макроэкономическое моделирование | Кембриджский журнал экономики

Получить помощь с доступом

Институциональный доступ

Доступ к контенту с ограниченным доступом в Oxford Academic часто предоставляется посредством институциональных подписок и покупок.Если вы являетесь членом учреждения с активной учетной записью, вы можете получить доступ к контенту следующими способами:

Доступ на основе IP

Как правило, доступ предоставляется через институциональную сеть к диапазону IP-адресов. Эта аутентификация происходит автоматически, и невозможно выйти из учетной записи с проверкой подлинности IP.

Войдите через свое учреждение

Выберите этот вариант, чтобы получить удаленный доступ за пределами вашего учреждения.

Технология Shibboleth/Open Athens используется для обеспечения единого входа между веб-сайтом вашего учебного заведения и Oxford Academic.

  1. Щелкните Войти через свое учреждение.
  2. Выберите свое учреждение из предоставленного списка, после чего вы перейдете на веб-сайт вашего учреждения для входа.
  3. Находясь на сайте учреждения, используйте учетные данные, предоставленные вашим учреждением.Не используйте личную учетную запись Oxford Academic.
  4. После успешного входа вы вернетесь в Oxford Academic.

Если вашего учреждения нет в списке или вы не можете войти на веб-сайт своего учреждения, обратитесь к своему библиотекарю или администратору.

Вход с помощью читательского билета

Введите номер своего читательского билета, чтобы войти в систему. Если вы не можете войти в систему, обратитесь к своему библиотекарю.

Члены общества

Многие общества предлагают своим членам доступ к своим журналам с помощью единого входа между веб-сайтом общества и Oxford Academic. Из журнала Oxford Academic:

  1. Щелкните Войти через сайт сообщества.
  2. При посещении сайта общества используйте учетные данные, предоставленные этим обществом. Не используйте личную учетную запись Oxford Academic.
  3. После успешного входа вы вернетесь в Oxford Academic.

Если у вас нет учетной записи сообщества или вы забыли свое имя пользователя или пароль, обратитесь в свое общество.

Некоторые общества используют личные аккаунты Oxford Academic для своих членов.

Личный кабинет

Личную учетную запись можно использовать для получения оповещений по электронной почте, сохранения результатов поиска, покупки контента и активации подписок.

Некоторые общества используют личные учетные записи Oxford Academic для предоставления доступа своим членам.

Институциональная администрация

Для библиотекарей и администраторов ваша личная учетная запись также предоставляет доступ к управлению институциональной учетной записью. Здесь вы найдете параметры для просмотра и активации подписок, управления институциональными настройками и параметрами доступа, доступа к статистике использования и т. д.

Просмотр ваших зарегистрированных учетных записей

Вы можете одновременно войти в свою личную учетную запись и учетную запись своего учреждения.Щелкните значок учетной записи в левом верхнем углу, чтобы просмотреть учетные записи, в которые вы вошли, и получить доступ к функциям управления учетной записью.

Выполнен вход, но нет доступа к содержимому

Oxford Academic предлагает широкий ассортимент продукции. Подписка учреждения может не распространяться на контент, к которому вы пытаетесь получить доступ.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.