Поделки из шишек | КТО?ЧТО?ГДЕ?
Поделки из шишек – простое и модное украшение интерьера. Их могут сделать даже маленькие дети, а результат будет радовать всю семью.
Обычно поделки из шишек делают поздней осенью и зимой, когда материалы созрели и высохли. Их украшают желудями, используют смешанные техники для создания оригинальных фигурок животных или людей. Эти поделки безопасные и экологически чистые. Они впишутся практически в любой интерьер.
Ежик
Для того, чтобы сделать поделку милого – ежика, найдите штук 10 шишек одного размера. Слепите тело из белой глины или пластилина. Нос можно слепить из кусочка черного пластилина, камушка, или просто покрасить акрилом в черный цвет. Глаза делаются из того же материала, или вставляются готовые заготовки, которые продаются в любом магазине для рукодельниц. Ротик лепим из красной глины или пластилина. Теперь прикрепляем шишки на спину. Распределите их равномерно по всей поверхности. Около головы иголки должны быть очень маленькими, поэтому разберите одну деталь на маленькие кусочки и прилепите вокруг головы.
Есть более простой вариант – сделать маленького ежика своими руками из одной шишки. Для этого к ее широкой части прикрепите заранее слепленную голову, или конус из бумаги, на котором фломастером нарисованы глаза, нос, ушки и рот.
Веселые человечки
Эти поделки можно сделать из сосновых шишек. Заранее соберите их и желуди. Желуди просушите, а шишки обработайте теплым столярным клеем, чтобы они не изменили свою форму, когда высохнут. Возьмите будущее тело и переверните его широким концом вверх. Сделайте шею из маленького кусочка пластилина и прикрепите ее в верхней части поделки. А к шее прикрепите перевернутый желудь – он послужит головой вашей игрушке. Можно сделать своими руками волосы. Для этого нарежьте ниток подходящего цвета и при помощи пластилина прилепите их к голове. Чтобы не было видно места прикрепления, наденьте «шапочку» — крышку желудя.
Елки
Одна из самых красивых и простых поделок из шишек своими руками – елка. Можно посмотреть в интернете множество фото с различными вариантами таких елочек, но сам процесс изготовления у них одинаков. Отличаются лишь детали. Возьмите сухие шишки и покройте краской. Особенно выигрышно смотрятся белые и блестящие елочки. Пока сохнет краска, подберите маленький горшочек, или банку, в котором будет стоять ваша елка. Украсьте ее блестками, мишурой, бисером и яркими красками. Можно сделать декупаж, или обмотать горшок нитками. Посыпаем елку «снегом» — для этого покройте заготовку тонким слоем прозрачного клея и посыпьте манкой, блестками, или искусственным снегом. Сделайте игрушки на елку из маленьких бумажных снежинок на ниточках, или бусинок. Залейте горшок гипсом, или заполните пластилином, а сверху установите готовую елку.
Венки и гирлянды
Эти поделки, сделанные своими руками, украсят интерьер дома и увлекут детей, потому что их легко сделать, а результат получается на вид как из магазина. Соберите много шишек разного размера, и приготовьте длинную ивовую ветку. Перед работой желательно проварить ветку в течение часа, чтобы она стала более мягкой. Когда она просохнет, приклейте шишки к боковым веточкам. Чем больше таких веточек, тем красивее будет выглядеть гирлянда, поэтому обратите на это внимание еще на стадии выбора ветки. Для того, чтобы сделать гирлянду ярче, можно покрасить заготовки, или добавить туда мишуры, дождик и украшения. Веночек делается чуть сложнее. Приготовьте основу из ткани в виде бублика с дыркой в центре, края которой будут выходить за пределы основной композиции. Лучше, чтобы края были обиты белыми или цветными кружевами. Аккуратно и плотно приклейте детали по всему периметру. Старайтесь подбирать материалы одного размера. Перехватите верхнюю часть белой лентой, на конце которой завяжите петлю, чтобы повесить венок на дверь.
Мышка
Еще одна поделка из шишек и пластилина. Подготовьте заранее 7 кусочков белого или светло-розового пластилина. Раскатайте один из них длинной тонкой колбаской – это будет мышкин хвост. Еще 4 колбаски – лапки, чуть толще хвоста и намного короче. Лучше делать их одновременно, чтобы размеры не отличались. Еще 2 кусочка должны быть в виде шариков, которые нужно приплющить, а эти лепешки сжать у одного края – это будут ушки. Теперь прикрепляем все детали к телу. Поделка может быть выполнена из еловой или сосновой шишки. Чтобы они лучше держались, придавливаем их стеком. Осталось доделать глазки и носик. Некоторые предпочитают их лепить из черного пластилина. Чтобы игрушка была ярче, сделайте глазки красными, а нос – фиолетовым.
Мышка из шишки и пластилина. Поделка на ёлку новогодняя
Работа над поделкой развивает творческое мышление, содействует развитию мелкой моторики, воспитывает усидчивость и внимание. Мышка, сделанная из шишки, это одна из традиционных тем, предназначенных для детского творчества.
Что понадобится для работы?
Шишки, которые собраны своими руками, могут пригодиться для создания разных поделок. Дети очень любят делать из природного материала различных животных, создавать выдуманных героев, а затем играть получившимися персонажами.
Шишки рекомендуют собирать весной, но при необходимости можно использовать этот материал в любое время года. У процесса сбора и заготовки шишек для поделок есть несколько особенностей. Перед применением собранные шишки очищают от остатков смолы, убирают насекомых, которые могли остаться внутри полостей.
Следует учитывать, что на улице шишки могут быть закрытыми. При попадании в теплое помещение под действием повышенной температуры воздуха и влажности, они начинают раскрываться и менять структуру. Процесс заготовки зависит от того, какой тип шишки необходим для поделки.
Материал можно подготовить одним из способов:
- Если для поделки необходимо использовать закрытую шишку, то ее помещают в емкость со строительным клеем на 30-40 сек. После этого материал высушивают на салфетке и используют для создания поделки.
- Для раскрытия шишки подготавливают кипящую воду. Шишку проваривают на среднем огне в воде около получаса. Затем шишку высушивают на батарее, в микроволновке или на подоконнике.
Мышка из шишки – поделка, которую делают из закрытых или открытых шишек, применяя различные техники.
Для работы необходимы следующие материалы и приспособления:
- плотный картон;
- краски и пластилин;
- ножницы;
- клей;
- кисти;
- нож;
- ватные диски или вата;
- скотч.
Мышка из шишки – поделка, которую часто делают с детьми к Новому году, чтобы повесить игрушку на елку. Мышка – один из любимых мультипликационных и сказочных персонажей у детей, поэтому идей для создания этой игрушки много.
Пример готовой мышки из шишек и пластилина.В случае если игрушку будут вешать на елку, необходимо предусмотреть специальное крепление. В качестве крепления можно использовать ленты или скрепки. Более интересной выглядит поделка, сделанная из разноцветных шишек. Для окрашивания используют специальные составы.
Чем покрасить шишки | Описание способа |
Алкидной эмалью | Для работы понадобится банка с эмалью и проволока. Проволоку закрепляют на верхней части шишки. Шишку держат за проволоку и окунают в банку с эмалью. Шишку аккуратно вынимают, позволяя краске свободно стекать вниз. Шишку подвешивают за проволоку над газетой или клеенкой, оставляют до полного высыхания. |
Гуашью | Шишки расставляют на клеенке. Кистью с гуашью окрашивают края, создавая плотный слой краски. |
Аэрозольной краской | Шишки подвешивают над клеенкой, обрабатывают из аэрозольного баллона со всех сторон. |
Перед тем, как приступить к работе с шишками, необходимо убедиться, что все части высохли. На сушку шишек, окрашенных эмалью, может понадобиться 1-2 дня. Материал, окрашенный гуашью или краской из баллона, высыхает за 3-5 ч.
Новогодняя мышка
Этот вариант подходит для работы с детьми дошкольного возраста.
При создании поделки развиваются следующие качества:
- усидчивость;
- внимание;
- творческое мышление.
Работая с пластилином, ребенок развивает мелкую моторику. Это способствует одновременному развитию навыка говорения.
Для работы понадобится:
- шишка любой формы;
- пластилин;
- доска для лепки;
- набор пластмассовых глаз для небольших игрушек.
Глазки можно сделать из подходящих по размеру пуговиц или вырезать из картона.
Пошаговая инструкция:
- Из белого пластилина лепят большие уши, в центре делают вставки поменьше из оранжевого или розового пластилина.
- Из белого пластилина вылепливают удлиненную мордочку.
- Отделяют от куска белого пластилина 4 равных по размеру кусочка, формируют лапки. Верхние лапки делают длинными, нижние лапки скатывают в виде шариков.
- Шарики устанавливают на подготовленную подставку, на них устанавливают шишку.
- К шишке с обеих сторон прилепляют верхние лапы, мордочку, уши.
- На мордочку приклеивают глаза.
- Из черного пластилина делают нос, из красного пластилина – язык.
- Кусок шпагата прикрепляют сзади в виде хвоста.
Подвесная игрушка
Шишки хорошо подходят для создания подвесной поделки мышки на елку. Для этого понадобятся фетр и лента для крепления.
Пошаговая инструкция:
- Из фетровой ткани вырезают треугольник, его складывают и склеивают в виде конуса. Это заготовка для мордочки будущей мышки.
- Шишку обрабатывают от остатков мусора, устанавливают на одну из сторон горизонтально. Это заготовка тела мышки.
- На конус из фетра с помощью клея ПВА приклеивают глаза-бусины, нос из пластилина. Уши вылепливают из пластилина и аккуратно прикрепляют к фетру.
- Конусообразную голову с помощью клея ПВА приклеивают к телу мышки.
- Хвост формируют из шпагата или нитки серого цвета. Хвост прикрепляют к задней части поделки с помощью клея.
- Красную ленточку прикрепляют к телу мышки. Чтобы она крепко держалась, в одном из сегментов шишки сверлом или шилом проделывают отверстие, через которое пропускают ленту.
Другие варианты игрушек
Из шишек, собранных самостоятельно, получаются разнообразные игрушки на елку. Материал подходит для изготовления элементов новогоднего декора, поделок для игр. С его помощью можно воплотить разнообразные креативные идеи.
С желудем
Мышка из шишки – поделка, для которой можно использовать несколько разных по фактуре материалов. Тактильные ощущения, которые возникают в ходе работы, способствуют развитию левого полушария мозга у детей.
Ребенок учится находить очевидные отличия в структуре материалов. Для работы понадобится шишка небольшого размера, которая устойчиво стоит на основании, и желудь продолговатой формы, из которого получится мордочка мышки.
Пошаговая инструкция:
- Шишку очищают от мусора, подсушивают.
- Пластилиновые лапы в форме приплюснутых овалов прикрепляют к основанию шишки и устанавливают на подставку.
- К верхней части шишки с помощью пластилина прикрепляют желудь.
- На заостренном конце желудя фломастером или маркером черного цвета рисуют нос и усы.
- Глаза формируют из пластилина черного цвета и приклеивают на желудь по обеим сторонам мордочки
- С помощью белого или оранжевого пластилина создают уши, прикрепляют их по обеим сторонам желудя.
- С помощью шпагата или толстых ниток формируют длинный хвост, прикрепляют к задней части шишки на кусок пластилина.
Мышка из шишки – поделка, которую можно украсить лентами, бусинами, сделать бант или украшения из подручных материалов.
Из сосновых шишек
С приближением празднования Нового года в детских садах и школах принято делать поделки своими руками на новогоднюю тему. Шишки – один из самых востребованных материалов для создания новогоднего декора.
Елка из шишек получится в том случае, если материал собран, просушен и правильно подготовлен к работе. Для создания елки понадобится от 50 до 200 шишек разного размера. Для этой поделки не нужно подбирать шишки по форме. Елка может быть разных размеров, это зависит от количества подготовленного материала.
Пошаговая инструкция:
- Из плотного картона вырезают макет будущей елки. Размер макета зависит от количества собранных и подготовленных шишек.
- С помощью клеевого пистолета шишки наклеивают на картонный корпус, прижимая каждый экземпляр к другому экземпляру таким образом, чтобы между ними не возникало просветов.
- Верхний ярус делают из шишек небольшого размера, чтобы сформировать верхушку.
- После сборки елки ожидают высыхания клея, затем подрезают острым ножом выступающие части шишек.
- Елку украшают мелкой мишурой, блестками, приклеивают на верхушку украшение.
- Концы шишек со всех сторон покрывают серебристой или золотистой краской. Лучше всего использовать специальную краску-аэрозоль, предназначенную для детского творчества.
Кроме окрашивания краской, концы шишек можно задекорировать искусственным снегом. Для этого потребуется клей ПВА, кисть и ватные диски. Края шишек покрывают тонким слоем клея ПВА, затем аккуратно распределяют вату, не дожидаясь, пока клей высохнет.
Рождественский венок
Для изготовления рождественского венка понадобятся дополнительные материалы. Венок можно украсить любым доступным способом. Ребенку можно предложить сделать венок небольшого размера или вместе с взрослым поработать над большим декоративным элементом, который можно повесить на стену или дверь.
Материалы для изготовления венка:
- шишки;
- проволока;
- ленты;
- ветки хвои;
- краски и кисти;
- картон;
- клей.
Подготовительным этапом работы является создание конструкции венка, на котором будут располагаться основные элементы.
Его делают из плотного картона, который способен держать форму. Чтобы конструкция была прочной, можно наклеить 2 круга картона друг на друга.
Круг для венка можно сделать из фанеры, пенопласта или проволоки. Кругу придают правильную форму, затем приступают к сборке.
Вторым подготовительным этапом становится обработка шишек. Их очищают от мусора, подсушивают, затем приступают к окраске. Шишки раскладывают на клеенке, окрашивают с помощью аэрозольного баллона.
Для создания новогоднего венка чаще всего выбирают светло-синие оттенки, серебристые или золотистые краски. Если венок будет состоять из нескольких рядов шишек, можно сочетать праздничные классические цвета: красный и зеленый.
Пошаговая инструкция сборки:
- На основу с помощью клея прикрепляют каждую шишку, соблюдая очередность цветов.
- После заполнения круга приступают к украшению: через равные отрезки привязывают атласные ленты. Внутрь шишек вплетают небольшие декоративные нити, прикрепляют снежинки, колокольчики, блестки.
- По центру верхней дуги делают крепление для того чтобы была возможность повесить конструкцию на стену или дверь.
Новогодний венок можно украсить электрической гирляндой.
Гномы
Для создания маленьких гномов понадобятся шишки и небольшие пенопластовые шарики. Колпаки для гномов делают из фетра. Этот материал легок в работе и хорошо держит форму после сборки.
Пошаговая инструкция:
- Шишку устанавливают на основание.
- Пенопластовый шарик приклеивают к верхней части шишки с помощью клея ПВА.
- На шарике ярким маркером или фломастером рисуют глаза, рот, нос.
- Из фетра вырезают треугольник с учетом размеров пенопластового шарика.
- Нитками сшивают из фетровой выкройки колпак.
- Колпак прикрепляют на голову гнома.
- Из фетра или войлока другого цвета вырезают полоску длиной в несколько сантиметров.
- Полоску оборачивают вокруг верхней части шишки, это шарф гнома.
- Из остатков фетра вырезают 2 рукавицы. Их прикрепляют с помощью клея по обеим сторонам шишки.
- Для завершения образа делают из фетра 2 полукруга, приклеивают к основанию шишки, имитируя наличие разноцветных башмаков.
Колпак можно дополнительно украсить бисером, блестками, стразами, сделать из ниток кисточки или помпоны. Чтобы поделка была интересной, гномов расставляют на подставке, из мелких шишек создают декорации, добавляют хвойные ветки и иголки.
Чтобы повесить гномов на елку, достаточно прикрепить к основанию колпака петлю из нитки подходящего цвета.
Гирлянда
Чтобы сделать гирлянду из шишек, необходимо покрасить их золотистой краской из баллона. Основой гирлянды может быть шпагат или толстая нитка, скрученная в несколько раз.
Пошаговая инструкция:
- От мотка ниток отрезают столько материала, сколько понадобится для создания гирлянды.
- Шпагат раскладывают на рабочей поверхности, с помощью дополнительных приспособлений отмечают места, на которых будут крепиться шишки.
- К основанию каждой шишки с помощью клея прикрепляют кусок проволоки или петлю, сделанную из шпагата.
- Шишку с креплением размещают на шпагате через равные промежутки.
- Между шишками располагают дополнительные украшения, в качестве которых могут выступать покрашенные золотистой краской небольшие желуди, вырезанные из фетра звезды, декоративные снежинки из блестящей бумаги, небольшие колокольчики.
- Каждый элемент тщательно укрепляют.
Гирлянду можно повесить на стену, украсить с ее помощью окна, сочетать с электрической гирляндой.
Игрушка на елку
Из шишек можно сделать самые разные фигурки для украшения елки. Если добавить к поделке крепление из красной атласной ленты, то фигурка будет отлично выглядеть на фоне зеленой хвои.
Материалы, которые понадобятся для создания оленя:
- красная атласная лента;
- обрезки фетра или войлока;
- глазки для поделок на клеящей основе;
- красный помпон;
- клей;
- шишки;
- мишура золотистого цвета на проволоке.
Инструкция:
- Из атласной ленты делают крепление для подвешивания шишки на елку, прикрепляют по центру шишки.
- Из мишуры на проволоке формируют оленьи рога, прикрепляют к шишке с помощью клея.
- Из фетра или войлока вырезают 2 уха, приклеивают с помощью клея по обеим сторонам шишки.
- Последовательно приклеивают глаза на клеящейся основе и нос из красного помпона.
Оленя можно сверху украсить блестками, наклеить бусины по разным сторонам туловища.
Снеговик
Для создания снеговика понадобится шишка, окрашенная белой алкидной эмалью или гуашью. Чтобы снеговик получился узнаваемым, шишка должна быть полностью раскрыта. Это создаст иллюзию пушистости.
Пошаговая инструкция:
- Раскрытую, окрашенную в белый цвет шишку устанавливают на основании.
- Из белого картона вырезают круг, приклеивают его к верхней части шишки с помощью клея ПВА.
- На белом картоне синим фломастером рисуют глаза.
- Из куска оранжевого пластилина делают нос в виде морковки, аккуратно приклеивают его к белому картонному кругу по центру.
- Ватные диски разделяют на мелкие кусочки, придают им форму шариков.
- Шарики с помощью клея приклеивают на разные части шишки.
- Из белого пушистого помпона формируют шапку, приклеивают к картону.
Шапку для снеговика можно сделать из красного фетра. Для этого из материала вырезают треугольник, соединяют нитками по форме конуса, прикрепляют на верхнюю часть шишки. Помпон на шапку из фетра делают из ватного диска. Чтобы повесить снеговика на елку, достаточно приклеить к картонной форме петлю из декоративной серебристой нити.
Шишки – природный материал, из которого можно создать множество разнообразных поделок. На елку принято делать подвесные игрушки, такие, как мышки, олени, гномы. Для украшения интерьера делают венки, подсвечники, гирлянды.
Видео о создании мышки из шишки
Как сделать мышку из природных материалов:
Лепка мышки из пластилина
Белые, кремовые или черные мышки – любимые питомцы многих ребят. За пушистыми грызунами интересно ухаживать, наблюдать за повадками, периодически брать в руки. Сегодня поделка
Героиня поселится на столе в детской комнате или же отправится в детский сад. Пусть полюбуется детвора на забавную зверушку.
Читайте далее: как слепить слона из пластилина поэтапно
Для работы следует подготовить:
- коробку с пластилином
- две шишки разного размера
Хорошо, если дома найдется пара кукольных глаз. Пластиковые детали отлично смотрятся на любой поделке.
Мышка из пластилина поэтапно
Для головы выбираем маленькую шишку сосны обыкновенной. Это дерево чаще всего можно встретить в городских парках или частных домах (не считая ели, конечно).
Из желтого или любого другого пластилина лепим крупные уши, нос-конус с черной горошиной на верхушке, круглую или овальную шею, крошечный алый язычок.
фото 2Располагаем детали на сосновой шишке. Мордочку мы решили оформить со стороны основания шишки, хотя можно и наоборот (если чешуи плотно закрыты).
фото 3фото 4Голова мышки готова. Полюбуемся первым результатом. Симпатичный зверек. Правда?
Две или три чешуи на верхушке шишки удалим ножом (ножницами), иначе шея получится слишком длинной. Это некрасиво. Сразу прикрепим голову к туловищу (платью).
фото 5Две тонкие пластилиновые трубочки приплюснем с одного конца и стеком прорежем пальчики.
Как сделать мышке хвост, думаю, расписывать не надо. Чем длиннее и тоньше получится деталь, тем краше зверек.
Лапки мышки предлагаем крепить к пластилиновой шее, хотя можно просунуть верхние концы деталей между чешуями шишки.
Не забываем надежно присоединить хвостик со стороны спинки грызуна.
Поделка из сосновых шишек удалась на славу. Замечательный получился зверек.
Нижние конечности оформлять не будем. Мышка достаточно устойчива. Если же основание шишки выпуклое, тогда придется добавить еще две детали – пластилиновые шарики. Такие лапки точно не дадут героине опрокинуться.
На этом все. Симпатичных вам мышек!
Поделиться ссылкой:
Поделка Мышка из шишки — Kidmade
2016-08-24
Мышка из шишки
У многих в доме живут маленькие пушистые друзья – коты и кошки. И все они без исключения любят, когда с ними играют. У домашних животных есть свои любимые игрушки: мячики, веревочки, бабушкины клубочки, бантики и многое другое. Но самой интересной игрушкой для любого кота является, конечно же, мышка. И если у вашего пушистика еще нет своей мышки, тогда скорее за работу. Сделаем мышку из шишки своими руками.
Приготовим для работы: нераскрывшуюся сосновую шишку, веревку-шпагат, ножницы, клеевой пистолет.
Пошаговая инструкция выполнения работы.
Шаг 1. Берем шишку и на ее верхушке закрепляем конец веревки-шпагата с помощью клеевого пистолета. Внимание! Мы работаем с электроприбором, поэтому заранее позаботьтесь о безопасности. Во-первых, около розетки, куда включен клеевой пистолет, не должно быть воды и легковоспламеняющихся предметов и разного мусора. Во-вторых, перед работой убедитесь, что подставка под пистолет надежно установлена и не мешает вашим движениям. Итак, конец веревки надежно приклеен к верхушке шишки.
Шаг 2. Начинаем постепенно наматывать шпагат на шишку. Наматываем плотно, не оставляем расстояние между слоями шпагата. Вначале веревку постоянно подклеиваем клеевым пистолетом. Это необходимо, чтобы шпагат не соскальзывал с узкого конца шишки и не разматывался.
Шаг 3. Когда острый конец шишки обмотали шпагатом, делаем два мышиных ушка. Для этого наносим каплю клея на шишку и закрепляем на ней небольшую петельку из шпагата. Точно так же на небольшом расстоянии делаем второе ушко. Шпагат при этом не разрезаем, а просто сгибаем.
Шаг 4. Продолжаем плотно наматывать ярусы шпагата на шишку. В самой широкой ее части достаточно будет закреплять шпагат клеевым пистолетом каплями клея в нескольких местах. Ближе к основанию шишки снова переходите к сплошному приклеиванию шпагата. Если этого не сделать, то веревка просто съедет с шишки. Когда шишка полностью будет обмотана шпагатом, считайте, что мышка для вашего котика почти готова. Отмеряем 4-5 см шпагата и отрезаем его ножницами. У нашей мышки замечательный хвостик.
Шаг 5. Если вы захотите использовать мышку в качестве поделки, то можно приклеить глазки и носик. Для этого идеально подойдут бисеринки черного цвета. Нанесите три капли клея на мордочку мышки на месте глаз и носика и приклейте бисеринки. Вот и все. Правда, очень просто. Обрадуйте своего пушистого домочадца.
Назначеные фильтры
Навык
- Воображение
- Координация
- Логика
- Мелкая моторика
- Память
- Пространственное восприятие
- Развитие речи
- Словарный запас
- Фантазия
- Чувство цвета
Способности
- Учебные и творческие
- Умственные и специальные
- Математические
- Конструктивно-технические
- Музыкальные
- Литературные
- Художественно-изобразительные
- Физические
- Уникальные
Галерея картинок
Похожие статьи
Осенняя поделка «Мышка из шишек»
Осенняя поделка «Мышка из шишек»Подготовила педагог
ГАОУ АО ДО РШТ,отдел ЦДНТТ
Старикова В.С.
Вам понадобится:
Еловая шишка и сосновая шишка
Пластилин коричневого, белого,черного или желтого цвета
Глаза мышки можно сделать из пластиковых кукольных глазок (продаются в магазинах для рукоделия), черных бусинок или черного пластилина
Грецкий орех
Шапочки от желудей
Кусочек тонкой проволоки
Розовая бусинка для носика (можно заменить на розовый пластилин)
Пряжа серого цвета
Ножницы
Мастер класс:
Шаг 1. Скатайте из пластилина небольшой шарик, им мы соединим голову и тело нашей мышки.
Шаг 2. Оторвите 2 маленьких кусочка пластилина и скатайте в шарики. Это будут наши крепления для ушек. На шарики приклеиваем шапочки от желудей.
Шаг 3. Возьмите белый пластилин и отщипните 2 маленьких шарика, на них мы прикрепим кукольные глазки. Если у вас нет таких глазок-ничего страшного, замените их пластилином черного и белого цвета.
Шаг 4. Настало время для носика. Возьмите 1 маленький кусочек белого пластилина и розовую бусинку. При помощи пластилина приклейте бусинку к голове мышки.
Шаг 5. Для изготовления лапок нам понадобится сосновая шишка. Возьмем ее в руки и постараемся аккуратно отщипнуть 4 кусочка. Я использовала ножницы.
Шаг 6. Оторвем кусочек пластилина для того, что бы на него крепить лапки мышке.
Шаг 7. Для завершения нашей поделки нам не хватает только хвостика. Возьмем проволоку, кусочек коричневого пластилина и пряжу. Пластилином покрываем проволочку, и сверху на пластилин крепим нашу пряжу. Пряжу нужно слегка накручивать на проволочку.
Шаг 8. На пластилин крепим хвостик к мышке, после прикрепления хвостик можно чуть-чуть закрутить спиралькой.
Наша поделка готова! Ура, у Вас всё получилось!
Идея для изготовления мышки была навеяна просмотром мастер-класса на ютюбе https://www.youtube.com/watch ?v=STEylazmBug&ab_channel=Buket7ruTV
Как сделать мышь из пластилина: пошаговый мастер-класс
Как сделать мышь из пластилина и шишки маленьким малышам? Дети с удовольствием занимаются лепкой из пластилина. Творческий процесс развивает воображение и моторику, восполняет недостаток тактильных и сенсорных ощущений. При работе с пластилином можно использовать дополнительные материалы: шишки, камни, ветки, ракушки.
Что нужно для поделки с ребенком
С такими заданиями легко справляются малыши, если их направляют родители и старшие помощники. Предложите детям создать фигурку малышки мышки из шишки и пластилина. Следуя подробной инструкции мастер-класса вы сможете сделать забавного маленького зверька.
Для занятия понадобится:
- нераскрывшаяся шишка;
- пластилин;
- стека и доска для лепки;
- влажные салфетки.
Мастер-класс: лепим мышку из пластилина и шишки пошагово
Возьмите маленькую сосновую или еловую шишку, с плотно прижатыми чешуйками. При необходимости удалите смоляные выделения.
Сделайте четыре детали в форме капли для лапок зверька.
Скатайте длинный валик с острым концом для хвостика. Сделайте два плоских ушка каплеобразной формы.
Прилепите внутрь каждого уха небольшие розовые детали, такой же формы, что и уши мышки.
Сделайте два белых плоских кружка под глазки. Прилепите поверх бирюзовые или голубые кружки меньшего размера. В центр разместите черные зрачки, а по краям – белые отблески.
Прилепите черный нос на кончик шишки, а глаза с двух сторон мордочки.
Лапки расположите под шишкой, плотно прижав каждую к телу мыши. Выделите пальчики с помощью стеки.
Соедините хвост с туловищем.
Сделайте тонкий жгутик из красного пластилина и оформите улыбку на мордочке.
Прилепите ушки к голове. Угостите зверюшку вкусным сыром.
Маленькая мышка из шишки и пластилина готова!
Какая чудесная малышка мышка у нас получилась! Сделать мышь из пластилина и шишки – совсем несложно. У крошки мышки большие планы на ближайшее время – ей нужно пополнить запасы еды на зиму. Давайте поможем зверьку, а заодно узнаем, чем питается этот маленький грызун.
Пример HTML-страницы Пример HTML-страницыСаламевич, Я. — Мама-мышка сушила шишки : Белорус. нар. скороговорки. [Для дошк. возраста]
Поиск по определенным полям
Чтобы сузить результаты поисковой выдачи, можно уточнить запрос, указав поля, по которым производить поиск. Список полей представлен выше. Например:
author:иванов
Можно искать по нескольким полям одновременно:author:иванов title:исследование
Логически операторы
По умолчанию используется оператор AND.
Оператор AND означает, что документ должен соответствовать всем элементам в группе:
исследование разработка
author:иванов title:разработка
оператор OR означает, что документ должен соответствовать одному из значений в группе:исследование OR разработка
author:иванов OR title:разработка
оператор NOT исключает документы, содержащие данный элемент:исследование NOT разработка
author:иванов NOT title:разработка
Тип поиска
При написании запроса можно указывать способ, по которому фраза будет искаться. Поддерживается четыре метода: поиск с учетом морфологии, без морфологии, поиск префикса, поиск фразы.
По-умолчанию, поиск производится с учетом морфологии.
Для поиска без морфологии, перед словами в фразе достаточно поставить знак «доллар»:
$исследование $развития
Для поиска префикса нужно поставить звездочку после запроса:исследование*
Для поиска фразы нужно заключить запрос в двойные кавычки:«исследование и разработка«
Поиск по синонимам
Для включения в результаты поиска синонимов слова нужно поставить решётку «#» перед словом или перед выражением в скобках.
В применении к одному слову для него будет найдено до трёх синонимов.
В применении к выражению в скобках к каждому слову будет добавлен синоним, если он был найден.
Не сочетается с поиском без морфологии, поиском по префиксу или поиском по фразе.
#исследование
Группировка
Для того, чтобы сгруппировать поисковые фразы нужно использовать скобки. Это позволяет управлять булевой логикой запроса.
Например, нужно составить запрос: найти документы у которых автор Иванов или Петров, и заглавие содержит слова исследование или разработка:
author:(иванов OR петров) title:(исследование OR разработка)
Приблизительный поиск слова
Для приблизительного поиска нужно поставить тильду «~» в конце слова из фразы. Например:
бром~
При поиске будут найдены такие слова, как «бром», «ром», «пром» и т.д.Можно дополнительно указать максимальное количество возможных правок: 0, 1 или 2.4 разработка По умолчанию, уровень равен 1. Допустимые значения — положительное вещественное число.
Поиск в интервале
Для указания интервала, в котором должно находиться значение какого-то поля, следует указать в скобках граничные значения, разделенные оператором TO.
Будет произведена лексикографическая сортировка.
author:[Иванов TO Петров]
Будут возвращены результаты с автором, начиная от Иванова и заканчивая Петровым, Иванов и Петров будут включены в результат.author:{Иванов TO Петров}
Такой запрос вернёт результаты с автором, начиная от Иванова и заканчивая Петровым, но Иванов и Петров не будут включены в результат.Для того, чтобы включить значение в интервал, используйте квадратные скобки. Для исключения значения используйте фигурные скобки.
Поделка из бумажных конусов для мыши — Занятия для детей
Автор: Тереза Джонстон в Поделки животных, Китайский Новый год 2,538 Просмотров
Это очень простая и недорогая поделка для детей. Используйте красочную бумагу для создания маленьких и больших мышей. Используйте бумагу для принтера, чтобы распечатать их, затем либо начертите на плотной бумаге, либо просто используйте цветную бумагу для принтера. Этот бумажный конус для мыши — забавная поделка, которую можно дополнить вашей любимой книгой о мышах, например, «Если вы дадите мышке печенье».Также используйте этих маленьких безшерстных созданий в год Крысы (Мыши) для поделки на китайский Новый год.
Что вам понадобится
Как сделать конус для мыши из бумаги
- Распечатайте шаблон A для печати мыши (печать 2 больших мышей) или шаблон B для печати (печать 1 большой мыши и 1 маленькой мыши) на белой или цветной бумаге для принтера. Если узор напечатан на белой бумаге, вырежьте и обведите его на цветной плотной бумаге.
- Чтобы добавить глазки для мыши, используйте либо глаза Google, либо закрасьте их черным маркером. Для глаз также можно добавить усиление белых дыр, как показано.
- Проделайте отверстия для ушей и хвоста, где показано. Или используйте бумажные ушки, которые есть на распечатках, и приклейте их там, где указано.
- Возьмите примерно 2-дюймовый участок стебля синели для каждого уха, скрутите его, чтобы получилась петля, а затем скрутите концы вместе. Вставьте скрученные концы в пробитое отверстие и загните их на место.Закрепите скрученный конец куском ленты.
- Скрутите бумагу так, чтобы в результате соединения двух плоских сторон образовался конус. Слегка соедините концы внахлест и склейте их скотчем.
- Возьмите последнюю часть стебля синели и сделайте для мыши хвост, закрепив его лентой у основания конуса бумажной мыши.
Вам понравилась эта распечатка для детей? Чтобы получить больше идей, обязательно подпишитесь на нас в Twitter, Facebook и Pinterest
. мышки ремесла 2017-06-27Растворимая генная терапия CX3CL1 улучшает выживаемость колбочек и их функцию на моделях пигментного ретинита на мышах
Значимость
Пигментный ретинит (RP) — это генетически гетерогенное заболевание, которое не требует эффективного лечения.При РПЖ наблюдается дегенерация фоторецепторов колбочек в глазу, что часто приводит к полной слепоте. Причины дегенерации конуса остаются в значительной степени неизвестными. Разработка методов лечения, которые сохраняют колбочки и зрение у пациентов с РПЖ, особенно независимо от мутаций, выиграет от более глубокого понимания лежащих в основе патологических механизмов. Мы исследовали иммунные ответы у мышей RP в период дегенерации колбочек и идентифицировали растворимый CX3CL1 (sCX3CL1) как многообещающую терапию для колбочек.Опосредованная вирусами экспрессия sCX3CL1 увеличивала выживаемость колбочек в различных моделях RP и улучшала зрительную функцию. Эти результаты подтверждают, что вирусная доставка sCX3CL1 является потенциальным средством лечения RP и других заболеваний сетчатки.
Abstract
Пигментный ретинит (ПП) — это заболевание, которое первоначально проявляется как куриная слепота из-за генетических нарушений в палочковидных фоторецепторах сетчатки. Затем палочки умирают, вызывая дисфункцию и гибель фоторецепторов колбочек, типа клеток, которые обеспечивают высокую остроту зрения и цветовое зрение, что в конечном итоге приводит к слепоте.Мы исследовали иммунные ответы на мышиных моделях RP и нашли доказательства активации микроглии в течение периода дегенерации колбочек. Использование аденоассоциированных векторов (AAV), доставка генов, кодирующих регуляторные сигналы микроглии, привела к идентификации растворимого CX3CL1 (sCX3CL1) серотипа 8 AAV (AAV8) в качестве многообещающей терапии дегенерирующих колбочек. Субретинальная инъекция AAV8-sCX3CL1 значительно увеличивала выживаемость колбочек у трех линий мышей RP. Спасение колбочек сопровождалось улучшением зрительной функции.AAV8-sCX3CL1 не влиял на выживаемость палочек, локализацию микроглии или уровни воспалительных цитокинов в сетчатке. Более того, хотя секвенирование РНК микроглии продемонстрировало заметные транскрипционные изменения с AAV8-sCX3CL1, фармакологическое истощение до ~ 99% микроглии не смогло нейтрализовать влияние AAV8-sCX3CL1 на выживаемость колбочек. Эти находки показывают, что AAV8-sCX3CL1 может спасать колбочки во множестве мышиных моделей RP посредством пути, который не требует нормального количества микроглии. Генная терапия sCX3CL1 — многообещающий независимый от мутаций подход для сохранения зрения при РП и потенциально других формах дегенерации сетчатки.
Пигментный ретинит (ПП) — это заболевание глаза, которое проявляется прогрессирующей дегенерацией палочко-колбочковых фоторецепторов, светочувствительных клеток сетчатки (1). Заболевание может возникать в результате мутаций в любом из более чем 80 различных генов и является наиболее распространенной наследственной формой слепоты в мире, поражающей примерно 1 из 4 000 человек (2–4). Одним из предложенных подходов к лечению RP является генная терапия, например, с использованием аденоассоциированных векторов (AAV) для доставки аллеля дикого типа (WT) в дополнение к мутировавшему гену (5, 6).Хотя этот подход оказался успешным в других условиях и даже привел к одобрению генной терапии врожденного амавроза Лебера, связанного с RPE65 (7), его трудно реализовать для большинства пациентов с RP, учитывая значительную гетерогенность генетической поражения и тот факт, что причинная мутация не всегда выявляется (2). Широко применимая генная терапия, не зависящая от генетического поражения, предоставит вариант лечения для большего числа пациентов с RP.В настоящее время не существует какой-либо эффективной терапии RP, и, несмотря на более чем дюжину клинических испытаний, проведенных на сегодняшний день, ни одно не смогло продемонстрировать улучшение зрительной функции (8).
У пациентов с РПН наблюдается первоначальная потеря палочек, фоторецепторов, обеспечивающих зрение при тусклом свете. Клинически это приводит к первому проявлению RP, плохому зрению или его отсутствию в ночное время, которое обычно возникает в период между рождением и подростковым возрастом (1). Дневное зрение при РП остается в основном нормальным в течение десятилетий, но в конечном итоге ухудшается, начиная с того момента, когда большинство стержней умирают.Это происходит из-за дисфункции, а затем гибели фоторецепторов колбочек, которые необходимы для высокой остроты и цветового зрения и являются основным источником заболеваемости при болезни (1). Важно, что в то время как подавляющее большинство генов, участвующих в RP, экспрессируются в палочках, немногие фактически обнаруживают экспрессию в колбочках, подтверждая существование одного или нескольких общих механизмов, с помощью которых различные мутации в палочках запускают неавтономную дегенерацию колбочек (9-11). Мы и другие пытались выяснить эти механизмы с целью разработки методов лечения RP, которые сохраняют зрение колбочек независимо от лежащей в основе мутации (12–16).
Одним из возможных факторов, способствующих неавтономной дегенерации колбочек при RP, который еще предстоит тщательно изучить, является собственная иммунная система организма. Когда они умирают, многие клетки, включая фоторецепторы в RP, высвобождают связанные с повреждениями молекулярные паттерны (DAMP), которые действуют как эндогенные сигналы опасности и провоцируют воспаление (17, 18). Затем DAMP могут стимулировать активность провоспалительных цитокинов или привлекать иммунные клетки, такие как нейтрофилы и Т-клетки, к месту гибели клеток (17).Даже в гомеостатических условиях сетчатка постоянно исследуется микроглией, резидентными макрофагами центральной нервной системы (ЦНС), происходящими из миелоидных предшественников в желточном мешке эмбриона (19, 20). После травмы или воздействия вредных раздражителей микроглия может активироваться, состояние, характеризующееся приобретением амебоидной морфологии, повышением регуляции цитокинов и повышенным фагоцитозом клеточного дебриса (21–23). Примечательно, что активация микроглии также может модулироваться различными регуляторными факторами со стороны ЦНС, что позволяет манипулировать этими клетками как на экспериментальных моделях, так и на людях (24-26).
Здесь мы исследовали участие иммунных ответов во время неавтономной дегенерации колбочек на мышиных моделях RP. Мы нашли доказательства активации микроглии на протяжении всего периода гибели колбочек. Впоследствии мы разработали четыре AAV для доставки генов, нацеленных на микроглию сетчатки. Один из этих генов, растворимый CX3CL1 (sCX3CL1), также называемый фракталкином или нейротактином, значительно увеличивал выживаемость колбочек в трех различных моделях RP на мышах. Спасение колбочек сопровождалось улучшением зрительной функции, подчеркивая потенциал sCX3CL1 как независимого от мутаций лечения RP и других заболеваний сетчатки.
Результаты
Микроглия находится в слое фоторецепторов на протяжении всей дегенерации конуса.
Линии мыши rd1 и rd10 являются обычно используемыми моделями RP (27). Каждый штамм несет разные мутации в палочко-специфической β-субъединице фосфодиэстеразы, причем rd1 демонстрирует более быструю дегенерацию фоторецепторов, чем rd10 (28). Чтобы охарактеризовать иммунную активность во время неавтономной дегенерации колбочек, мы сначала провели ОТ-ПЦР на сетчатках мышей-альбиносов rd1 и пигментированных мышей rd10 , а также мышей-альбиносов CD-1 и пигментированных мышей C57BL / 6 (B6), двух линий. с WT видением.Праймеры были разработаны для анализа РНК компонентов врожденного и адаптивного иммунитета, включая воспалительные цитокины ( Il1a , Il1b , Il6 и Tnf ), комплемент ( C1qa ), нейтрофилы ( Ly6g ). , Т-клетки ( Cd4 и Cd8a ) и микроглия ( Tmem119 и Cd68 ). В каждом штамме были исследованы две различные временные точки, соответствующие началу [20-й постнатальный день (P20) для rd1 и P40 для rd10 ] и пику (P35 для rd1 и P70 для rd10 ) колбочек. вырождение (12, 13).По сравнению с сетчатками CD-1 и B6 соответствующего возраста, сетчатки rd1 и rd10 продемонстрировали значительное повышение регуляции Il1a , Tnf и C1qa в обоих временных точках, а также Il1b в частности. у мышей rd1 (рис.1 A — D ). Повышение регуляции этих факторов также было связано с более высокими уровнями экспрессии Tmem119 , маркера, специфичного для микроглии (29), и Cd68 , маркера лизосомальной активности и активации микроглии (30), но не Ly6g , Cd4 или Cd8a .Поскольку ранее было показано, что активированная микроглия производит и секретирует IL-1A, TNF и C1Q (23), эти данные указывают на возможную провоспалительную роль микроглии во время неавтономной гибели колбочек.
Рис. 1.Экспрессия генов иммунного ответа и локализация микроглии при дегенерации фоторецепторов колбочек. ( A — D ) Уровни экспрессии генов иммунного ответа на всей сетчатке глаза во время начала (P20 и P40) и пика (P35 и P70) дегенерации колбочек в двух моделях мышей RP (альбинос rd1 и пигментированный ). rd10 ) по сравнению с двумя штаммами WT (альбинос CD-1 и пигментированный B6).( E и G ) Поперечные срезы сетчатки мышей RP и WT, изображающие микроглию, меченную Cx3cr1 GFP , во время дегенерации колбочек. (Шкала: 100 мкм.) ( F и H ) Количественная оценка процента общей микроглии сетчатки, находящейся в ONL во время дегенерации колбочек у мышей RP и WT. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего ( n = 4–6 животных на условие). * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0.001; **** P <0,0001 по двустороннему тесту Стьюдента t с поправкой Бонферрони ( A — D ) и двустороннему тесту Стьюдента t ( F и H ). GCL, слой ганглиозных клеток; INL, внутренний ядерный слой; Н.С., не имеет значения.
Палочки у мышей и людей гораздо более многочисленны, чем колбочки, и составляют около 95% фоторецепторов (31, 32). В сетчатке тела палочковидных и колбообразных клеток образуют структуру, называемую внешним ядерным слоем (ONL), которая резко сжимается со смертью палочки при RP до тех пор, пока не останется только один ряд клеток, включающий выжившие колбочки.Патологическая инфильтрация микроглии в ONL была описана во время начальной фазы гибели стержня при RP (33, 34). Однако о том, как ведет себя микроглия в последующий период дегенерации колбочек, известно меньше. Чтобы помочь визуализировать микроглию в сетчатке, животных RP и WT разводили с репортерными мышами Cx3cr1 GFP , у которых микроглия помечена GFP (35). Только ∼10% микроглии сетчатки обычно располагались в ONL в поперечных срезах от CD-1; Cx3cr1 GFP / + и B6; Cx3cr1 GFP / + WT глаза (рис.1 E — H ). Напротив, около 40-50% микроглии сетчатки можно увидеть в ONL у мышей rd1 ; Cx3cr1 GFP / + и rd10 ; Cx3cr1 GFP / + на протяжении всего периода дегенерации колбочек. Таким образом, даже после исчезновения палочек период дегенерации колбочек сопровождался как повышением регуляции цитокинов, так и продолжающейся локализацией микроглии в слое фоторецепторов.
Сверхэкспрессия sCX3CL1 увеличивает выживаемость конусов у мышей RP.
Мы предположили, что на более поздних стадиях RP активированная микроглия может создавать провоспалительную среду, вредную для близлежащих колбочек.Мы также предположили, что сверхэкспрессия факторов, противодействующих активации микроглии, может облегчить это повреждение, способствуя выживанию колбочек. Чтобы проверить эту идею, был выбран ранее охарактеризованный AAV, экспрессирующий GFP под промотором красного опсина человека [AAV серотип 8 (AAV8) -GFP] для маркировки колбочек и помощи в их количественной оценке (36) (рис. 2 A ). Субретинальная доставка AAV8-GFP у новорожденных мышей привела к появлению ярко маркированных колбочек по всей сетчатке, что позволило визуализировать эти клетки у взрослых животных (рис.2 B и SI Приложение , рис. S1). Затем были сконструированы AAV для экспрессии CD200 или CX3CL1, мембраносвязанных белков, которые, как сообщается, подавляют провоспалительную активность через их соответствующие рецепторы на микроглии, рецептор CD200 и рецептор CX3C 1 (CX3CR1) (24–26). Учитывая предполагаемое взаимодействие между микроглией и дегенерирующими колбочками, полноразмерные варианты CD200 (fCD200) и CX3CL1 (fCX3CL1) экспрессировались под специфическим для колбочек промотором красного опсина человека (рис. 2 D ).Поскольку также были описаны растворимые варианты обоих белков (37, 38), были созданы дополнительные AAV для растворимого CD200 (sCD200) и sCX3CL1 с использованием человеческого промотора Best1 для управления экспрессией в пигментном эпителии сетчатки (RPE), клеточном слое, прилегающем к фоторецепторы (39) ( SI Приложение , рис. S2).
Рис. 2.Влияние сверхэкспрессии CD200 и CX3CL1 на выживаемость колбочек. ( A и B ) Схема вектора AAV8-GFP и доставки. ( C ) Плоская сетчатка P50 rd1 , инфицированная в точках P0 – P1 с помощью AAV8-GFP.(Масштаб: 1 мм.) ( D ) Схема векторов CD200 и CX3CL1 AAV. ( E ) Плоские сетчатки P50 rd1 , инфицированные в точках P0 – P1 указанными AAV. (Шкала: 1 мм.) ( F ) Количественная оценка выживаемости колбочек в центральной сетчатке сетчатки P50 rd1 , инфицированных указанными AAV. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего ( n = 7–18 животных на условие). **** P <0,0001 по двустороннему тесту Стьюдента t с поправкой Бонферрони.Н.С., не имеет значения.
Способность четырех AAV (AAV8-fCD200, AAV8-sCD200, AAV8-fCX3CL1 и AAV8-sCX3CL1) продлевать выживаемость колбочек была первоначально протестирована на мышах rd1 , которым вводили инъекции при P0 – P1 и оценивали при P50. . При RP мыши гибель колбочек происходит от центра к периферии, начиная с головки зрительного нерва. Поэтому для оценки выживаемости колбочек во время дегенерации исследовали центральную сетчатку. Используя модуль ImageJ, количество GFP-положительных колбочек в центральной сетчатке может быть надежно определено количественно ( SI, приложение , рис.S3). По сравнению с сетчаткой rd1 , инфицированной только AAV8-GFP (рис.2 C ), не было значительного улучшения выживаемости колбочек при добавлении AAV8-fCD200, AAV8-sCD200 или AAV8-fCX3CL1 (рис.2 E и F ). Напротив, коинфекция AAV8-GFP с AAV8-sCX3CL1 значительно увеличила количество колбочек, остающихся в центральной сетчатке ( P <0,0001), поддерживая потенциальный терапевтический эффект sCX3CL1 при RP.
Выживание конусов с AAV8-sCX3CL1 также исследовали на более старых, более дегенерированных мышах rd1 .На P75 коинфекция AAV8-GFP с AAV8-sCX3CL1 продолжала увеличивать выживаемость колбочек по сравнению с одним AAV8-GFP ( P <0,001) (фиг. 3 A — A ′ ′). Даже на P100, когда центральная сетчатка глаза, инфицированного AAV8-GFP, почти лишилась колбочек, наблюдалась значительно большая выживаемость колбочек с AAV8-sCX3CL1 ( P <0,01) (Рис. 3 B — B ′ ′). Чтобы определить, может ли sCX3CL1 обеспечить общую терапию неавтономной гибели колбочек, AAV8-sCX3CL1 был протестирован на rd10 (рис.3 C — C ′ ′) и Rho — / — (рис.3 D — D ′ ′) мышей. Rho — / — у мышей отсутствует родопсин, ген фотопигмента в палочках, который также является наиболее часто мутируемым геном у людей с аутосомно-доминантным RP (40). Фоторецепторы в штамме Rho — / — дегенерируют медленнее, чем в штамме rd1 или rd10 (41, 42). У мышей rd10 и Rho — / — AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1 снова приводили к большему количеству колбочек в центральной сетчатке по сравнению с одним AAV8-GFP ( P <0.01 для rd10 и P <0,001 для Rho — / — ).
Рис. 3.Влияние AAV8-sCX3CL1 на долгосрочную выживаемость колбочек в моделях мышей RP. ( A — D ′) Плоский монтаж P75 rd1 ( A и A ′), P100 rd1 ( B и B ′), P100 rd10 ( C и C ′) и P150 Rho — / — ( D и D ′) сетчатки, инфицированные на P0 – P1 только AAV8-GFP или AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1.(Шкала: 1 мм.) ( A ′ ′ — D ′ ′) Количественная оценка выживаемости колбочек в центральной сетчатке P75 rd1 ( A ′ ′), P100 rd1 ( B ) ′ ′), P100 rd10 ( C ′ ′) и P150 Rho — / — ( D ′ ′) сетчатки. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 7–9 животных на условие). ** P <0,01; *** P <0,001 по двустороннему тесту Стьюдента t .
AAV8-sCX3CL1 улучшает опосредованную конусами зрительную функцию.
Поскольку сохранение колбочек AAV8-sCX3CL1 наблюдали с помощью гистологических анализов, было возможно, что зрение также было спасено. Электроретинография (ЭРГ), физиологическая мера активности сетчатки в ответ на свет, может использоваться для выявления активности палочек или колбочек. ERG был впервые использован для измерения фотопических ответов b-волн, конус-опосредованного сигнала от внутренней сетчатки, который, как известно, относительно рано снижается при RP как у животных, так и у людей (1, 13). Записи ERG от мышей P40 rd10 не показали различий в фотопических b-волнах между AAV8-GFP-инфицированными и необработанными глазами, как и ожидалось (рис.4 А ). Напротив, у животных, получавших AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1 в одном глазу и AAV8-GFP в другом, можно было наблюдать умеренное, но значительное увеличение фотопических амплитуд b-волн ( P <0,05) (рис. A и B ).
Рис. 4.Влияние AAV8-sCX3CL1 на зрительную функцию, опосредованную конусом. ( A ) Фотопические ответы ERG у мышей P40 rd10 , инфицированных в точке P0 – P1 только AAV8-GFP в одном глазу ( n = 12) или AAV8-GFP в одном глазу и AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1 в контралатеральный глаз ( n = 17).( B ) Репрезентативные фотопические следы ERG от животного P40 rd10 , инфицированного AAV8-GFP в одном глазу (зеленый) и AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1 в контралатеральном глазу (оранжевый). ( C ) Оптомоторная оценка остроты зрения у мышей rd10 в указанном возрасте по сравнению с контрлатеральными неинъектированными глазами после инфицирования AAV8-GFP ( n = 20) или AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1 ( n = 21). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. * P <0.05; ** P <0,01 по двустороннему двустороннему дисперсионному анализу. Н.С., не имеет значения.
Для оценки зрения с помощью поведенческого теста использовался оптомоторный анализ. Этот анализ выявляет двигательную реакцию на смоделированное движение движущихся полос. Изменяя ширину полосы до тех пор, пока животное не перестанет отслеживать стимул, можно вычислить порог пространственной частоты, соответствующий остроте зрения в каждом глазу (43, 44). Мышей помещали в условия яркого света для проверки зрения конуса.У мышей rd10 , инфицированных AAV8-GFP в одном глазу и не получавших лечения в другом, оптомоторные результаты от P45 до P60 показали аналогичное снижение остроты зрения между двумя глазами с течением времени (рис. 4 C ). Однако, когда животные были инфицированы AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1 вместо одного AAV8-GFP, потеря остроты зрения в течение того же интервала замедлялась в обработанном AAV8-sCX3CL1 глазу ( P <0,01).
AAV8-sCX3CL1 не улучшает выживаемость стержней, локализацию микроглии или воспаление сетчатки.
Было показано, что отсутствие передачи сигналов CX3CL1 во время дегенерации палочек у мышей RP снижает выживаемость палочек, уменьшает количество микроглии в ONL и повышает уровни TNF и IL-1B в сетчатке (33, 45). Таким образом, мы исследовали влияние AAV8-sCX3CL1 на эти фенотипы, чтобы раскрыть возможные механизмы, с помощью которых генная терапия sCX3CL1 может способствовать выживанию колбочек. Палочки обычно составляют около 95% клеток в ONL и, как полагают, поддерживают выживание колбочек несколькими путями, такими как секреция трофических факторов и поддержание нормоксической среды (15, 31, 46).Чтобы изучить, как лечение sCX3CL1 повлияло на стержни, была измерена толщина ONL в сетчатке с RP. В сетчатках P20 rd1 и P40 rd10 , инфицированных AAV8-GFP, только один-два ряда ядер остались в ONL (рис. 5 A ), что соответствует почти завершению гибели палочек в начале дегенерации колбочек. (12, 13). По сравнению с этими сетчатками, коинфекция с AAV8-sCX3CL1 существенно не изменила толщину ONL (рис. 5 A и B ). Это наблюдение продемонстрировало не только отсутствие сохранения палочек AAV8-sCX3CL1, но также то, что выживание колбочек не было вторичным по отношению к спасению палочек.
Рис. 5.Влияние AAV8-sCX3CL1 на локализацию микроглии и экспрессию генов иммунного ответа во время дегенерации колбочек. ( A ) Среднепериферические поперечные срезы сетчатки мышей rd1 и rd10 , инфицированных в точке P0 – P1 с помощью AAV8-mCherry или AAV8-mCherry плюс AAV8-sCX3CL1. (Шкала: 50 мкм.) ( B ) Количественная оценка толщины ONL в сетчатках rd1 и rd10 во время начала дегенерации колбочек. Показаны микроглии с меткой Cx3cr1 GFP в поперечных срезах сетчатки rd1 ( C ) и rd10 ( D ), инфицированных AAV8-mCherry или AAV8-mCherry плюс AAV8-sCX3CL1.(Шкала: 100 мкм.) ( E и F ) Количественная оценка микроглии, находящейся в ONL во время дегенерации конуса с AAV8-sCX3CL1 или без него. ( G — J ) Уровни экспрессии генов иммунного ответа всей РНК сетчатки во время начала ( G и I ) и пика ( H и J ) дегенерации колбочек с AAV8 и без него. sCX3CL1. Складчатые изменения относятся к сетчатке WT соответствующего возраста. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего ( n = 4–6 животных на условие).* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 по двустороннему двустороннему дисперсионному анализу ( B ), двустороннему тесту Стьюдента t ( D и F ) или двустороннему тесту Стьюдента t с Поправка Бонферрони ( G — J ). GCL, слой ганглиозных клеток; INL, внутренний ядерный слой; Н.С., не имеет значения.
Затем мы спросили, как микроглия отреагировала на терапию sCX3CL1, сравнив сетчатки из rd1 ; Cx3cr1 GFP / + (рис.5 C ) и rd10 ; Cx3cr1 GFP / + (рис. 5 D ) с AAV8-sCX3CL1 и без него. Поскольку использование AAV8-GFP у этих животных затрудняло визуализацию GFP-экспрессирующей микроглии, аналогичный вирус AAV8-mCherry был создан для контрольных инфекций. Во время как начала, так и пика дегенерации колбочек в глазах, получавших только AAV8-mCherry, около 40% микроглии сетчатки можно было обнаружить в ONL, что указывает на продолжающуюся локализацию этих клеток вблизи колбочек (рис.5 E и F ). Этот процент оставался неизменным при добавлении AAV8-sCX3CL1, что свидетельствует против роли sCX3CL1 в снижении пребывания микроглии в ONL.
Наконец, учитывая повышенную регуляцию воспалительных цитокинов и комплемента в период неавтономной гибели колбочек, влияние AAV8-sCX3CL1 на эти факторы оценивали с помощью ОТ-ПЦР. Для большинства протестированных генов, включая Il1a , Il1b , C1qa и Tmem119 , уровни экспрессии в сетчатке были одинаковыми в глазах, инфицированных AAV8-GFP или AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1 (рис.5 G — J ). Заметным исключением был Cd68 , маркер активации микроглии, который активируется с помощью AAV8-sCX3CL1 во время дегенерации колбочек (30). В совокупности эти данные поставили под сомнение представление о том, что AAV8-sCX3CL1 ослабляет активность комплемента и воспалительных цитокинов в сетчатке. Более того, они показали, что даже при массивной гибели палочек, микроглии в ONL и продолжающемся воспалении в глазу AAV8-sCX3CL1 все еще способен продлевать выживаемость колбочек.
AAV8-sCX3CL1 индуцирует маркеры активации микроглии.
Чтобы исследовать изменения экспрессии генов в микроглии, которые могут быть вызваны AAV8-sCX3CL1, было выполнено РНК-секвенирование (RNA-seq) микроглии сетчатки из глаз, инфицированных AAV8-sCX3CL1. Проточная цитометрия сетчатки RP, несущей трансген Cx3cr1 GFP , показала, что микроглия соответствует популяции CD11b + Ly6G / Ly6C — в сетчатке ( SI Приложение , Рис. S4), что согласуется с более ранними исследованиями (47, 48). Используя эти маркеры клеточной поверхности, микроглию сетчатки от мышей rd10 и , инфицированных AAV8-GFP или AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1, сортировали на P70 во время пика дегенерации колбочек.Отсортированная микроглия представляла собой высокоочищенную популяцию, экспрессирующую специфичные для микроглии гены, такие как Fcrls , P2ry12 и Tmem119 , но не маркеры для других типов клеток сетчатки по сравнению с немикроглией (CD11b — Ly6G / Ly6C — и CD11b – Ly6G / Ly6C + ) клеток (49⇓⇓⇓⇓⇓⇓ – 56) ( SI Приложение , рис. S5).
РНК-seq-анализ отсортированной микроглии из сетчатки P70 rd10 , инфицированных AAV8-sCX3CL1, продемонстрировал значительную (скорректированная P <0.05, кратность изменения ≥2) повышающая и понижающая регуляция 50 и 40 генов, соответственно (рис. 6 A и SI, приложение , таблицы S2 и S3). Четыре из этих изменений экспрессии были подтверждены с помощью ОТ-ПЦР на независимых образцах (фиг. 6 B ). Среди генов, активируемых AAV8-sCX3CL1, были известные маркеры активации микроглии во время нейродегенерации, включая Cst7 , Spp1 , Igf1 , Csf1 , Lyz2 , Cd63-ps и Gpnmb50. (57⇓⇓ – 60).В подтверждение этого, анализ обогащения набора генов (GSEA) микроглии с AAV8-sCX3CL1 выявил значительное обогащение лизосомными компонентами (рис. 6 C ), характерную особенность активированной микроглии (30, 34, 61). Интересно, что низкие уровни множества генов, специфичных для колбочек, таких как Aipl1 , Chrnb4 и Gnb3 , наблюдались в микроглии сетчатки, обработанной AAV8-GFP (62⇓ – 64), потенциально из-за фагоцитоза умирающих. шишки или фрагменты конуса. Меньшее количество этих транскриптов было обнаружено в микроглии из сетчатки, обработанной AAV8-sCX3CL1, что указывает на то, что sCX3CL1 может влиять на переваривание фагоцитированных материалов.
Рис. 6.Профилирование транскрипции микроглии сетчатки во время дегенерации колбочек после сверхэкспрессии sCX3CL1. ( A ) Вулканический график активированных и подавленных генов из микроглии сетчатки P70 rd10 после инфицирования в точке P0 – P1 с помощью AAV8-GFP или AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1. Пунктирными линиями обозначено скорректированное значение P <0,05 и величина кратного изменения ≥2. Полные списки генов представлены в приложении SI , таблицах S2 и S3. ( B ) Проверка изменений экспрессии генов в микроглии сетчатки P70 rd10 с помощью AAV8-sCX3CL1 с помощью ОТ-ПЦР.( C ) GSEA микроглии P70 rd10 из сетчатки, инфицированной AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1 (оранжевый), по сравнению с одним AAV8-GFP (зеленый). Отображаются генные наборы с коэффициентом ошибок в семье <0,05. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 7–8 животных на условие). * P <0,05; ** P <0,01; **** P <0,0001 по двустороннему тесту Стьюдента t .
Нормальное количество микроглии не требуется для спасения конуса с помощью AAV8-sCX3CL1.
В здоровых глазах CX3CR1, единственный известный рецептор CX3CL1, как полагают, специфически экспрессируется микроглией (65). Этот факт и приведенные выше данные RNA-seq побудили нас задаться вопросом, какое влияние удаление микроглии может иметь на выживаемость колбочек. Кроме того, нам было любопытно, была ли микроглия необходима для спасения колбочек с помощью AAV8-sCX3CL1. Фармакологически истощить микроглию можно с помощью PLX3397, мощного ингибитора рецептора колониестимулирующего фактора 1 (CSF1R) (23, 66). С этой целью мышей rd1 кормили PLX3397, и истощение микроглии сетчатки оценивали с помощью проточной цитометрии.Обработка PLX3397 привела к истощению ~ 99% микроглии через 30 дней (рис. 7 A и B ). Чтобы определить, продлевает ли уменьшение микроглии выживаемость колбочек, и проверить, требуется ли для активности AAV8-sCX3CL1 микроглия для сохранения колбочек, мышей rd1 инфицировали AAV8-GFP с AAV8-sCX3CL1 или без него и вводили PLX3397 в течение 30 дней в течение 30 дней. период дегенерации шишки. Истощение микроглии незначительно ( P > 0,05) увеличивало выживаемость колбочек в обоих условиях (рис.7 C и D ). Более того, истощение микроглии не отменяет способности AAV8-sCX3CL1 спасать колбочки ( P <0,0001).
Рис. 7.Влияние истощения микроглии на восстановление конуса AAV8-sCX3CL1. ( A ) Репрезентативная проточная цитометрия, стробирующая микроглии (CD11b + Ly6G / Ly6C — ) и CD11b — Ly6G / Ly6C + + популяции в P50 rd1 сетчатке с лечением PLX339749 от P20 или без него. .Панели закрываются на живых клетках (DAPI —) после исключения дублетов. ( B ) Фракция микроглии и CD11b — Ly6G / Ly6C + клеток, остающихся относительно контроля в сетчатках P50 rd1 , инфицированных в P0 – P1 только AAV8-GFP или AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1 после 30 лет d обработки PLX3397. Сетчатку от однопометников без обработки PLX3397 использовали в качестве контроля. ( C ) Плоские сетчатки P50 rd1 от мышей, обработанных PLX3397, инфицированных AAV8-GFP или AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1.(Масштаб: 1 мм.) ( D ) Количественная оценка выживаемости колбочек в центральной сетчатке сетчатки P50 rd1 мышей, обработанных PLX3397, инфицированных AAV8-GFP или AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM [ n = 3–4 животных на условие ( A ), n = 9–18 животных на условие ( D )]. **** P <0,0001 по двустороннему тесту Стьюдента t . Н.С., не имеет значения.
Обсуждение
В этом исследовании мы разработали вектор для генной терапии, AAV8-sCX3CL1, который увеличивал выживаемость колбочек в трех различных моделях мышей RP и задерживал потерю опосредованного конусами зрения.Сохранение колбочек с AAV8-sCX3CL1 происходило, несмотря на повышенные уровни цитокинов в сетчатке и несмотря на продолжающееся присутствие микроглии в ONL. Истощение до ∼99% микроглии во время дегенерации колбочек незначительно улучшало выживаемость колбочек и не нарушало спасительный эффект AAV8-sCX3CL1. Хотя механизм, с помощью которого AAV8-sCX3CL1 сохраняет колбочки, еще предстоит выяснить, наши результаты показывают, что генная терапия sCX3CL1 может быть полезной для широкого круга пациентов с RP и, возможно, для других пациентов с воспалительными процессами, которые влияют на зрение или другие области ЦНС.
CX3CL1 представляет собой белок из 373 аминокислот с одним трансмембранным доменом, который может подвергаться протеолитическому расщеплению с высвобождением sCX3CL1 во внеклеточную среду (38). В ЦНС и fCX3CL1, и sCX3CL1 в основном продуцируются нейронами, и, связывая CX3CR1 с микроглией, они, как полагают, регулируют ключевые аспекты физиологии микроглии (67, 68). Одна из основных функций CX3CL1 во взаимодействиях нейронов с микроглией — подавление активации микроглии (69, 70). Подтверждая это мнение, было показано, что экзогенная доставка CX3CL1 снижает активацию микроглии, а также неврологический дефицит на животных моделях болезни Паркинсона и инсульта (71–73).Основываясь на этих данных, мы сверхэкспрессировали CX3CL1 у мышей RP в надежде, что он ослабит иммунные ответы в сетчатке, которые увековечивают неавтономную гибель колбочек. Использование sCX3CL1 действительно увеличивало выживаемость колбочек во время дегенерации, хотя и не уменьшало воспаление или количество микроглии в ONL. Интересно, что спасение колбочек наблюдалось, когда sCX3CL1 секретировалось с помощью RPE, но не когда полноразмерный мембраносвязанный CX3CL1 экспрессировался на колбочках. Этот результат может быть связан с различиями в уровне экспрессии, поскольку специфический для RPE промотор Best1 человека является довольно сильным по сравнению с промотором красного опсина человека.Альтернативно, возможно, что sCX3CL1 действует на другие типы клеток, помимо микроглии, и может лучше достигать этих клеток при секреции. Напротив, сверхэкспрессия CD200, другого репрессора активации микроглии (24), не смогла спасти колбочки, независимо от того, экспрессируются они как sCD200 из RPE или как fCD200 на колбочках. Следует отметить, что недавно мы сообщили о дозозависимой векторной токсичности с некоторыми промоторами, включая Best1 человека, что приводило к дисморфическому РПЭ и легкому повреждению фоторецепторов (74). В этом исследовании AAV8-sCX3CL1, содержащий человеческий промотор Best1, тем не менее, был способен улучшить выживаемость колбочек.
Активированная микроглия является отличительной чертой ранней РП, учитывая их миграцию в ONL, продукцию воспалительных цитокинов и фагоцитоз живых фоторецепторов (33, 34, 45). На ранней стадии RP палочки дегенерируют, и эти активности микроглии вредны, поскольку генетическое удаление микроглии, как было показано, улучшает гибель палочки (34). Острая отслойка сетчатки, еще одно состояние, вызывающее потерю фоторецепторов, аналогичным образом характеризуется воспалительными цитокинами и фагоцитарной микроглией (75, 76).Однако, в отличие от случая раннего РПЖ, удаление микроглии во время отслоения сетчатки ускоряет дегенерацию фоторецепторов, что подразумевает защитную роль активированной микроглии (76). Здесь мы нашли доказательства активации микроглии во время гибели колбочек при RP, о чем свидетельствует присутствие микроглии в ONL и активация Il1a , Tnf , C1qa и Cd68 . Мы предположили, что, как и при раннем РП, эти микроглии могут быть вредными; Следовательно, нашей целью было разработать AAV, способные подавлять активацию микроглии сетчатки.Интересно, что вызванное лекарствами истощение микроглии в сетчатках rd1 и предоставило доказательства лишь небольшого отрицательного эффекта активированной микроглии на колбочки; только небольшое увеличение количества колбочек наблюдалось при истощении микроглии, и это изменение не достигло статистической значимости. Одно из объяснений этого может заключаться в том, что, хотя активированная микроглия при RP действительно препятствует выживанию колбочек, они также могут давать некоторые преимущества. Мы предполагаем, что одним из таких преимуществ может быть увеличение очистки от вредных клеточных остатков.С помощью RNA-seq мы обнаружили небольшие количества специфичных для колбочек РНК в микроглии из сетчатки rd10 , инфицированных AAV8-GFP, возможно, в результате фагоцитоза колбочек или фрагментов колбочек. Поскольку таких РНК было меньше в микроглии сетчатки, инфицированной AAV8-sCX3CL1, обломки колбочек могут накапливаться в контрольной микроглии, если переваривание этих материалов не может поспевать за поглощением. Неспособность микроглии завершить фагоцитоз может затем вызвать высвобождение факторов, повреждающих колбочки, аналогично модели «фрустрированного фагоцитоза», испытываемого микроглией при болезни Альцгеймера (77).Поскольку мы наблюдали повышающую регуляцию лизосомных путей в микроглии с помощью AAV8-sCX3CL1, эти клетки могут более эффективно переваривать материал колбочек, облегчая это расстройство и способствуя сохранению колбочек.
Примечательно, что истощение до ∼99% микроглии также не отменяет спасение конуса AAV8-sCX3CL1. Хотя это может указывать на то, что sCX3CL1 продлевает выживаемость колбочек независимо от микроглии, мы не можем исключить возможность того, что sCX3CL1 опосредует эффект спасения через микроглии до их истощения.Поскольку AAV8-sCX3CL1 вводили до PLX3397, у микроглии могло быть достаточно времени, чтобы отреагировать на sCX3CL1 и изменить микросреду сетчатки таким образом, чтобы способствовать выживанию колбочек. Хотя обычно для достижения пика субретинальной экспрессии AAV8 требуется около 2 месяцев, небольшое количество сигнала может быть обнаружено уже через 5 дней после заражения (78). В соответствии с этим мы действительно наблюдали некоторые транскрипционные изменения в микроглии сетчатки через 20 дней после доставки AAV8-sCX3CL1 ( SI, приложение , рис.S6), хотя трудно интерпретировать значимость таких изменений для задержки дегенерации конуса. Другой сценарий может заключаться в том, что для сохранения колбочек AAV8-sCX3CL1 необходимо всего несколько микроглии. В недавнем исследовании Liddelow et al. (23), истощение микроглии с помощью PLX3397 не смогло устранить фенотип в астроцитах, индуцированный микроглией. В частности, авторы обнаружили, что воспалительные цитокины из активированной микроглии заставляют астроциты повреждать нейроны. Нейротоксичность астроцитов отсутствовала у CSF1R-нулевых мышей, лишенных микроглии (79).Однако у других штаммов нейротоксичность все еще наблюдалась, несмотря на фармакологическое истощение 95% микроглии (23). Таким образом, возможно, что ~ 1% микроглии сетчатки, которая выживает после лечения PLX3397, достаточна для ответа на sCX3CL1 и сохранения дегенерирующих колбочек. Для этих оставшихся микроглий более высокая передача сигналов sCX3CL1 на клетку может дополнительно объяснять небольшую аддитивность AAV8-sCX3CL1 и истощение микроглии при спасении колбочек.
Альтернативная модель, учитывая, насколько скромным было влияние истощения микроглии на выживаемость колбочек, заключается в том, что неавтономная гибель колбочек вызывается механизмами, в значительной степени независимыми от микроглии (9, 13–15).Для AAV8-sCX3CL1 причина спасения колбочек может быть связана с тем, что sCX3CL1 действует на тип клеток, экспрессирующих CX3CR1, отличный от микроглии. Этот тип клеток должен быть внешним по отношению к сетчатке, поскольку ни одна из клеток немикроглии в наших сетчатках rd1 ; Cx3cr1 GFP / + не экспрессировала CX3CR1 при анализе с помощью проточной цитометрии. Вне ЦНС CX3CR1 также присутствует в нескольких популяциях иммунных клеток, включая моноциты; периферические макрофаги; и определенные подмножества Т-клеток, естественных клеток-киллеров и дендритных клеток (35, 80).В этих популяциях одна из ролей CX3CR1 — опосредовать хемотаксический ответ на CX3CL1 (80, 81). Следовательно, вероятно, что sCX3CL1, секретируемый RPE, может действовать на один из этих типов клеток в сосудистой сосудистой оболочке, возможно, чтобы индуцировать миграцию в субретинальное пространство. Дальнейшая работа необходима для изучения этих возможностей и определения на молекулярном уровне, как sCX3CL1 сохраняет колбочки. Такая информация поможет в разработке более эффективных методов лечения РПЭ, более конкретно направленных на дегенерацию колбочек.
В 2017 году AAV, кодирующий ген RPE65, стал первой генной терапией, одобренной для лечения наследственного заболевания сетчатки (82). Несмотря на это достижение, до сих пор существуют тысячи мутаций заболеваний сетчатки, от которых не существует эффективного лечения (83). Устранение этих поражений по одному было бы дорогостоящим и трудоемким, и особенно для RP, стержни, несущие мутацию, часто умирают к моменту постановки диагноза (1), что делает терапию генной коррекции невозможной. Генная терапия, не зависящая от мутаций, представляет собой альтернативный подход, который, хотя и не является лечебным, может улучшить зрение у гораздо большего числа пациентов, включая тех, у которых не было выявлено никаких причинных мутаций.Ранее было показано, что только два примера независимой от мутаций генной терапии спасают колбочки на животных моделях RP (84). В 2015 году Бирн с соавторами (85) сообщили о лучшей выживаемости колбочек и зрении у двух линий мышей RP с вирусной экспрессией фактора жизнеспособности колбочек (RdCVF), белка, обычно секретируемого палочками, который стимулирует колбочки поглощать глюкозу. (86). В том же году наша группа обнаружила, что количество колбочек и функция у трех линий RP мышей могут быть улучшены с помощью AAV-опосредованной доставки антиоксидантной терапии, в частности, основного антиоксидантного фактора транскрипции, NRF2 (13).Здесь мы продемонстрировали, что AAV8-sCX3CL1 также является независимой от мутаций генной терапией, способной сохранять колбочки у разных типов мышей RP. Наши результаты подтверждают дальнейшую оценку AAV8-sCX3CL1 на более крупных животных моделях RP и подчеркивают его потенциал для лечения этого заболевания у пациентов, независимо от их мутации.
Наконец, смерть фоторецепторов происходит при других заболеваниях, таких как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), ведущая причина слепоты в промышленно развитых странах (87). Хотя патогенез AMD до конца не изучен, потеря палочек обычно предшествует потере колбочек (88, 89), в отличие от неавтономной гибели колбочек при RP.Кроме того, генетический полиморфизм CX3CR1, рецептора CX3CL1, был связан с более высоким риском AMD у пациентов (90). Таким образом, было бы интересно проверить, может ли sCX3CL1 аналогичным образом облегчить дегенерацию сетчатки при AMD.
Материалы и методы
Животные. Мыши
CD-1 (номер в каталоге 022), rd1 (FVB / N; номер в каталоге 207) и B6 (номер в каталоге 027) были приобретены в Charles River Laboratories. Cx3cr1 GFP (каталожный номер 005582) (35) и rd10 (каталожный номер.004297) (27) мышей на фоне B6 были приобретены в The Jackson Laboratory. Родопсин-нулевые ( Rho — / — ) мыши были подарком Дженис Лем, Университет Тафтса, Бостон, Массачусетс (42). Впоследствии животных разводили и содержали в Гарвардской медицинской школе с 12-часовым чередованием светового и темного цикла. Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в Гарвардском университете.
Плазмиды.
Векторная плазмида AAV-красный опсин человека-GFP-вирус гепатита сурка посттранскрипционный регуляторный элемент (WPRE)-бычий гормон роста (bGH) polyA (AAV8-GFP) была подарена Botond Roska, Институт биомедицинских исследований Фридриха Мишера, Базель , Switzerland (91), и использовали промоторную область, первоначально разработанную Wang et al.(92). Вектор AAV8-mCherry был создан путем замены кодирующей последовательности GFP последовательностью mCherry, фланкированной сайтами рестрикции NotI и AgeI. Затем AAV8-fCD200 и AAV8-fCX3CL1 были клонированы путем переваривания AAV8-mCherry рестрикционными ферментами NotI и HindIII и замены кодирующей последовательности mCherry последовательностью Козака GCCGCCACC, за которой следовала полноразмерная кДНК мыши для CD200 (NM_010818.3) или CX3CL. (NM_009142.3) соответственно. Вектор, использующий промотор Best1 человека, был создан путем замены промотора CMV в плазмиде интрона AAV-CMV-Promega (PI) -EGFP-WPRE-bGH, подаренной Джеймсом М.Wilson, Пенсильванский университет, Филадельфия, Пенсильвания, с областью -540 / + 38 п.н. человеческого промотора Best1 (93). Векторные плазмиды для AAV8-sCD200 и AAV8-sCX3CL1 были клонированы путем переваривания вектора промотора AAV-human Best1 рестрикционными ферментами NotI и HindIII и замены кодирующей последовательности EGFP последовательностью Козака GCCGCCACC, за которой следовали первые 714 п.н. (аминокислоты 1– 238) CD200 или первые 1008 п.н. (аминокислоты 1–336) CX3CL1, соответственно, за которыми следует стоп-кодон.
Гистология.
Энуклеированные глаза для поперечных срезов сетчатки препарировали в PBS. После удаления роговицы, радужки, хрусталика и цилиарного тела оставшийся наглазник фиксировали в 4% параформальдегиде на 4 часа при комнатной температуре; криозащита в 10%, 20% и 30% сахарозе в PBS; и заключили в смесь 1: 1 30% сахарозы в PBS и компаунде с оптимальной температурой резки (Tissue-Tek) на сухом льду. Замороженные наглазники разрезали на криостате Leica CM3050S (Leica Microsystems) на срезы размером 50 мкм для сетчатки Cx3cr1 GFP или срезы размером 20 мкм в противном случае и окрашивали 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; Thermo Fisher Scientific. ) в течение 5 минут при комнатной температуре перед нанесением с помощью Fluoromount-G (SouthernBiotech).Для сетчатки, установленной на плоской поверхности, изолированные сетчатки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 30 мин при комнатной температуре. Делали четыре радиальных разреза для расслабления сетчатки на четыре листочка, которые расплющивали на предметном стекле микроскопа слоем ганглиозных клеток вверх, используя щеточку с тонким ворсом. Чтобы выполнить окрашивание антителами поперечных срезов сетчатки или целой сетчатки, ткани блокировали 5% козьей сывороткой или 5% BSA в PBS с 0,1% Triton X-100 в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего ткани инкубировали с первичными антителами в блокировать раствор при 4 ° C в течение ночи, а затем вторичные антитела в PBS в течение 2 часов при комнатной температуре.Первичные антитела включали кроличьи анти-CX3CL1 (ab25088, 1: 500; Abcam) и арахисовый агглютинин, конъюгированный с родамином (RL-1072, 1: 1000; Vector Laboratories). Козье антитело против кролика Alexa Fluor 594 (111-585-144, 1: 1000; Jackson ImmunoResearch) использовали в качестве вторичных антител.
Получение и анализ изображений.
Изображения микроглии в поперечных срезах сетчатки и сетчатки, закрепленной на плоской поверхности, получали на широкоугольном флуоресцентном микроскопе Keyence BZ-9000 с использованием воздушного объектива 10x. Все остальные изображения были получены на сканирующем конфокальном микроскопе Zeiss LSM710 с использованием 10-кратного воздушного, 20-кратного воздушного или 40-кратного масляного объектива.Анализ изображений выполнялся с помощью ImageJ (NIH). Чтобы рассчитать процент микроглии в ONL, вокруг ONL была нарисована маска по контурам ядер, меченных DAPI. Было определено, что каждая микроглия находится в ONL, если 50% или более ее клеточного тела находится внутри маски. Чтобы оценить выживаемость колбочек в сетчатке с плоским экраном, был создан специальный модуль ImageJ. Во-первых, чтобы указать границы сетчатки, пользователь отметил расположение головки зрительного нерва и каждой из четырех створок сетчатки, как показано в приложении SI , рис.S2. Затем модуль автоматически обработал изображение, определил центральную сетчатку и применил порог для количественной оценки количества GFP-положительных колбочек в этой области. Подробные процедуры представлены в SI Приложение , SI Материалы и методы .
ERG.
Регистрация ERG in vivo проводилась и измерялась наблюдателем, не знающим назначения лечения, с использованием системы Espion E3 (Diagonsys), как описано ранее (13, 96). Подробные процедуры представлены в SI Приложение , SI Материалы и методы .
Оптомоторный анализ.
Острота зрения измерялась наблюдателем, не осведомленным о назначении лечения, с помощью системы OptoMotry (CerebralMechanics), как описано ранее (13, 96). Подробные процедуры представлены в SI Приложение , SI Материалы и методы .
ОТ-ПЦР.
Для ОТ-ПЦР целых сетчаток только что рассеченные сетчатки гомогенизировали с использованием ручного пестика для гранул (Kimble Chase) в 350 мкл буфера для RLT, содержащего 1% -меркаптоэтанол.На образец использовали одну сетчатку. Для ОТ-ПЦР микроглии ~ 1000 микроглии на сетчатку сортировали в 10 мкл буфера TCL (Qiagen) для лизирования клеток, к которому добавляли 70 мкл буфера для RLT, содержащего 1% -меркаптоэтанол. Экстракцию РНК проводили с использованием набора RNeasy Micro Kit (Qiagen) с последующим синтезом кДНК с использованием системы синтеза первой цепи SuperScript III (Invitrogen). Реакции RT-PCR проводили в трех повторностях с использованием Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) на системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX96 (BioRad) для определения значений порога цикла (Ct).Уровни экспрессии определяли количественно путем нормализации к гену домашнего хозяйства Gapdh с кратными изменениями относительно сопоставимых по возрасту сетчаток дикого типа (CD-1 или B6). Значения P были рассчитаны с использованием значений ΔΔCt. Праймеры для ОТ-ПЦР были разработаны с использованием PrimerBank (97) с последовательностями, доступными в SI Приложение , Таблица S1.
Проточная цитометрия и сортировка клеток.
Микроглию сетчатки выделяли с помощью клеточной сортировки, активируемой флуоресценцией (FACS), и данные анализировали с помощью FlowJo 10 (TreeStar).Для диссоциации клеток свежесрезанные сетчатки инкубировали в 400 мкл раствора цистеин-активированного папаина (Worthington) в течение 5 минут при 37 ° C с последующим легким растиранием с помощью микропипетки. Затем диссоциированные клетки блокировали крысиным антимышиным CD16 / 32 (1: 100; BD Pharmingen) в течение 5 минут на льду с последующим окрашиванием конъюгированным с фикоэритрином-Cy5 анти-CD11b (M1 / 70, 1: 200; BioLegend) , конъюгированный с аллофикоцианином (APC) -Cy7 анти-Ly6G (1A8, 1: 200; BioLegend) и конъюгированный с APC-Cy7 анти-Ly6C (HK1.4, 1: 200; BioLegend) в течение 20 мин на льду. После промывок клетки ресуспендировали в буфере FACS (2% FBS, 2 мМ EDTA в PBS), содержащем 0,5 мкг / мл DAPI, для мечения нежизнеспособных клеток и пропускали через фильтр с размером ячеек 40 мкм. Сортировку выполняли на BD FACSAria II с использованием сопла 70 мкм в соответствии со стробированием, показанным в приложении SI , рис. S4.
РНК-последовательность микроглии.
Восемь биологических повторов были использованы для экспериментальных условий. Для каждой сетчатки 1000 микроглии (CD11b + Ly6G / Ly6C —) были отсортированы в 10 мкл буфера TCL (Qiagen), содержащего 1% -меркаптоэтанол, и немедленно заморожены на сухом льду.Для подмножества сетчатки также были отсортированы 1000 клеток немикроглии (CD11b — ). После сбора всех образцов замороженные лизаты микроглии и немикроглии размораживали на влажном льду и загружали в 96-луночный планшет для синтеза библиотеки кДНК и секвенирования. Модифицированный протокол Smart-Seq2 был выполнен на образцах с помощью Genomics Platform Broad Institute (98). Библиотеки из 96 образцов с уникальными штрих-кодами были объединены и секвенированы на системе секвенирования NextSeq 500 (Illumina) до ожидаемого охвата ~ 6 миллионов считываний на образец.После демультиплексирования считанные данные были подвергнуты мерам контроля качества и сопоставлены с эталонным геномом GRCm38.p6. Считывания, присвоенные каждому гену, были количественно определены с использованием функции featureCounts (99), а образцы с менее чем 30% назначенных считываний были исключены из дальнейшего анализа. Данные подсчета были проанализированы с использованием DESeq2 для идентификации дифференциально экспрессируемых генов, при этом скорректированное значение P менее 0,05 считалось значимым (100). GSEA выполняли с использованием программного обеспечения GSEA v3.0 от Broad Institute с настройками по умолчанию в коллекции GO Cellular Component Ontology (580 наборов генов) из базы данных молекулярных сигнатур (MSigDB).Наборы генов с коэффициентом ошибок в семье менее 0,05 считались значительно обогащенными.
Истощение микроглии.
Микроглии истощали с использованием PLX3397 (SelleckChem), перорально доступного ингибитора CSF1R. PLX3397 включали в корм для грызунов AIN-76A (Research Diets) в дозе 290 мг / кг и давали ad libitum в течение 30 дней перед отбором животных на P50.
Статистика.
Непарные, двусторонние тесты Стьюдента t были использованы для сравнения между двумя группами.Для сравнения трех или более групп к тесту добавляли поправку Бонферрони путем умножения полученного значения P на количество проверенных гипотез. Двусторонний двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA использовался для анализа экспериментов с ERG, оптомоторной системой и толщиной ONL, в которых одних и тех же субъектов сравнивают по ряду условий или временных точек. Во всех случаях значение P менее 0,05 считалось статистически значимым.
Благодарности
Мы благодарим Sophia Zhao и Microscopy Resources на Северном квадрате в Гарвардской медицинской школе за их техническую помощь.Эта работа стала возможной благодаря поддержке Медицинского института Говарда Хьюза (S.K.W. и C.L.C.), Фонда борьбы со слепотой (S.K.W.) и Fight for Sight (S.K.W.).
Сноски
Автор: S.K.W. и C.L.C. спланированное исследование; S.K.W., Y.X., P.R. и C.M.H. проведенное исследование; S.K.W., Y.X., P.R. и C.M.H. проанализированные данные; и S.K.W. и C.L.C. написал газету.
Рецензенты: S.H.T., Колумбийский университет; и M.L.V., Университет Юты.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.17116/-/DCSupplemental.
Пространственно-временная характеристика дегенерации S- и M / L-конусов в модели пигментного ретинита на мышах Rd1 | BMC Neuroscience
Идентификация S- и M / L-колбочек в сетчатке дикого типа и Rd1
S- и M / L-колбочки были идентифицированы иммунодетекцией с использованием хорошо охарактеризованных антител [15, 19].В сетчатке WT каждый опсин был в основном связан с внешним сегментом (дополнительный файл 1). Обнаруживалась также более низкая интенсивность мечения соматы конуса и синаптического конца, которая была сильнее в колбочках S-opsin + , чем в колбочках M / L opsin + . Предыдущие исследования продемонстрировали, что у мышей Rd1 внешние сегменты колбочек дегенерируют до гибели тела клетки, что приводит к эктопическому перераспределению опсинов в выжившее тело клетки [8]. Таким образом, в сетчатке Rd1 можно обнаружить как колбочки с интактными внешними сегментами, так и колбочки, лишенные внешних сегментов.В настоящем исследовании тельца колбочек были идентифицированы по их широкой яйцевидной морфологии и помечены с умеренной интенсивностью флуоресценции, в то время как внешние сегменты были идентифицированы по их узкому пучковидному виду и помечены с высокой интенсивностью флуоресценции (дополнительный файл 2). Эти различные клеточные структуры были проанализированы и количественно определены отдельно с использованием пороговых значений изображения (дополнительный файл 2). Ортин-Мартинес и др. [15] отметили, что надежная количественная оценка сегментов конуса в цельных кронштейнах зависит от тщательного удаления РПЭ без повреждения хрупких внешних сегментов.Сетчатка, использованная в этом исследовании, была успешно отделена от RPE, однако возможно, что это было не всегда так. В отличие от здоровой сетчатки мышей дикого типа, сетчатки Rd1 демонстрируют негомогенную дегенерацию колбочек. Следовательно, возможно, что любая очевидная гетерогенная дегенерация может иметь частично артефактный характер.
Пространственно-временная характеристика дегенерации S- и M / L-колбочек в сетчатке Rd1
Перед исследованием дегенерации колбочек мы проверили время дегенерации палочковидных фоторецепторов в нашей когорте мышей Rd1 путем иммуномечения родопсина с использованием лунок. характеризуемый клон антитела RET-P1.Результаты показали, что смерть палочки — это раннее фенотипическое событие. К P21, только очень редкая совокупность стержней все еще была очевидна (дополнительный файл 3), которая была полностью потеряна на P28. Результаты согласуются с большим объемом исследований, проведенных на мышах Rd1 [2].
Наши результаты показали однородное распределение колбочек M / L-опсина + по всей сетчатке Rd1 на P14, в то время как имелся градиент конусов S-опсина + от относительно редкой популяции в верхней сетчатке до высокая плотность колбочек в нижней сетчатке (рис.1, 2, 3). Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями, в которых изучали распределение колбочек в сетчатке Rd1 на очень ранней стадии дегенерации [8, 9]. На P14, самой ранней проанализированной временной точке, подавляющее большинство колбочек S-opsin + и M / L-opsin + сохранили внешние сегменты, но сегменты, как правило, были деформированы или опухли по внешнему виду, в то время как эктопическое перераспределение опсинов к выжившим клеточным телам началось в различной степени (рис. 3; дополнительные файлы 4, 5).Высокая концентрация сильно меченых внешних сегментов на P14 делала идентификацию тела колбочек у целых пород проблематичной. К P21 значительная часть внешних сегментов дегенерировала (рис. 3; дополнительные файлы 4, 5). Следовательно, плотность тела колбочек измерялась только по P21.
Рис. 1Репрезентативные изображения колбочек S-опсина + и M / L-опсина + в целых количествах сетчатки на сетчатке у мышей C57BL / 6 дикого типа (WT) и мышей Rd1 из послеродового периода, с малым увеличением. день (P) 14 — P300.Иммунофлуоресценцию с двойной меткой проводили с использованием антител, направленных против S-опсина (красный) и M / L-опсина (зеленый). Тела клеток и внешние сегменты не могут быть легко различимы на этих изображениях с низким увеличением; однако топографическая картина дегенерации конуса очевидна. S верхний, I нижний, N носовой, T височный. Масштабная линейка: 500 мкм
Рис. 2Репрезентативные, с большим увеличением, изображения колбочек S-opsin + и M / L-opsin + в целых количествах сетчатки мышей Rd1 от постнатального дня (P) 14 до P300.Иммунофлуоресценцию с двойной меткой проводили с использованием антител, направленных против S-опсина (красный) и M / L-опсина (зеленый). Внешние сегменты обоих типов конусов интенсивно метятся на P14. К P45 большое количество внешних сегментов дегенерировало, что позволило лучше визуализировать тела колбочек. S-P верхняя периферическая сетчатка, S-C верхняя центральная сетчатка, I-C нижняя центральная сетчатка, I-P нижняя периферическая сетчатка. Масштабная линейка: 100 мкм
Рис.3Репрезентативные изображения колбочек S-opsin + и M / L-opsin + в поперечных срезах сетчатки мышей Rd1 на постнатальные сутки (P) 14, P21 и P60. Двойное мечение иммунофлуоресценции в верхней ( a — c ) и нижней сетчатке ( d — f ) проводили с использованием антител, направленных против S-опсина (красный) и M / L-опсина (зеленый). Двойные колбочки экспрессируют как S-опсин, так и M / L-опсин и выглядят желтыми (стрелки). Шкала шкалы: 20 мм. IPL , внутренний плексиформный слой; INL , внутренний ядерный слой; ONL , внешний ядерный слой
Количественная оценка временной прогрессии дегенерации колбочек S-opsin + и M / L-opsin + у цельных животных выявила поразительную разницу между центральными и периферическими областями сетчатки, а также между внешними сегментами и телами клеток. Для клеток S-opsin + и M / L-opsin + дегенерация внешнего сегмента колбочки в центральной части сетчатки была эффективно завершена к P21 (рис.2, 4а, б). Напротив, дегенерация внешнего сегмента периферической сетчатки была более постепенной, хотя более 90% внешних сегментов S-opsin + и M / L-opsin + все еще дегенерировали с помощью P45 (рис. 2, 4a, б). До P30 сегменты M / L-opsin + в периферической сетчатке казались несколько более сохраненными, чем сегменты S-opsin + (Fig. 4a, b). Что касается клеточных тел, то также наблюдалась более быстрая дегенерация конусов S-опсина + и M / L-опсина + в центральной сетчатке, чем в периферической сетчатке (рис.2, 4в, г). Например, относительно P21 было только 25% выживания конусов S-opsin + в центральной сетчатке, но примерно 75% оставалось в периферической сетчатке (рис. 4c). Общая кинетика потери тел колбочек S-опсина + и M / L-опсина + в центральной и периферической сетчатке была сходной (рис. 4c, d), но наблюдалось заметное несоответствие в пространственной структуре вырождение каждого типа конуса. Была полушарная асимметрия в скорости дегенерации колбочек S-опсина + и M / L-опсина + ; таким образом, колбочки S-opsin + были замечательно хорошо сохранены в нижней сетчатке по сравнению с верхней сетчаткой (рис.1, 2, 3, 5a), в то время как колбочки M / L-opsin + были гораздо более устойчивы к дегенерации в верхней сетчатке по сравнению с нижней сетчаткой (рис. 1, 2, 3, 5b). Несоответствие становилось более выраженным по мере прогрессирования дегенерации конуса (рис. 1, 2, 3, 5a, b). К P300 небольшое количество колбочек M / L-opsin + выжило в верхней периферической сетчатке, в то время как небольшая популяция колбочек S-opsin + осталась в периферической нижней сетчатке (рис. 1, 2, 5a, b). ). Потеря S-опсина + и M / L-опсина + конусных клеточных тел в назальном и височном квадрантах сетчатки демонстрирует сходную кинетику друг для друга (рис.5в, г).
Рис. 4Графики, показывающие естественную историю дегенерации конусов S-опсина + и M / L-опсина + у мышей Rd1 с течением времени. a , b Количественная оценка S-опсина + и M / L-опсина + дегенерация внешнего сегмента конуса в центральной и периферической сетчатке. c , d Количественная оценка S-опсина + и M / L-опсина + дегенерация тельца колбочек в центральной и периферической сетчатке.Данные представляют собой среднее значение ± SEM
. Рис. 5Пространственно-временная количественная оценка S-опсина + и M / L-опсина + дегенерация тела колбочек в верхнем и нижнем ( a , b ), а также назальном и временном ( c , d ) периферические квадранты сетчатки. Данные представляют собой среднее значение ± SEM
Чтобы поделиться видением результатов по белку опсина, мы использовали кПЦР для изучения уровней мРНК M / L- и S-опсина в сетчатке Rd1 (нормализованных к пулу из двух эталонных генов).По сравнению с сетчаткой дикого типа уровни мРНК S-опсина и M / L-опсина были ниже на P14, хотя различия не достигли значимости в это время (P = 0,43; P = 0,56, соответственно; рис. 6). После этого уровень мРНК M / L-опсина линейно снижался от P14 до P90, в этот момент он составлял 16% от уровня WT (фиг. 6a). Количество мРНК S-опсина снижалось незначительно быстрее, чем мРНК M / L-опсина, но также было снижено до 16% от уровня WT на P90 (фиг. 6c). По сравнению с P14 снижение мРНК M / L-опсина не было статистически значимым на P30 (P = 0.09; Рис. 6b), но уровень мРНК S-опсина был значительно ниже в тот же момент времени (P <0,05; Рис. 6d). Снижение мРНК опсина обоих колбочек было статистически значимым, начиная с P45 и далее. В целом данные КПЦР соответствовали данным, полученным при иммуногистохимии целых образцов и поперечных срезов.
Рис.6Количественная оценка уровней мРНК M / L-опсина ( a , b ) и S-опсина ( c , d ) в сетчатке Rd1 от постнатального дня (P) 14 до P90 .Значения (представленные как среднее ± SEM) нормализованы к пулу двух эндогенных генов (GAPDH и циклофилин) и выражены относительно сетчатки дикого типа ( a , c ) и временной точки 14d Rd1 ( b , d ). ** P <0,01, *** P <0,001, по ANOVA с последующим апостериорным тестом множественного сравнения Даннета ( a , c против WT; b , d против 14 дней Rd1)
Исследование двойных колбочек в сетчатке Rd1
Вторая часть этого исследования включала характеристику популяции настоящих S-колбочек, настоящих M / L-колбочек и двойных колбочек в сетчатке мышей Rd1 в начале дегенерации колбочек, P14 и приблизительно в середине дегенерации, P60.Эти данные доступны в сетчатке мышей WT [15], но не в сетчатке Rd1. Целые ткани сетчатки иммуномечены антителами к S- и M / L-опсинам. Изображения периферической сетчатки были захвачены, предварительно обработаны, объединены, и плотности колбочек настоящих колбочек S-опсина, настоящих колбочек M / L-опсина и двойных колбочек затем количественно определены в каждом из четырех квадрантов сетчатки с использованием порогового значения цвета (см. « Методы »). На P14 были количественно определены внешние сегменты, а на P60 использовались клеточные тела (плюс любые выжившие внешние сегменты).Первоначально, однако, мы протестировали методологию, используя целиком сетчатку от мыши WT (см. Дополнительные файлы 6 и 7). Исследование сетчатки выявило 14% настоящих S-колбочек, 35% двойных колбочек и 50% настоящих M / L-колбочек, значения, которые не отличаются от ранее сообщенных [15].
На P14 верхняя сетчатка (рис.7, дополнительный файл 8), как и ожидалось, включала меньшую часть настоящих S-колбочек (15,6%) с гораздо большим количеством настоящих колбочек M / L-опсина (38,1%). и двойные конусы (40.4%). Напротив, нижняя сетчатка (рис. 7, дополнительный файл 9) содержала относительно одинаковое количество настоящих S-колбочек (37,5%), настоящих M / L-колбочек (27,2%) и двойных колбочек (35,3%). Носовая (рис.7, дополнительный файл 10) и височная (рис.7, дополнительный файл 11) области имели одинаковое количество настоящих S-колбочек (41,3%; 41,6% соответственно), настоящих конусов M / L-опсина (24,2%). ; 28,5% соответственно) и двойные конусы (34,5%; 29,9% соответственно).
Рис.7Гистограммы, отображающие состав популяции колбочек в верхнем ( a ), нижнем ( b ), назальном ( c ) и височном ( d ) квадрантах сетчатки Rd1 на P14.Данные представляют собой среднее значение ± SEM
.В соответствии с результатами пространственно-временной характеристики дегенерации S- и M / L-конусов, наблюдалось заметное расхождение в составе конусов между верхним (Рис. 8, Дополнительный файл 12) и нижним (Рис. 8, Дополнительный файл 13) сетчатка на P60. Верхняя сетчатка на P60 состояла из большинства двойных колбочек (53,7%), за которыми следовали настоящие M / L-колбочки (38,1%) и немногочисленная популяция настоящих S-колбочек (8,2%). Напротив, нижняя сетчатка на P60 содержала почти исключительно настоящие S-колбочки (97.7%) с небольшим количеством двойных колбочек (2,3%) и без идентифицируемых подлинных M / L-колбочек. Носовая (рис. 8, дополнительный файл 14) и височная (рис. 8, дополнительный файл 15) области имели сходный состав настоящих S-конусов (23,2%; 30,2%, соответственно), настоящих M / L-конусов (18,6%; 23,7% соответственно) и двойные конусы (46,3%; 58,1% соответственно). Что касается общей выживаемости колбочек в четырех квадрантах на P60, то есть комбинированного присутствия всех типов колбочек, результаты показали примерно в три раза большую общую выживаемость колбочек в нижней сетчатке (1,154,292 ± 42, 610 пикселей 2 ) по сравнению с верхней ( 342,175 ± 30,593 пикселей 2 ), носовой (402,722 ± 59,855 пикселей 2 ) и временной (390,130 ± 52,139 пикселей 2 ) квадранты.Эти результаты иллюстрируют замечательную выживаемость колбочек S-opsin + в периферических областях нижней сетчатки (см. Фиг. 8, дополнительный файл 13).
Рис. 8Гистограммы, отображающие состав популяции колбочек в верхнем ( a ), нижнем ( b ), назальном ( c ) и височном ( d ) квадрантах сетчатки Rd1 на P60. Данные представляют собой среднее значение ± SEM
.Пространственно-временная характеристика микроглиальных ответов в сетчатке Rd1
В третьей части этого исследования мы исследовали количество и активацию микроглии / макрофагов в сетчатке Rd1 с использованием хорошо охарактеризованных антител к Iba1 и CD68.Iba1 представляет собой кальций-связывающий белок, экспрессируемый покоящейся и активированной микроглией, а также инфильтрирующими макрофагами, тогда как CD68 представляет собой гликопротеин, экспрессируемый только активированной фагоцитарной микроглией и макрофагами.
Мы обнаружили, что количество Iba1 + и CD68 + микроглии / макрофагов в сетчатке целого ряда Rd1 постепенно снижалось с P21 до P300 (рис. 9). Большинство (79,1%) клеток на P21 были активными и экспрессировали как CD68, так и Iba1. Эти активированные микроглии / макрофаги имели типичную амебовидную форму с редкими дендритами.К P60 67% микроглии Iba1 + все еще присутствовали в сетчатке и только 17,6% экспрессировали CD68. Неактивная микроглия имела типичную неподвижную морфологию с длинными дендритными отростками. К P300 осталось только 33,9% микроглии Iba1 + и только 2,6% были активными и экспрессировали CD68. Следовательно, профиль активации микроглии / притока макрофагов соответствовал дегенерации S- и M / L-колбочек в сетчатке Rd1 с высокой скоростью фагоцитарной активности, происходящей в пиковый период дегенерации колбочек.
Рис. 9Характеристика микроглиальных изменений в целых количествах сетчатки мышей Rd1 от постнатального дня (P) 21 до P300. a — c Репрезентативные, с малым увеличением, изображения целых тканей сетчатки от мышей P45, иммуномеченных на CD68 (красный) и Iba1 (зеленый). d — l Типичные изображения сетчатки Rd1 из P21, P60 и P300, иммуномеченные на CD68 (красный) и Iba1 (зеленый), с большим увеличением. Морфология Iba1-положительной микроглии изменяется от активированной амебоидной формы с втянутыми отростками на P21 (стрелки) до состояния покоя с разветвленными отростками на P300 (стрелка).Масштабные линейки: a — c 500 мкм; d — l 100 мкм. m Количественная оценка количества Iba1-положительных и CD68-положительных клеток с течением времени. Данные представляют собой среднее значение ± SEM
.В поперечных срезах сетчатки Rd1 (рис. 10) большая популяция микроглии / макрофагов Iba1 + (62 клетки / мм) присутствовала в ONL и внутреннем / внешнем сегментах на P14, где происходит дегенерация фоторецепторов. Эти внешние клетки сетчатки характеризовались активированной амебоидной формой, тогда как резидентная популяция микроглии Iba + во внутренней сетчатке демонстрировала неподвижную (разветвленную) морфологию.Популяция клеток Iba1 + во внешней сетчатке была значительно уменьшена на Р21 (26 клеток / мм) и затем постепенно уменьшалась, при этом очень мало клеток Iba1 + оставалось во внешней сетчатке на Р75 (9 клеток / мм).
Рис. 10Характеристика микроглиальных изменений в поперечных срезах сетчатки мышей Rd1. a — e Репрезентативные изображения иммуномечения Iba1 у мышей C57BL / 6 дикого типа (WT) и у мышей Rd1 с 14-го по постнатальный день (P) до P75. В сетчатке WT Iba-положительная микроглия ограничена нервным волокном, внутренним плексиформным и внешним плексиформным слоями и имеет разветвленные клеточные отростки ( a , стрелка).У мышей Rd1 Iba1-положительная микроглия во внутренней сетчатке сохраняет свой разветвленный вид (b, , стрелка), но наблюдается скопление микроглии с амебовидным видом (стрелка) во внешнем ядерном слое (ONL) на P14, который совпадает с дегенерацией фоторецепторов ( b ). К P21 плотность микроглии Iba1 в ONL существенно снизилась ( c , стрелка) и продолжает снижаться в более поздние моменты времени ( d , e , стрелка). f Количественная оценка количества Iba1-положительных клеток в ONL с течением времени. Масштабная линейка = 50 мкм. GCL слой ганглиозных клеток, INL внутренний ядерный слой
границ | Соединение стержня и конуса модулирует фотопические ответы ERG в сетчатке мыши
Введение
Электроретинограмма (ЭРГ) — широко используемый неинвазивный инструмент для объективного измерения зрительной функции глаза (Heckenlively and Arden, 2006; Pinto et al., 2007; Weymouth and Vingrys, 2008).Сетчатка большинства млекопитающих содержит два типа фоторецепторов: палочки и колбочки, которые различаются своей светочувствительностью и кинетикой ответа. У полностью адаптированных к темноте животных стимуляция тусклым светом активирует только палочковидные фоторецепторы, которые можно использовать для изучения опосредованных стержнями путей сетчатки, в то время как опосредованные конусами пути сетчатки обычно изучаются с использованием адаптирующегося фонового света для насыщения стержневых фоторецепторов. Хорошо известно, что световая адаптация изменяет опосредованные конусом фотопические ответы ERG (Peachey et al., 1992а, б, 1993; Ekesten et al., 1999; Буй и Форчун, 2006). В частности, максимальная амплитуда фотопической b-волны постепенно увеличивается в процессе световой адаптации. Такой индуцированный световой адаптацией рост фотопических ERG-ответов наблюдался у нескольких видов, включая людей и мышей (Burian, 1954; Armington and Biersdorf, 1958; Gouras and MacKay, 1989; Peachey et al., 1993). Однако механизм того, как световая адаптация вызывает изменения в ответе ERG, все еще обсуждается (Alexander et al., 2006). Недавно было высказано предположение, что разделение щелевых контактов между фоторецепторами палочки и колбочки в сетчатке может способствовать усилению фотопической ЭРГ во время световой адаптации (Heikkinen et al., 2011; Bush et al., 2019).
В этом исследовании мы исследовали влияние световой адаптации на фотопическую ERG мышей и роль разъединения щелевых соединений. В сетчатке млекопитающих коннексин 36 образует щелевые соединения между фоторецепторами, которые опосредуют соединение палочка-колбочка (Bloomfield and Völgyi, 2009; Zhang et al., 2015; Bolte et al., 2016; Джин и Рибелайга, 2016). Чтобы проверить гипотезу о том, что изменения амплитуды ЭРГ во время световой адаптации отражают модуляцию связи палочки-колбочки в сетчатке, мы зарегистрировали фотопические ответы ЭРГ у мышей с нокаутом коннексина 36 (Cx36KO) и в глазах, которым вводили меклофенамовую кислоту (MFA). блокиратор щелевых соединений. Кроме того, мы также проследили амплитуды фотопических ответов ERG с возрастом у мышей rd10 во время прогрессирующей потери ими палочкообразных фоторецепторов.
Соединение стержень-колбочка служит вторичным путем для сигнала стержня в сетчатке млекопитающих (Deans et al., 2002; Völgyi et al., 2004; Файн и Сампат, 2018). Этот вторичный палочковый путь активирует подгруппу ганглиозных клеток сетчатки и обеспечивает зрение в мезопических условиях (Völgyi et al., 2004). В этом исследовании мы использовали мерцание ERG для изучения функционального преимущества соединения стержень-колбочка в сетчатке млекопитающих. Ранее мы показали, что зависимость частотной характеристики для ответов ЭРГ может быть определена гармоническими ответами на одиночный импульсный фликкер-стимул (Qian and Shah, 2011). Импульсный фликкер-ответ ERG, зарегистрированный у мышей дикого типа и мышей Cx36KO, указывал на усиление сигнала от фоторецепторов к внутренней сетчатке через соединение стержень-конус в мезопических условиях.
Материалы и методы
Экспериментальные животные
Все процедуры с участием животных проводились в соответствии с утвержденным протоколом NIH по уходу за животными и руководящими принципами ARVO по гуманному использованию животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Мыши с нокаутом коннексина 36 (Cx36KO) были созданы из штамма C57BL6 доктором Дэвидом Полом (Deans et al., 2001) и содержались группой доктора Джеффри Даймонда в Национальном институте неврологических расстройств и инсульта, NIH. Мыши C57BL / 6J (WT) и rd10 были получены от Jackson Labs (Бар-Харбор, Мэн, США).Всех мышей содержали в обычных помещениях для животных при цикле свет / темнота 50 люкс 14:10 ч.
Запись электроретинограммы
Все процедуры проводились при тусклом красном свете. Мышей адаптировали к темноте в течение ночи (~ 20 ч) и вводили анестезию внутрибрюшинно. введение смеси кетамина (100 мг / кг) / ксилазина (6 мг / кг). Зрачки были расширены с помощью 2% тропикамида и 0,5% фенилэфрина. Животных помещали на нагревательную пластину, чтобы поддерживать температуру тела 37 ° C. Фотопические ЭРГ-ответы регистрировали с помощью системы Espion E2 (Diagnosys), соединенной либо с обычным колордомом с четырьмя светодиодами (синий, 455 нм; зеленый, 516 нм; янтарный, 595; и красный, 636 нм), либо с ультрафиолетовым колордомом с синим светодиодом. заменен УФ-светодиодом (367 нм).Ответы регистрировали с помощью проволочного электрода с золотой петлей, помещенного в центре роговицы, электрода сравнения во рту и заземляющего электрода в хвосте. Фотопические ЭРГ были зафиксированы через 0, 5, 10 и 15 мин после появления адаптивного света (зеленый, 20 кд / м 2 ) до серии увеличивающихся (<4 мс) интенсивностей вспышек (0,3, 1, 3). , 10, 30 и 100 кд.с / м 2 для зеленых вспышек, 338, 1,13 × 10 3 , 3,38 × 10 3 , 1,13 × 10 4 , 3,38 × 10 4 , 1 .13 × 10 5 фотонов / мкм 2 для УФ-вспышек). ЭРГ с мерцанием пульса регистрировали с помощью цепочки зеленых вспышек с частотой 6 Гц, подаваемых с частотой 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5 и 10 кд.с / м 2 .
Интравитреальная инъекция
Интравитреальных инъекций выполняли в соответствии с опубликованным протоколом (Qian et al., 2008). Все процедуры проводились при тусклом красном свете. Адаптированных к темноте мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (6 мг / кг) и одной капли 0.На роговицу наносили местный анестетик 5% тетракаина. Один микролитр препарата (MFA, 200 мкМ) вводили в стекловидное тело мыши. Инъекции проводили через склеру на носовой стороне глаза примерно на 1 мм кзади от лимба с помощью шприца Nanofil 10 мкл со съемной иглой 35-го размера (World Precision Instruments, Inc., Сарасота, Флорида, США). Концентрация MFA в стекловидном теле была оценена как 10 мкМ, исходя из предположения, что полная смесь и объем стекловидного тела составляет ~ 20 мкл для глаза мыши (Wang et al., 2015). Фосфатный буферный раствор (PBS) использовали в качестве контроля инъекции. Регистрацию ЭРГ проводили через 2 ч после инъекции у животных, содержащихся в темноте.
Анализ данных и статистический анализ
Было записаноответов ERG для обоих глаз мышей, и для анализа использовались усредненные значения. Данные «интенсивность-реакция» соответствовали уравнению Нака-Раштона:
R = RmaxInIn + Kn, где R max — максимальная амплитуда отклика, I — интенсивность вспышки, n — коэффициент Хилла, а K — константа полунасыщения.Колебательные потенциалы (ОП) выделялись с помощью полосового (40–200 Гц) цифрового фильтра (Ramsey et al., 2006). Амплитуды каждой гармонической составляющей для импульсных мерцаний ERG-ответов были получены из дискретного преобразования Фурье с использованием Matlab Signal Processing Toolbox (The Mathworks, Бостон, Массачусетс, США) из каждой 10-секундной записи формы волны ERG (Shah et al., 2010). ). Данные были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистические данные ( t -тест и ANOVA) выполняли с помощью Prism (версия 8, GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США).
Результаты
Влияние световой адаптации на мышь Photopic ERG
Поскольку циркадный ритм модулирует фотопическую ЭРГ и сцепление фоторецепторов (Cameron and Lucas, 2009; Sengupta et al., 2011; Jackson et al., 2012; Zhang et al., 2015), мы одновременно выполняли регистрацию ЭРГ. дня (т. е. 13:00) для всех экспериментов, описанных в этом исследовании. Рисунки 1, 2 иллюстрируют эффекты насыщающего палочки фонового света на световые реакции ERG у мышей. Поскольку сетчатка мышей содержит пигменты колбочек, чувствительные как к коротковолновой (УФ), так и к средневолновой (зеленый) длине, мы использовали как УФ, так и зеленый свет, чтобы исследовать опосредованные колбочками ответы ЭРГ.На рисунках 1A, B показаны примеры формы волны ERG, вызванной зеленым и УФ-вспышками, соответственно, в начале адаптации фонового света (зеленый 20 кд / м 2 ) в 0 мин (левые панели) и после 15 мин световой адаптации. (правые панели). Обобщенные зависимости интенсивности-отклика для амплитуд b-волн, вызванных зеленым и ультрафиолетовым фонариками, показаны на рисунках 2A, B, соответственно, через 0, 5, 10 и 15 минут после начала адаптации света. Световая адаптация изменяет как чувствительность, так и максимальную амплитуду фотопической ЭРГ мыши.Непрерывные кривые были подогнаны к уравнению Нака-Раштона со значениями полунасыщения K и R max , нанесенными в зависимости от времени световой адаптации на рисунках 2C, D, соответственно. Для значений K адаптация фона постепенно снижала чувствительность к зеленой вспышке ( p <0,0001, односторонний дисперсионный анализ), а 15-минутная световая адаптация снижала чувствительность к зеленой вспышке в 2,4 ± 0,5 раза ( n = 5 ). Напротив, чувствительность к УФ-вспышке относительно не меняется при адаптации зеленого фона ( p = 0.89, односторонний дисперсионный анализ). С другой стороны, такая же световая адаптация приводила к аналогичным улучшениям ( p = 0,92) максимальной амплитуды (R max ) фотопической ЭРГ мыши для зеленых вспышек (2,3 ± 0,3 раза), что и для УФ-вспышек (2,4 ± 0,4 раза, n = 5). Амплитуды a-волны фотопической ЭРГ также увеличивались при световой адаптации (зеленая вспышка в 1,79 ± 0,18 раза и УФ-вспышка в 1,48 ± 0,10 раза). Однако a-волна фотопической ERG содержит множество компонентов с большим вкладом от OFF-биполярных клеток в сетчатке млекопитающих (Bush and Sieving, 1994; Frishman, 2006).Кроме того, амплитуда фотопической a-волны мала, что может привести к загрязнению шума при записи. По этим причинам в данном исследовании мы сосредоточились на анализе фотопической b-волны.
Рисунок 1 . Примеры фотопической зеленой и ультрафиолетовой электроретинограммы (ЭРГ) во время световой адаптации. Примеры форм волны нормальной фотопической ERG мыши, вызванной зеленым светом (A) и UV (B) , мигают сразу (0 мин) и через 15 мин после появления адаптирующегося фонового света.Ответы на зеленые и УФ-вспышки регистрировали для одного и того же глаза мыши.
Рисунок 2 . Влияние световой адаптации на зеленый и УФ-ответы ERG. Усредненные отношения интенсивности-ответа для зеленых ответов (A) и UV (B) у нормальных мышей ( n = 5), вызванных через 0, 5, 10 и 15 минут после начала адаптации света. Данные соответствовали уравнению Нака-Раштона. Коэффициент усиления световой адаптации (LAEF) определяется как отношение амплитуд b-волн, зарегистрированных после 15-минутной световой адаптации, к амплитудам, наблюдаемым в начале адаптации света (показано в виде скобки в A ). (C) Влияние световой адаптации на коэффициент чувствительности (K) для ответов, вызываемых зеленым (левая ось) и УФ (правая ось) вспышками. (D) Влияние световой адаптации на максимальную амплитуду ответа (R max ) для ответов, вызываемых зелеными и УФ-вспышками.
Влияние соединения щелевого соединения на мышь Photopic ERG
Поскольку ответы ERG R max ERG на зеленые и УФ-вспышки демонстрировали схожее увеличение амплитуды, мы использовали ответы на зеленую вспышку для изучения механизма этого увеличения амплитуды во время световой адаптации.Было высказано предположение, что опосредованные световой адаптацией изменения в сцеплении фоторецепторов палочка-колбочка способствуют увеличению амплитуды ERG во время световой адаптации (Heikkinen et al., 2011; Bush et al., 2019). Чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали эффекты адаптации к фоновому свету на световые ответы ERG у мышей с нокаутом коннексина 36 (Cx36KO), у которых отсутствуют щелевые соединения между фоторецепторами в сетчатке (Güldenagel et al., 2001; Deans et al., 2002; Asteriti et al., 2017). На рис. 3А показаны кривые ЭРГ для зеленых вспышек в начале (0 мин) и через 15 мин после адаптации к фоновому свету.В отличие от мышей дикого типа (рис. 1A), 15-минутная световая адаптация у мышей Cx36KO оказала минимальное влияние на ответы ERG, вызванные световыми вспышками высокой интенсивности (10, 30 и 100 кд.с / м 2 ), в то время как ответы на тусклые вспышки (0,3, 1 и 3 кд.с / м 2 ) были уменьшены, что указывает на десенсибилизацию в результате световой адаптации. Усредненные отношения интенсивности-отклика, полученные после 0, 5, 10 и 15 минут световой адаптации, показаны на рисунке 3B. Непрерывные кривые показаны, подогнанные к уравнению Нака-Раштона, со значениями K и R max , показанными на рисунках 3C, D, соответственно.Значения для элементов управления WT повторно нанесены пунктирными линиями по сравнению со значениями, показанными на рисунках 2C, D. По сравнению с мышами дикого типа (WT) световая адаптация имела аналогичные эффекты в снижении чувствительности (K) фотопического ответа ERG у мышей Cx36KO. Нет статистической разницы в значениях K между мышами WT и Cx36KO в любой момент времени во время световой адаптации (рис. 3C). С другой стороны, мутация коннексина 36 устранила вызванное световой адаптацией усиление максимальной амплитуды (R max ; фигура 3D) по сравнению с мышью WT.
Рисунок 3 . Влияние световой адаптации на световые ответы ERG мышей Cx36ko. (A) Примеры фотопической формы волны ERG, вызванной от мыши Cx36ko зелеными вспышками сразу (0 мин, красные следы) и через 15 мин после начала (черные следы) адаптирующегося фонового света. (B) Усредненные отношения интенсивности-отклика через 0, 5, 10 и 15 минут после начала адаптации света. Данные соответствовали уравнению Нака-Раштона с параметрами K, показанными в (C) , и R max , показанными в (D) .Пунктирными линиями обозначены данные для мышей WT, отображенные на фиг. 2. ** p <0,01; *** р <0,001.
Чтобы количественно оценить увеличение амплитуды b-волны ERG во время световой адаптации, мы вычислили отношение амплитуд b-волны, записанных после 15-минутной световой адаптации, к амплитудам, наблюдаемым в начале адаптирующегося света, что называется коэффициентом усиления световой адаптации LAEF (как ранее показано на рисунке 2A). Для мышей C57b / 6J дикого типа LAEF в среднем составлял 2,64 ± 0,29 ( n = 5).У мышей Cx36KO световая адаптация мало влияла на амплитуды b-волн, со средним LAEF 1,136 ± 0,18 ( n = 6; Рисунок 4B). Точно так же интравитреальная инъекция MFA, блокатора щелевых соединений, также значительно снизила эффекты световой адаптации на амплитуды b-волн ERG у мышей WT, с LAEF 1,42 ± 0,28 ( n = 5), что значительно отличалось ( p <0,05), чем LAEF контрольных животных, которым вводили физиологический раствор (LAEF = 2,23 + 0,33, n = 4; Рисунок 4B).Осциллограммы ERG у мыши, интравитреально инъецированной MFA с интенсивностью 100 кд.с / м 2 вспышек показаны на Фигуре 4A (левая панель) в начале (0 мин) и через 15 минут после адаптации к фоновому свету. С другой стороны, не наблюдалось статистической разницы в значениях LAEF между контрольными группами, которым вводили физиологический раствор, и контролями без инъекций ( p = 0,56; фигура 4B). Кроме того, ERG, записанная у мышей, которым вводили MFA, показала значительно большую амплитуду (107,9 ± 7,3 мкВ, p <0,01), чем у контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор (70.3 ± 7,7 мкВ).
Рисунок 4 . Фактор усиления световой адаптации B-волны (LAEF). LAEF определяется как отношение максимальной амплитуды, возникающей после 15-минутной световой адаптации, к амплитуде, наблюдаемой в начале адаптирующего света. (A) Примеры формы волны ERG, вызванной 100 кд.с / м 2 вспышек на 0 и 15 мин световой адаптации для мышей, которым интравитреально инъецировали меклофенамовую кислоту (MFA), rd10 на P21 и rd10 на P31. (B) LAEF, полученное при каждом условии: контроль, n = 5; Cx36KO, n = 6; MFA, n = 5; P21 rd10, n = 8; P31 rd10, n = 8. (C) Влияние продолжительности адаптации к темноте на LAEF: 20 ч (то же, что и контроль в A ), n = 5; 30 мин, n = 4; 1 ч, n = 3. * p <0,05; ** p <0,01; *** р <0,001.
Эффекты дегенерации стержневых фоторецепторов на Photopic ERG у мышей
Если соединение палочкообразных фоторецепторов способствует изменениям, наблюдаемым на фотопической ERG мышей во время световой адаптации, уменьшение щелевых контактов, таких как во время дегенерации палочковидных фоторецепторов, также должно изменять эффекты световой адаптации на фотопические ERG-ответы.Мы исследовали влияние световой адаптации на фотопические ответы ERG мышей rd10, широко используемой мышиной модели дегенерации сетчатки (Chang et al., 2002; Zhao et al., 2015; Li et al., 2018). Пример сигналов ЭРГ от мыши rd10 на P21 (средняя панель) и P31 (правая панель) до 100 кд.с / м 2 вспышки в начале (0 мин) и через 15 мин после адаптации фонового освещения показаны на рисунке 4A. . На P21 у мышей rd10 большие участки палочковидного фоторецептора сохраняются в сетчатке (Zhao et al., 2015; Li et al., 2018), а фотопическая ERG показала такое же усиление b-волны, что и контроль дикого типа, с LAEF 2,55 ± 0,19 ( n = 8, p = 0,99; Рисунок 4B). Однако на P31 большая часть палочковых фоторецепторов в сетчатке мышей rd10 дегенерировала (Zhao et al., 2015; Li et al., 2018), и наблюдалось значительно сниженное усиление b-волны (LAEF 1,54 ± 0,12, p <0,001; рис. 4B), предполагая, что LAEF зависит от количества неповрежденных щелевых контактов между фоторецепторами палочки и колбочки в сетчатке.В соответствии с этим представлением амплитуды b-волн фотопической ЭРГ в начале световой адаптации были больше для мышей P31 rd10 (139,3 ± 19,1 мкВ), чем ответы, вызванные при P21 (113,3 ± 16,7 мкВ), хотя разница не наблюдается. статистически значимо ( p = 0,16). После 15-минутной световой адаптации амплитуды b-волн на P31 были меньше (227,4 ± 24,9 мкВ, p = 0,17), чем ответы на P21 (259,5 ± 21,1 мкВ), скорее всего, из-за дегенерации фоторецепторов колбочек.
Влияние продолжительности адаптации к темноте на фотопическую реакцию ERG мыши
Поскольку модуляция щелевого перехода фоторецептора имеет медленный ход времени, мы исследовали влияние различной продолжительности адаптации к темноте на LAEF. Контрольные мыши, показанные в предыдущем разделе, адаптировались к темноте в течение ночи (около 20 часов). Световая адаптация увеличила амплитуды b-волн в 2,64 ± 0,29 раза ( n = 5). Гораздо меньший LAEF B-волны наблюдался у мышей, использующих более короткое время адаптации к темноте (рис. 4C).Когда мышей адаптировали к темноте всего за 30 минут до регистрации ERG, LAEF = 1,55 ± 0,42 ( n = 4). Это снижение статистически значимо ( p <0,05). Увеличение времени адаптации к темноте также увеличивало усиление адаптации к свету (LAEF). После 1 часа адаптации к темноте LAEF увеличился до 1,83 ± 0,07 ( n = 3, p <0,05), но все еще был намного меньше, чем значение, наблюдаемое после адаптации к темноте в течение ночи (Рисунок 4C). Односторонний анализ ANOVA объединенного набора данных показывает, что LAEF значительно зависит от времени адаптации к темноте ( p <0.05).
Влияние соединения щелевого соединения на фликкер ERG
Соединение стержень-колбочка служит вторичным сигнальным путем стержня в сетчатке. Мы использовали импульсную фликкерную ERG, чтобы исследовать, как на временные свойства зрительной системы влияет связь фоторецепторов. Как описано ранее (Qian and Shah, 2011), одиночный импульс мерцания состоит из серии гармоник, каждая из которых имеет одинаковую энергию. Следовательно, однократный импульс мерцания может обеспечить частотно-частотную зависимость для ответов ЭРГ менее 30 Гц.На рисунке 5A показаны примеры мерцания сигналов ERG при трех уровнях интенсивности вспышки для мыши WT (левая панель) и Cx36KO (средняя панель). Для сравнения формы волны ЭРГ на правой панели рисунка 5А показаны нормализованные по амплитуде формы волны мерцания ЭРГ. Для ответов, вызванных либо тусклыми (верхний ряд), либо яркими (нижний ряд) вспышками, формы сигналов ERG от мышей WT и Cx36KO были очень похожи. С другой стороны, для ответов, вызванных мезопическими вспышками (средний ряд), мерцание ERG, записанное от WT (указано стрелками), имело гораздо более узкую форму волны, чем те, которые были записаны от мышей Cx36KO.
Рисунок 5 . Мерцающие ответы ERG. ERG-ответы, вызванные импульсным мерцанием с частотой 6 Гц у мышей дикого типа и мышей Cx36KO. (A) Примеры формы волны мерцания ERG при трех интенсивностях стимула для мыши WT (левая панель) и мыши Cx36KO (средняя панель). Нормированные по амплитуде формы волны показаны на правой панели, иллюстрируя более узкую форму волны ответа для WT (указана стрелками), чем у Cx36KO, вызванного мезопическим световым стимулом (средний ряд). (B) Амплитуда основной частоты (6 Гц). (C) Отношение 4-й гармоники (24 Гц) к основной амплитуде отклика. В то время как интенсивности как скотопической, так и фотопической вспышки показали схожую 4-ю гармоническую составляющую для мышей WT ( n = 6) и Cx36KO ( n = 4), существует гораздо более высокая 4-я гармоническая составляющая для WT и мезопических интенсивностей света, чем у мышей. Мыши Cx36KO. * p <0,05.
Для лучшего количественного определения мерцания ERG-ответов был проведен анализ частотных компонентов мерцания ERG (Qian and Shah, 2011).Отношения интенсивности-отклика основной амплитуды, вызванной частотой импульсов 6 Гц с увеличением интенсивности вспышки зеленого светодиода у мышей дикого типа и мышей Cx36KO, показаны на рисунке 5B. Подобно их отличиям от вспышки ERG от WT (рис. 3D), мыши Cx36KO имеют несколько меньшие амплитуды ответа ERG на мерцание при разных адаптационных фонах. Взаимосвязь интенсивности-ответа для обеих мышей демонстрирует сходную картину и может быть разделена на три области. Для интенсивностей вспышек в скотопической области (менее 0.02 кд.с / м 2 ), амплитуды отклика увеличивались с интенсивностью вспышки, а основные амплитуды достигли пика на уровне 0,02 кд.с / м 2 , что указывает на активацию пути первичного стержня в сетчатке. Для интенсивностей вспышек в мезопической области (0,02–0,5 кд.с / м 2 ) амплитуды отклика уменьшаются с интенсивностью вспышки, указывая на постепенное насыщение пути первичного стержня. Здесь ответ мышей WT был больше, чем у Cx36KO. Для яркости вспышки в фотопической области (> 0.5 кд.с / м 2 ), мерцание снова увеличивается с интенсивностью стимула, указывая на активацию колбочек в сетчатке (Lei, 2012). Мы использовали отношение четвертой гармоники (24 Гц отклика) к основной в качестве показателя для исследования временных свойств мерцания ERG-ответа, вызванного различной интенсивностью стимула, и результаты показаны на рисунке 5C. Отношения были намного меньше для ответов, вызванных скотопическими стимулами (все меньше 0,05), тогда как ответы, вызванные фотопическими стимулами, были намного выше (все больше 0.2), что согласуется с тем, что колбочковые пути имеют гораздо лучшие временные ответы, чем первичный стержневой путь в сетчатке. Кроме того, у мышей Cx36KO и WT были сходные значения гармонического отношения для световых стимулов в скотопической и фотопической областях, что указывает на то, что у этих двух мышей используются сходные пути первичных стержней и колбочек. С другой стороны, для световых стимулов в мезопической области отношения были постоянно выше у мышей WT, чем у мышей Cx36KO, что указывает на то, что вторичный сигнальный путь стержня через соединение стержень-конус обеспечивает усиленные временные ответы на сигнал стержня в зрительная система.
Влияние адаптации фона на колебательные потенциалы
При сравнении фотопических сигналов ERG, записанных у мышей дикого типа и мышей Cx36KO, примеры их нормализованных ответов показаны на рисунке 6A, одно из основных различий — это амплитуда вейвлетов OP, наложенных на их b-волну ERG. Фотопические ERG-ответы мышей с полосовой фильтрацией на 100 кд.с / м 2 зеленых вспышек использовали для исследования OP в форме волны ERG. Ответы на максимальную интенсивность стимула были выбраны, чтобы избежать осложнений, связанных с изменением как чувствительности, так и амплитуды во время световой адаптации.Усредненные OP, суммированные из 6 вейвлетов для мышей дикого типа и мышей Cx36KO после 15-минутной световой адаптации, показаны в виде гистограммы на фиг. 6B. В ответах ERG мышей дикого типа количество OP было значительно выше, чем у мышей, лишенных коннексина 36 ( p <0,001). Эта разница сохранялась даже после нормализации их амплитуд b-волн (0,84 ± 0,07 для WT и 0,32 ± 0,07 для Cx36KO, p <0,0001).
Рисунок 6 . Влияние световой адаптации на амплитуды колебательного потенциала (ОП). (A) Сравнение форм волны ERG, вызванных 100 кд.с / м 2 вспышек и нормализованных к их соответствующей амплитуде b-волны от мыши WT и Cx36KO, демонстрируя разницу в амплитудах OP в ответах. (B) Усредненные амплитуды OP (суммированные из первых шести вейвлетов) для ответов, вызванных от мышей WT ( n = 5) и Cx36KO ( n = 6). (C) Примеры формы волны OP мыши WT и Cx36KO, цифровой изолированной от ответов ERG через 0, 5, 10 и 15 мин после появления адаптирующегося света. (D) Усредненные амплитуды b-волны ERG и OP WT и OP Cx36KO во время световой адаптации ( n = 5). ** p <0,01; *** p <0,001 для разницы амплитуд ОП между мышами WT и Cx36KO. (E) ERG b-волна и OP мышей WT, нормализованные к значению во время адаптации света. Также показаны отношения ОП к амплитудам b-волн.
У мышей WT амплитуды ОП также увеличиваются с адаптацией к свету.На рисунке 6C показаны примеры формы волны OP, полученной от WT и мыши Cx36KO, записанной на 0, 5, 10 и 15 мин световой адаптации. Суммарные размах амплитуд первых четырех пиков OP были нанесены на график на фиг. 6D; вместе с измеренными амплитудами b-волн для WT. Для мышей WT ответы OP демонстрировали аналогичную тенденцию постепенного увеличения амплитуды во время световой адаптации, тогда как ответы OP мышей Cx36KO сохранялись на относительно постоянном уровне во время световой адаптации. На рисунке 6E представлены графики ответов WT, нормализованные к их значению во время появления фона ( t = 0), снова иллюстрирующие аналогичные эффекты световой адаптации на амплитуды OP и b-волн в WT.Следовательно, световая адаптация мало влияла на соотношение суммированных амплитуд OP и b-волны у мышей WT. Поскольку было показано, что ОП флеш-ЭРГ возникают в проксимальных отделах сетчатки из-за участия тормозящего внутреннего контура сетчатки (Wachtmeister and Dowling, 1978; Wachtmeister, 1998, 2001), эти результаты предполагают, что фоновая адаптация оказывает незначительное дополнительное влияние на внутреннюю сетчатку. ответы сетчатки, измеренные OP.
Обсуждение
В этом исследовании мы исследовали эффекты фонового адаптационного света, насыщающего палочки, на фотопическую ERG у мышей.Наши результаты по b-зубцу ЭРГ показывают, что во время световой адаптации происходит постепенное снижение ее чувствительности (K) и увеличение амплитуды ответа (R max ; Рисунки 1, 2). За исключением небольшой доли настоящих S-колбочек (около 5% от общей популяции колбочек), большинство фоторецепторов колбочек мыши (M-колбочки) экспрессируют как УФ, так и зеленые опсины, что выявлено с помощью иммуноокрашивания и электрофизиологических записей (Любарский и др., 1999; Applebury et al., 2000; Haverkamp et al., 2005; Никонов и др., 2005). Следовательно, снижение чувствительности наблюдалось только для ответа, вызванного зеленым светом, но не для ответа, вызванного УФ-светом, что указывает на минимальное перекрестное взаимодействие между опсин-опосредованными зелеными и УФ-конусами сигнальными путями в М колбочки в сетчатке мыши. С другой стороны, как зеленый, так и УФ-ответы ERG были одинаково усилены во время световой адаптации, предполагая, что может быть задействован общий механизм увеличения амплитуды фотопической ERG.Кроме того, ОП фотопической ЭРГ следовали за тем же ходом времени увеличения амплитуды с адаптацией, что и волна b (рис. 6), что позволяет предположить, что модуляция фотопической реакции ЭРГ адаптацией к фоновому свету преобладает за счет изменений этих ответов, происходящих во внешнем пространстве. сетчатка.
Было высказано предположение, что индуцированные светом изменения в соединении стержень-колбочка в сетчатке вносят вклад в изменения светового ответа ERG во время световой адаптации (Heikkinen et al., 2011; Bush et al., 2019).Тем не менее, щелевые соединения широко распространены в сетчатке млекопитающих (O’Brien and Bloomfield, 2018). Помимо образования щелевых соединений между фоторецепторами, Cx36 также экспрессируется в амакринных клетках AII и опосредует связывание амакриновых клеток между AII и связывание между клетками AII и ON-биполярными клетками. Электрическое соединение между амакриновыми клетками AII и биполярными клетками колбочек служит основным сигнальным путем стержня (Hartveit and Veruki, 2012). Кроме того, MFA также является неизбирательным блокатором щелевых контактов.Хотя это исследование явно не предоставило прямых доказательств роли связи стержень-конус, наши результаты согласуются с гипотезой о том, что изменение электрической связи фоторецепторов модулирует изменения фотопической реакции ERG во время световой адаптации.
После длительной адаптации к темноте щелевые контакты между фоторецепторами палочки и колбочки открываются, что обеспечивает электрическую связь между обоими типами фоторецепторов (Li et al., 2013; O’Brien, 2019). В темноте фотоответы, инициированные фоторецепторами колбочек, будут шунтироваться на палочки, и только часть сигнала будет передаваться на внутреннюю сетчатку.Во время световой адаптации щелевые контакты между фоторецепторами палочки и колбочки постепенно закрываются, и больше фотоответа колбочек поступает во внутренние нейроны сетчатки. В этом исследовании мы дополнительно подтверждаем эту гипотезу (рисунки 3, 4). Во-первых, у мышей Cx36KO, у которых отсутствуют щелевые соединения между фоторецепторами (Güldenagel et al., 2001; Deans et al., 2002; Abd-El-Barr et al., 2009), отсутствует усиление светового ответа ERG на свету. приспособление. Во-вторых, усиление фотопических ответов ERG было значительно снижено внутриглазной инъекцией MFA, блокатора щелевого соединения при соединении стержень-конус.В-третьих, способность индуцированного световой адаптацией (LAEF) увеличения фотопической ERG прогрессивно снижается у мышей rd10, когда происходит потеря значительной части палочковых фоторецепторов. Интересно отметить, что хотя палочковые фоторецепторы уже начали дегенерировать на P21 в сетчатке rd10 (Zhao et al., 2015; Li et al., 2018), аналогичный LAEF наблюдался у мышей WT (Рисунок 4A). Вполне вероятно, что только первое кольцо палочковых фоторецепторов непосредственно рядом с колбочками могло действовать как сток для фотоответов колбочек.Следовательно, даже несмотря на то, что большое количество палочек дегенерировало на P21 для сетчатки rd10, все еще существует значительное количество палочек непосредственно рядом с каждым фоторецептором колбочек, как у мышей WT. На P31 палочковые фоторецепторы сильно дегенерируют у мышей rd10, и LAEF значительно снижается.
Индуцированная светом модуляция связывания фоторецепторов опосредуется изменением фосфорилирования белков коннексина 36 в этих клетках (Li et al., 2013; O’Brien, 2019). Такие изменения фосфорилирования происходят медленно.Точно так же мы также заметили медленные изменения LAEF во время адаптации к темноте. После 1-часовой адаптации к темноте, LAEF составляет лишь половину от того, что наблюдается после адаптации к темноте в течение ночи у мышей WT. С другой стороны, возможно, что дефосфорилирование еще не идентифицированной фосфатазой может разъединять щелевые соединения палочка-колбочка с относительно более быстрым течением времени (O’Brien, 2019), поскольку во время фотопической реакции ERG наблюдаются значительные изменения. 15 мин световой адаптации (рисунки 1, 2).
Соединение стержень-колбочка обеспечивает вторичный сигнальный путь стержня в сетчатке млекопитающих (Deans et al., 2002; Völgyi et al., 2004; Файн и Сампат, 2018). Этот вторичный путь стержня позволяет сигналу стержня использовать быстро реагирующие конические контуры внутренней сетчатки (Nelson, 1977). Следовательно, зрительная система демонстрирует более высокие временные ответы в мезопических условиях с неповрежденным этим путем, чем при использовании простой смеси палочко-конусных путей (рис. 5). Активность этого вторичного палочкового пути была также показана на фликкер-ERG-ответах человека (Bijveld et al., 2011; Park et al., 2015).Кроме того, вторичный палочковый путь питается субнабором ганглиозных клеток сетчатки и обеспечивает повышенную светочувствительность в мезопических условиях (Völgyi et al., 2004).
Одним из заметных различий в форме волны ERG, вызванной WT и Cx36KO, является значительное снижение OP у мышей KO (Рисунки 6A, B). OP представляют собой высокочастотные колебания, движущиеся на b-волне ERG, которые опосредуются тормозными цепями во внутренней сетчатке (Wachtmeister and Dowling, 1978; Wachtmeister, 1998, 2001). Интересно отметить, что у мышей Cx36KO также отсутствуют высокочастотные колебания (гамма-волны) в головном мозге (Hormuzdi et al., 2001). С другой стороны, для ERG-ответов, вызванных от мышей WT, доля OP в форме волны существенно не изменяется во время световой адаптации (рис. 6). Есть несколько возможностей объяснить эти наблюдаемые результаты. Вызванное световой адаптацией снижение связи щелевых соединений может не совпадать с полным удалением электрических связей между нейронами, как у мышей KO. Кроме того, мыши KO врожденно лишены связи по щелевому соединению, что может изменять развитие нейронной цепи и модифицировать путь, который генерирует OP для flash ERG.
В этом исследовании мы представили новый подход к неинвазивному измерению динамики щелевого соединения стержень-конус в интактных глазах. Наше исследование предоставляет дополнительные доказательства, подтверждающие, что изменения фотопической ЭРГ, наблюдаемые во время световой адаптации, в значительной степени опосредуются модуляцией связи стержень-конус. Величина увеличения фотопической амплитуды ЭРГ во время световой адаптации может быть использована в качестве клинического показателя для неинвазивного изучения динамики соединения щелевого соединения стержень-колбочка в интактных глазах.
Заявление о доступности данных
Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок.
Заявление об этике
Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Комитетом по уходу и использованию животных Национального института глаз (NEI).
Авторские взносы
YL задумал исследование, провел эксперименты, проанализировал данные и подготовил рукопись для интеллектуального содержания. ЭК оказал помощь в разработке и завершении эксперимента, проанализировал данные и подготовил рукопись для интеллектуального содержания.Штаб-квартира задумала исследование, оказала помощь в разработке и завершении эксперимента, проанализировала данные и подготовила рукопись для интеллектуального содержания.
Финансирование
Эта работа была поддержана программой очных исследований в Национальном глазном институте (EY000503 и EY000530).
Заявление об ограничении ответственности
Упоминание коммерческих продуктов, их источников или их использования в связи с материалами, приведенными в данном документе, не должно толковаться как фактическое или подразумеваемое одобрение таких продуктов Министерством здравоохранения и социальных служб.
Конфликт интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
Hua Tian из Национального института неврологических расстройств и инсульта / NIH предоставил мышей Cx36KO, используемых в этом исследовании.
Список литературы
Абд-Эль-Барр, М. М., Пеннеси, М. Э., Сашик, С. М., Барроу, А. Дж., Лем, Дж., Брамблетт, Д.E., et al. (2009). Генетическое рассечение палочковидных и колбочек в сетчатке адаптированных к темноте мышей. J. Neurophysiol. 102, 1945–1955. DOI: 10.1152 / jn.00142.2009
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Александр, К. Р., Рагурам, А., Раджагопалан, А. С. (2006). Конусная фототрансдукция и рост b-волны ERG при световой адаптации. Vision Res. 46, 3941–3948. DOI: 10.1016 / j.visres.2006.04.015
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Эпплбери, М.Л., Антох, М. П., Бакстер, Л. К., Чун, Л. Л., Фальк, Дж. Д., Фархангфар, Ф. и др. (2000). Фоторецептор колбочек мыши: один тип колбочек экспрессирует как S-, так и M-опсины с пространственным паттерном сетчатки. Нейрон 27, 513–523. DOI: 10.1016 / S0896-6273 (00) 00062-3
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Астерити, С., Гаргини, К., и Кангиано, Л. (2017). Экспрессия коннексина 36 необходима для электрического соединения палочек и колбочек мыши. Vis. Neurosci. 34: E006. DOI: 10.1017 / S0952523817000037
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бийвельд, М. М., Капперс, А. М., Римслаг, Ф. К., Хёбен, Ф. П., Фрайлинг, А. К., и ван Гендерен, М. М. (2011). Расширенный протокол ERG с частотой 15 Гц (1): вклад первичных и вторичных стержневых путей и колбочек. Док. Офтальмол. 123, 149–159. DOI: 10.1007 / s10633-011-9292-z
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Блумфилд, С.A., и Völgyi, B. (2009). Разнообразные функциональные роли и регуляция нейрональных щелевых контактов в сетчатке. Nat. Rev. Neurosci. 10, 495–506. DOI: 10.1038 / nrn2636
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Bolte, P., Herrling, R., Dorgau, B., Schultz, K., Feigenspan, A., Weiler, R., et al. (2016). Экспрессия и локализация коннексинов во внешней сетчатке мыши. J. Mol. Neurosci. 58, 178–192. DOI: 10.1007 / s12031-015-0654-y
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Буй, Б.В. и Форчун Б. (2006). Причина роста амплитуды электроретинограмм при световой адаптации у пигментированных крыс. Vis. Neurosci. 23, 155–167. DOI: 10.1017 / s0952523806232024
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Буш Р. А., Сивинг П. А. (1994). Проксимальный компонент сетчатки в a-волне фотопической ERG приматов. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 35, 635–645.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Буш, Р.А., Таникава А., Цзэн Ю., Сивинг П. А. (2019). Конусная ERG изменяется во время световой адаптации у двух мутантных мышей: последствия для взаимодействий пути палочка-колбочка. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 60, 3680–3688. DOI: 10.1167 / iovs.19-27242
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кэмерон, М. А., и Лукас, Р. Дж. (2009). Влияние фотоответа палочки на световую адаптацию и циркадную ритмичность в ЭРГ колбочек. Mol. Vis. 15, 2209–2216.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Чанг Б., Хоуз Н. Л., Херд Р. Э., Дэвиссон М. Т., Нусиновиц С. и Хекенливли Дж. Р. (2002). Мутанты по дегенерации сетчатки у мышей. Vision Res. 42, 517–525. DOI: 10.1016 / s0042-6989 (01) 00146-8
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Динс, М. Р., Гибсон, Дж. Р., Селлитто, К., Коннорс, Б. У. и Пол, Д. Л. (2001). Синхронная активность тормозных сетей в неокортексе требует электрических синапсов, содержащих коннексин 36. Нейрон 31, 477–485. DOI: 10.1016 / s0896-6273 (01) 00373-7
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Динс, М. Р., Волги, Б., Гуденаф, Д. А., Блумфилд, С. А., и Пол, Д. Л. (2002). Коннексин 36 необходим для передачи опосредованных стержнями зрительных сигналов в сетчатке млекопитающих. Нейрон 36, 703–712. DOI: 10.1016 / s0896-6273 (02) 01046-2
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Экестен, Б., Gouras, P., and Moschos, M. (1999). Конические свойства адаптированной к свету мышиной ERG. Док. Офтальмол. 97, 23–31. DOI: 10.1023 / A: 10018639
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фришман, Л. Дж. (2006). «Истоки электроретинограммы», в книге Принципы и практика клинической электрофизиологии зрения , ред. Дж. Р. Хекенливли и Дж. Б. Арден (Кембридж, Массачусетс: MIT Press), 139–183.
Гоурас П. и Маккей К. Дж. (1989). Рост амплитуды электроретинограммы колбочек человека при световой адаптации. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 30, 625–630.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Güldenagel, M., Ammermuller, J., Feigenspan, A., Teubner, B., Degen, J., Sohl, G., et al. (2001). Дефицит зрительной передачи у мышей с направленным разрушением гена щелевого соединения коннексина 36. J. Neurosci. 21, 6036–6044. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.21-16-06036.2001
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хартвейт, Э., Веруки, М.Л. (2012). Электрические синапсы между амакриновыми клетками AII в сетчатке: функция и модуляция. Brain Res. 1487, 160–172. DOI: 10.1016 / j.brainres.2012.05.060
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Haverkamp, S., Wassle, H., Duebel, J., Kuner, T., Augustine, G.J., Feng, G., et al. (2005). Изначальная цветовая система сетчатки глаза мышей — синий конус. J. Neurosci. 25, 5438–5445. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.1117-05.2005
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Heckenlively, J.Р., и Арден, Г. Б. (2006). Принципы и практика клинической электрофизиологии зрения. Кембридж, Массачусетс: MIT Press.
Google Scholar
Хейккинен, Х., Винберг, Ф., Нимарк, С., и Коскелайнен, А. (2011). Мезопический фоновый свет усиливает адаптированные к темноте колбочки ERG-вспышки в интактной сетчатке мышей: возможная роль в разделении щелевого соединения. J. Neurophysiol. 105, 2309–2318. DOI: 10.1152 / jn.00536.2010
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ормузди, С.Г., Пайс, И., ЛеБо, Ф. Э., Тауэрс, С. К., Розов, А., Буль, Э. Х. и др. (2001). Нарушение передачи электрических сигналов нарушает колебания гамма-частоты у мышей с дефицитом коннексина 36. Нейрон 31, 487–495. DOI: 10.1016 / s0896-6273 (01) 00387-7
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Джексон, К. Р., Руан, Г. Х., Асим, Ф., Абей, Дж., Гэмбл, К., Стэнвуд, Г. и др. (2012). Дофамин сетчатки опосредует различные аспекты адаптированного к свету зрения. Дж.Neurosci. 32, 9359–9368. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.0711-12.2012
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Джин, Н. Г., и Рибелайга, К. П. (2016). Прямое доказательство ежедневной пластичности электрической связи между палочковыми фоторецепторами в сетчатке млекопитающих. J. Neurosci. 36, 178–184. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.3301-15.2016
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ли, Х., Чжан, З., Блэкберн, М. Р., Ван, С. В., Рибелайга, К. П., и О’Брайен, Дж. (2013). Аденозиновые и дофаминовые рецепторы совместно регулируют связывание фоторецепторов через фосфорилирование щелевых соединений в сетчатке мышей. J. Neurosci. 33, 3135–3150. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.2807-12.2013
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ли Ю., Чжан Ю., Чен С., Вернон Г., Вонг В. Т. и Цянь Х. (2018). Светозависимые изменения структуры ОКТ в фоторецепторной дегенеративной сетчатке мышей rd 10. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 59, 1084–1094. DOI: 10.1167 / iovs.17-23011
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Любарский А. Л., Фальсини Б., Пеннеси М. Э., Валентини П. и Пью Э. Н. мл. (1999). Ультрафиолетовые и чувствительные к средним волнам ответы сетчатки колбочек мыши: возможный фенотип для совместной экспрессии фотопигментов колбочек. J. Neurosci. 19, 442–455. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.19-01-00442.1999
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Нельсон Р.(1977). У кошачьих колбочек есть стержневой ввод: сравнение характеристик реакции колбочек и горизонтальных клеточных тел в сетчатке кошки. J. Comp. Neurol. 172, 109–135. DOI: 10.1002 / cne.0106
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Никонов С. С., Даниэле Л. Л., Чжу X., Крафт К. М., Сваруп А. и Пью Э. Н. мл. (2005). Фоторецепторы Nrl — / — мышей коэкспрессируют функциональные опсины S- и M-конусов, имеющие различные механизмы инактивации. J. Gen. Physiol. 125, 287–304. DOI: 10.1085 / jgp.200409208
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
О’Брайен, Дж., И Блумфилд, С.А. (2018). Пластичность щелевых контактов сетчатки: роль в синаптической физиологии и болезни. Annu. Преподобный Vis. Sci. 4, 79–100. DOI: 10.1146 / annurev-vision-0-034133
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Парк, Дж. К., Цао, Д., Коллисон, Ф. Т., Фишман, Г.А., Макэнани, Дж. Дж. (2015). Вклады стержня и диффузора в адаптированную к темноте фликкер-электроретинограмму с частотой 15 Гц. Док. Офтальмол. 130, 111–119. DOI: 10.1007 / s10633-015-9480-3
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Пичи, Н. С., Александр, К. Р., Дерлацки, Д. Дж., И Фишман, Г. А. (1992a). Световая адаптация, стержни и человеческий конус мерцания Erg. Vis. Neurosci. 8, 145–150. DOI: 10.1017 / s0952523800009305
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Пичи, Н.С., Аракава, К., Александр, К. Р., и Марчезе, А. Л. (1992b). Быстрые и медленные изменения электроретинограммы колбочек человека при адаптации к свету и темноте. Vision Res. 32, 2049–2053. DOI: 10.1016 / 0042-6989 (92) -r
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Пичи, Н. С., Гото, Ю., Алубаиди, М. Р., и Нааш, М. И. (1993). Свойства электроретинограммы, опосредованной конусом мыши, при световой адаптации. Neurosci. Lett. 162, 9–11.DOI: 10.1016 / 0304-3940 (93) -x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Пинто, Л. Х., Инверго, Б., Шимомура, К., Такахаши, Дж. С., и Трой, Дж. Б. (2007). Интерпретация электроретинограммы мыши. Док. Офтальмол. 115, 127–136. DOI: 10.1007 / s10633-007-9064-y
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Цянь, Х., и Шах, М. Р. (2011). «Сравнение ERG конуса крысы, вызванной импульсным мерцанием и световыми стимулами, модулированными синусоидальной волной», в Electroretinograms , ed.Г. Белушич (Риека, Хорватия: InTech), 191–204.
Google Scholar
Qian, H., Shah, M. R., Alexander, K. R., and Ripps, H. (2008). В ответах ERG на мерцание колбочки крысы очевидны два различных процесса на низких и высоких временных частотах. Exp. Eye Res. 87, 71–75. DOI: 10.1016 / j.exer.2008.04.011
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Рэмси Д. Дж., Риппс Х. и Цянь Х. (2006). Электрофизиологическое исследование функции сетчатки у самок крыс с диабетом. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 47, 5116–5124. DOI: 10.1167 / iovs.06-0364
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сенгупта А., Баба К., Маццони Ф., Поздеев Н. В., Стреттой Э., Ювоне П. М. и др. (2011). Локализация рецептора мелатонина 1 в сетчатке мышей и его роль в циркадной регуляции электроретинограммы и уровней дофамина. PLoS One 6: e24483. DOI: 10.1371 / journal.pone.0024483
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Шах, М.Р., Александр, К. Р., Риппс, Х., Цянь, Х. (2010). Характеристики удвоения периода в мерцании крысиной колбочки ЭРГ. Exp. Eye Res. 90, 196–202. DOI: 10.1016 / j.exer.2009.10.006
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фёльджи Б., Динс М. Р., Пол Д. Л. и Блумфилд С. А. (2004). Конвергенция и сегрегация множественных стержневых путей в сетчатке млекопитающих. J. Neurosci. 24, 11182–11192. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.3096-04.2004
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Вахтмайстер, Л.и Доулинг Дж. Э. (1978). Колебательные потенциалы сетчатки глазного щенка. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 17, 1176–1188.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Wang, J., Mojumder, D. K., Yan, J., Xie, A., Standaert, R.F., Qian, H., et al. (2015). In vivo электроретинографические исследования роли рецепторов GABAC в обработке сигналов сетчатки. Exp. Eye Res. 139, 48–63. DOI: 10.1016 / j.exer.2015.07.002
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Уэймут, А.Э. и Вингрис А. Дж. (2008). Электроретинография грызунов: методы извлечения и интерпретации ответов палочки и колбочки. Prog. Ретин. Eye Res. 27, 1–44. DOI: 10.1016 / j.preteyeres.2007.09.003
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Чжан З., Ли, Х., Лю X., О’Брайен, Дж., И Рибелайга, К. П. (2015). Контроль суточных часов фосфорилирования коннексина 36 в фоторецепторах сетчатки мышей линии CBA / CaJ. Vis. Neurosci. 32: E009.DOI: 10.1017 / S0952523815000061
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Zhao, L., Zabel, M. K., Wang, X., Ma, W., Shah, P., Fariss, R. N., et al. (2015). Микроглиальный фагоцитоз живых фоторецепторов способствует наследственной дегенерации сетчатки. EMBO Mol. Med. 7, 1179–1197. DOI: 10.15252 / emmm.201505298
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
ИнгибированиеHDAC у мышей cpfl1 защищает дегенерирующие фоторецепторы колбочек in vivo | Молекулярная генетика человека
Аннотация
Гибель клеток конического фоторецептора, которая происходит при некоторых наследственных заболеваниях сетчатки, является разрушительной, поскольку пораженные пациенты страдают от потери точного и цветового зрения.К сожалению, эти наследственные заболевания колбочек до сих пор не поддаются лечению. Таким образом, идентификация веществ, способных блокировать или сдерживать гибель колбочек, имеет первостепенное значение. Мы изучили нейрозащитные эффекты ингибитора гистондеацетилазы, трихостатина А (TSA), на мышиной модели наследственной первичной дегенерации колбочек ( cpfl1 ). Мы показываем, что ингибирование HDAC защищает cpfl1, колбочек, in vitro, , в культурах эксплантатов сетчатки. Что еще более важно, in vivo , однократная интравитреальная инъекция TSA, значительно увеличивала выживаемость колбочек в течение 16 дней после инъекции.Кроме того, патологический, неполный паттерн миграции колбочек в сетчатке cpfl1 был значительно улучшен ингибированием HDAC. Эти находки предполагают решающую роль активности HDAC в первичной дегенерации колбочек и подчеркивают новые возможности для будущих разработок терапии дистрофий колбочек и заболеваний сетчатки, связанных с нарушением миграции колбочек.
Введение
Конические фоторецепторы в сетчатке человека отвечают за четкое зрение с высоким разрешением и цветовую дискриминацию.Наследственные дегенерации колбочек, такие как болезни Штаргардта и Беста, ахроматопсия и дистрофии колбочек, вызываются мутациями в отдельных генах и приводят к серьезным нарушениям зрения, снижению остроты зрения и потере цветового зрения. Дистрофии конуса характеризуются высокой генетической гетерогенностью с мутациями, вызывающими заболевания, по крайней мере, в 27 генах (RetNet: https://sph.uth.edu/retnet, дата последнего обращения май 2016 г.). Кроме того, генетический вклад также был предложен для сложных заболеваний, поражающих колбочки, таких как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) или диабетическая ретинопатия (DR).Независимо от генетической причины, обычным исходом заболеваний сетчатки является гибель нейрональных клеток, что дает веское основание для целенаправленных нейропротекторных подходов, которые могут предотвратить или отсрочить выполнение гибели клеток (1).
Мутантная мышь c с потерей функции одного фоторецептора ( cpfl1 ) представляет собой животную модель аутосомно-рецессивной ахроматопсии или прогрессирующей дистрофии конуса (2). Эта модель уникальна в том смысле, что она характеризуется ранним началом потери колбочек на 14-й день послеродового периода (PN14) и быстрым прогрессированием с пиком гибели клеток на PN24 (3).Ранее мы показали, что смерть фоторецепторных клеток у мышей cpfl1 , а также на девяти других животных моделях наследственной дегенерации сетчатки происходит по неапоптотическому механизму, характеризующемуся накоплением цГМФ, повышенной активностью цГМФ-зависимой протеинкиназы ( PKG), гистондеацетилаза (HDAC), поли-АДФ-рибоза-полимераза (PARP) и протеазы кальпаина, а также накопление поли-АДФ-рибозы (PAR) (4,5). Кроме того, дегенерация конуса cpfl1 также связана с заметными дефектами миграции конуса (3).
Общий механизм неапоптотической гибели клеток в различных моделях дегенерации сетчатки дает обоснование для идентификации терапевтических целей, которые могут оказаться полезными для более широкой популяции пациентов, страдающих от множества различных генетических причин (4,6). Несмотря на то, что на сегодняшний день описаны многочисленные попытки сдержать гибель клеток палочковидных фоторецепторов (6–11), об эффективном клиническом лечении первичной дегенерации фоторецепторов колбочек не сообщалось.Поскольку люди используют в основном колбочки для зрения, разработка протоколов лечения для сохранения колбочек является наивысшим приоритетом в клинической офтальмологии.
Взаимодействие между ацетилированием и деацетилированием гистонов, осуществляемое гистоновыми ацетилтрансферазами (HAT) и гистондеацетилазами (HDAC) соответственно, определяет состояние транскрипции генов в целом (12), и это также верно для генов, специфичных для фоторецепторов (13, 14). Аберрантная активность гистоновых деацетилаз связана с рядом заболеваний с очень разной этиологией, от рака до нейродегенеративных заболеваний (15).Следовательно, в современной медицине ингибирование HDAC обсуждается как один из самых многообещающих новых терапевтических подходов при различных заболеваниях (16).
В настоящем исследовании мы проверили гипотезу о том, что наследственную дегенерацию колбочек можно предотвратить или отсрочить с помощью фармакологического ингибирования HDAC. Мы оценили выживаемость фоторецепторов колбочек после ингибирования HDAC трихостатином A (TSA) in vitro на культурах эксплантатов сетчатки, полученных от животных cpfl1 , а также in vivo после интравитреальной инъекции.Мы показываем, что TSA защищает колбочки cpfl1 как in vitro, , так и in vivo . Важно отметить, что однократная инъекция TSA in vivo обеспечивала значительную защиту фоторецепторов колбочек до шестнадцати дней после инъекции. Кроме того, мы наблюдали значительное улучшение нарушения миграции колбочек, присутствующее в дегенерирующей сетчатке cpfl1 . Наше исследование подчеркивает возможность использования фармакологического ингибирования HDAC для существенной защиты колбочек при наследственной дистрофии колбочек и может способствовать будущей разработке методов лечения, направленных на сохранение фоторецепторов колбочек.
Результаты
Активность HDAC повышена в фоторецепторах
cpfl1Ранее мы показали, что дегенерация фоторецепторов колбочек cpfl1 следует неапоптотическому механизму гибели клеток, характеризующемуся повышенной активностью HDAC на пике дегенерации при PN24 (4). В этом исследовании мы оценили активность HDAC также в начале дегенерации колбочек (PN14) и обнаружили значительно больше фоторецепторов с положительной активностью HDAC в мутантной сетчатке по сравнению с диким типом (wt) (дополнительный материал, рис.S1A – F). Повышенная активность HDAC, присутствующая также в PN24, была значительно снижена после лечения TSA ( P = 0,004; дополнительный материал, рис. S1G).
Ингибирование HDAC с помощью TSA спасает дегенерирующие колбочки
in vitro Чтобы проверить, может ли ингибирование HDAC способствовать выживанию фоторецепторов колбочек, мы использовали cpfl1 долгосрочных эксплантатов сетчатки, культивированных в полностью определенных условиях в бессывороточной среде. Сетчатку cpfl1 и wt эксплантировали в начале дегенерации cpfl1 (PN14) и культивировали в течение 2 дней в обычной культуральной среде сетчатки R16 без какой-либо обработки.Затем сетчатку подвергали воздействию 10 нМ TSA каждый второй день до PN24. В необработанных эксплантатах cpfl1 почти половина колбочек была потеряна при PN24, что оценивается по процентному содержанию колбочек во внешнем ядерном слое (ONL), идентифицированном путем мечения антителом к гликогенфосфорилазе (Glyphos) (17). По сравнению с необработанными дикими эксплантатами ( n = 4), только ~ 53% колбочек все еще присутствуют в сетчатке cpfl1 , как показано на Фигуре 1 (52,91% ± 7,18 SEM, n = 7).Обработка 10 нМ TSA увеличивала процент выживших колбочек в эксплантатах cpfl1 до весовых уровней (109,76% ± 10,34, n = 6, P = 0,0023 ), указывая на почти полную защиту конусов . С другой стороны, TSA не оказал значительного влияния на фоторецепторы колбочек в культурах дикого типа (110,27% ± 23,18 SEM, n = 3).Рисунок 1.
Ингибирование HDAC защищает фоторецепторы колбочки in vitro . Долгосрочные культуры эксплантатов сетчатки от животных cpfl1, и wt животных подвергали воздействию 10 нМ TSA или контрольных условий от PN14 до PN24.Окрашивание глифосом (зеленый), специфичное для фоторецепторов колбочек, позволило предположить, что несколько колбочек выжили при PN24 в необработанных культурах эксплантатов cpfl1 ( A ), тогда как в сетчатках, обработанных TSA, наблюдалось явное увеличение количества колбочек ( B ). Обработка TSA не показала неблагоприятного воздействия на сетчатку, обработанную диким животным ( C, D ). Защитный эффект TSA на колбочки представлен на гистограмме ( E ). Планки погрешностей представляют SEM; Шкала 20 мкм. ONL-внешний ядерный слой, содержащий фоторецепторы.
Рисунок 1.
Ингибирование HDAC защищает фоторецепторы колбочек in vitro . Долгосрочные культуры эксплантатов сетчатки от животных cpfl1, и wt животных подвергали воздействию 10 нМ TSA или контрольных условий от PN14 до PN24. Окрашивание глифосом (зеленый), специфичное для фоторецепторов колбочек, позволило предположить, что несколько колбочек выжили при PN24 в необработанных культурах эксплантатов cpfl1 ( A ), тогда как в сетчатках, обработанных TSA, наблюдалось явное увеличение количества колбочек ( B ).Обработка TSA не показала неблагоприятного воздействия на сетчатку, обработанную диким животным ( C, D ). Защитный эффект TSA на колбочки представлен на гистограмме ( E ). Планки погрешностей представляют SEM; Шкала 20 мкм. ONL-внешний ядерный слой, содержащий фоторецепторы.
Интравитреальная инъекция TSA защищает дегенерирующие конусы
in vivoЭти многообещающие результаты in vitro побудили нас дополнительно оценить защитные эффекты ингибирования HDAC in vivo .Чтобы направить и оптимизировать схему лечения in vivo , мы сначала попытались предсказать потенциальный период полувыведения препарата из глаза. Модельные расчеты показали, что интравитреальный клиренс TSA в глазу кролика составляет 0,478 мл / час, а период полувыведения находится в диапазоне 1,7–3,3 часа. У мышей расчетный период полувыведения TSA в стекловидное тело был на порядок короче (около 17 минут), и ожидалось, что более 90% дозы будет выведено через 1 час после инъекции (дополнительный материал, рис.S2 и примечание 1).
Поскольку наши эксперименты с in vitro и показали, что 10 нМ TSA эффективно защищает колбочки, мы хотели проверить, будет ли такая же концентрация эффективной также и in vivo . В качестве контроля мы включили в анализ как необработанные, так и ложно обработанные глаза. В PN14 девять животных из трех разных пометов получили инъекцию 0,5 мкл 100 нМ раствора TSA в один глаз с расчетной конечной концентрацией TSA 10 нМ. В противоположные глаза ложно вводили носитель для контроля эффектов, специфичных для инъекций.Мышей умерщвляли и анализировали через 10 дней в PN24. В соответствии с нашими результатами in vitro , TSA значительно увеличил процент выживших колбочек у обработанных по сравнению с . искусственно обработанные глаза ( cpfl1, поддельный: 84,92% ± 3,1 SEM, n = 9; cpfl1 обработанный: 99,88% ± 4,83, n = 9, P = 0,026; рис. 2). Процент колбочек в глазах с имитацией инъекции был сопоставим с процентом колбочек у необработанных мышей cpfl1 ( cpfl1 : 78.24% ± 2,53 SEM, n = 8; cpfl1 фиктивный: 84,92% ± 3,1, n = 9), что позволяет предположить, что сама инъекция не влияла на выживаемость колбочек. Количество колбочек в сетчатке дикого типа, обработанной ложным или 10 нМ TSA, было таким же, как и в необработанной сетчатке дикого веса, что подтверждает наблюдение in vitro о том, что TSA в исследуемой дозе не оказывал вредного воздействия на здоровые колбочки (фиктивная масса: 102,37% ± 4.72, n = 8; вес обработанный: 106.11% ± 7.02, n = 8, рис. 2). Результаты in vivo свидетельствуют о замечательной защите дегенерирующих колбочек с помощью однократной интравитреальной инъекции 10 нМ TSA, при этом количество колбочек в обработанных сетчатках достигает 99.8% от весовых уровней. Чтобы затем проверить, может ли TSA эффективно защищать дегенерирующие колбочки при еще более низких концентрациях, мы выполнили одну интравитреальную инъекцию TSA с конечной расчетной концентрацией 1 нМ при PN14 и оценили защитные эффекты при PN24. Примечательно, что однократная обработка 1 нМ TSA дала защитный эффект, сравнимый с дозой 10 нМ (рис.2, cpfl1 фиктивный: 83,24% ± 2,92 SEM, n = 10; cpfl1, обработанный : 98,3% ± 5,25, ). n = 11, P = 0.03 ).Рисунок 2.
ИнгибированиеHDAC защищает дегенерирующие колбочки in vivo. Одной интравитреальной инъекции 1 или 10 нМ TSA в PN14 было достаточно для значительного увеличения количества cpfl1 мутантных колбочек в обработанных по сравнению с имитацией инъецированных сетчаток в PN24 ( A, B ). Кроме того, колбочки из обработанной сетчатки располагались в основном в верхней части ONL и имели заметно более длинные внутренние сегменты (стрелки) по сравнению с фиктивным лечением. In vivo обработка животных дикого типа не показала воздействия на количество колбочек, положение или структуру колбочек ( C, D ).Количественная оценка процента колбочек у необработанных, ложно обработанных и обработанных TSA (1 нМ и 10 нМ) cpfl1 и животных веса показана на гистограмме ( E ). Примечательно, что процент присутствующих шишек был аналогичен весу для обеих концентраций TSA. Масштабная шкала в a-d составляет 20 мкм. ONL-внешний ядерный слой. INL-внутренний ядерный слой, содержащий интернейроны. Слой GCL-ганглиозных клеток.
Рисунок 2.
Ингибирование HDAC защищает дегенерирующие колбочки in vivo. Одной интравитреальной инъекции 1 или 10 нМ TSA в PN14 было достаточно для значительного увеличения количества cpfl1 мутантных колбочек в обработанных по сравнению с имитацией инъецированных сетчаток в PN24 ( A, B ).Кроме того, колбочки из обработанной сетчатки располагались в основном в верхней части ONL и имели заметно более длинные внутренние сегменты (стрелки) по сравнению с фиктивным лечением. In vivo обработка животных дикого типа не показала воздействия на количество колбочек, положение или структуру колбочек ( C, D ). Количественная оценка процента колбочек у необработанных, ложно обработанных и обработанных TSA (1 нМ и 10 нМ) cpfl1 и животных веса показана на гистограмме ( E ). Примечательно, что процент присутствующих шишек был аналогичен весу для обеих концентраций TSA.Масштабная шкала в a-d составляет 20 мкм. ONL-внешний ядерный слой. INL-внутренний ядерный слой, содержащий интернейроны. Слой GCL-ганглиозных клеток.
Чтобы оценить защитный эффект ингибирования HDAC в более длительные моменты времени, мы обработали cpfl1 животных однократной интравитреальной инъекцией 10 нМ TSA и оценили выживаемость колбочек при PN30, , т.е. после пика дегенерации. По сравнению с необработанной сетчаткой дикого типа PN30 потеря колбочек у ложно обработанных cpfl1 прогрессировала дальше, на 71.Осталось 6% ± 3,77 конусов (рис. 3). Напротив, в глазах, обработанных 10 нМ TSA, даже через 16 дней после однократной интравитреальной инъекции процент колбочек был значительно выше, чем в имитационно обработанных, с 88,74% ± 2,79 колбочек все еще присутствующими ( n = 5, P = 0,007 ). Однако защитный эффект при PN30 был менее выражен, чем при PN24, с количеством выживших колбочек меньше, чем в сетчатке дикого типа ( P = 0,03 ).Рисунок 3.
Конусы Cpfl1 защищены также PN30.Выживаемость конуса была проанализирована у животных, получивших однократную интравитреальную инъекцию при PN14. В PN30 (, то есть через 16 дней после инъекции) на сетчатке с ложно обработанной cpfl1 наблюдалась сильная потеря колбочек, меченных колбочками-аррестином (зеленые; A ). Для сравнения, обработка 10 нМ TSA сохранила почти 90% колбочек ( B ), что аналогично тому, что наблюдалось у сопоставимого по возрасту веса ( C ). Защитный эффект TSA на колбочки представлен на гистограмме ( D ).Планки погрешностей представляют SEM; Шкала 20 мкм. ONL-внешний ядерный слой.
Рисунок 3.
Конусы Cpfl1 защищены также PN30. Выживаемость конуса была проанализирована у животных, получивших однократную интравитреальную инъекцию при PN14. В PN30 (, то есть через 16 дней после инъекции) на сетчатке с ложно обработанной cpfl1 наблюдалась сильная потеря колбочек, меченных колбочками-аррестином (зеленые; A ). Для сравнения, обработка 10 нМ TSA сохранила почти 90% колбочек ( B ), что аналогично тому, что наблюдалось у сопоставимого по возрасту веса ( C ).Защитный эффект TSA на колбочки представлен на гистограмме ( D ). Планки погрешностей представляют SEM; Шкала 20 мкм. ONL-внешний ядерный слой.
Чтобы понять, является ли наблюдаемое увеличение числа колбочек после обработки TSA косвенным эффектом уменьшения клиренса микроглией, мы оценили состояние микроглии, используя окрашивание против ионизированной молекулы-адаптера связывания кальция 1 (IBA1) ( 18). Хотя активированная микроглия, по-видимому, в некоторой степени присутствовала в различных слоях сетчатки, мы не обнаружили ни вторжения микроглии в ONL, ни различий в IBA1-положительных клетках с лечением TSA или без него (дополнительный материал, рис.S3). С другой стороны, защитный эффект TSA мог быть связан с задержкой созревания колбочек у cpfl1 животных. Чтобы рассмотреть эту возможность, мы также охарактеризовали статус дифференцировки колбочек, изучив экспрессию и локализацию M- и S-опсинов, а также специфичного для колбочек трансдуцина (GNAT2), который, как ранее сообщалось, аномально распределен в дегенерирующих колбочках (19 ). Хотя M-опсин был обнаружен в необработанных внешних сегментах колбочек, колбочки cpfl1 и часто демонстрировали неправильную локализацию опсина в теле клетки (рис.4G, стрелки) и синаптических окончаний (рис. 4G, стрелки). Окрашивание S-опсином выявило короткие внешние сегменты, а также неправильную локализацию опсина (фиг. 4H, стрелки) в необработанных колбочках cpfl1 , и аналогичная, но более выраженная неправильная локализация наблюдалась для GNAT2 (фиг. 4I, стрелки). Напротив, двойное окрашивание на M- и S-opsin с помощью Glyphos показало, что колбочки, защищенные TSA, имели нормальную морфологию с четко развитыми внутренними и внешними сегментами (Fig. 4J – L и P – R). Кроме того, правильно расположенные колбочки в верхней части ONL показывают, что как М-, так и S-опсин правильно локализованы в их внешних сегментах (рис.4J и K). Сходным образом в выживших колбочках GNAT2 правильно локализовался во внешних сегментах Fig. 4L. Правильная локализация опсинов колбочек и трансдуцинов колбочек позволяет предположить, что TSA-опосредованное сохранение колбочек не имело очевидных побочных эффектов на развитие и созревание колбочек.Рисунок 4.
Конус-специфические опсины и трансдуцин экспрессируются и правильно располагаются в защищенных колбочках. В необработанных сетчатках PN24 cpfl1 колбочки окрашивали Glyphos (зеленый, A — C , D — F ) и совместно локализовали с M-опсином (пурпурный, G ; слитый, M ), которая локализовалась надлежащим образом только в некоторых внешних сегментах конуса, в основном в тех, которые расположены в верхних частях ONL.В оставшихся колбочковых клетках M-опсин также неправильно локализован в том, что, по-видимому, было цитоплазмой смещенных колбочек рядом с границей с INL (стрелки) и на концах конусов (стрелки). Подобная неправильная локализация наблюдалась также с антителами, направленными против S-опсина ( H , N ) и трансдуцина (GNAT2; стрелки; I , O ). После обработки TSA стало больше не только колбочек, но и М-опсина ( J , P ), S-опсина ( K , Q ), а также GNAT2 ( L , R ) были правильно локализованы почти исключительно во внешних сегментах (PR).Масштабная линейка составляет 20 мкм. ONL-внешний ядерный слой.
Рисунок 4.
Конус-специфические опсины и трансдуцин экспрессируются и правильно располагаются в защищенных колбочках. В необработанных сетчатках PN24 cpfl1 колбочки окрашивали Glyphos (зеленый, A — C , D — F ) и совместно локализовали с M-опсином (пурпурный, G ; слитый, M ), которая локализовалась надлежащим образом только в некоторых внешних сегментах конуса, в основном в тех, которые расположены в верхних частях ONL.В оставшихся колбочковых клетках M-опсин также неправильно локализован в том, что, по-видимому, было цитоплазмой смещенных колбочек рядом с границей с INL (стрелки) и на концах конусов (стрелки). Подобная неправильная локализация наблюдалась также с антителами, направленными против S-опсина ( H , N ) и трансдуцина (GNAT2; стрелки; I , O ). После обработки TSA стало больше не только колбочек, но и М-опсина ( J , P ), S-опсина ( K , Q ), а также GNAT2 ( L , R ) были правильно локализованы почти исключительно во внешних сегментах (PR).Масштабная линейка составляет 20 мкм. ONL-внешний ядерный слой.
Ингибирование HDAC значительно улучшает нарушение миграции конуса
Ранее мы сообщали, что сетчатка cpfl1 и характеризуется нарушением миграции развивающихся колбочек (3). Окрашивание колбочек глифосом в дегенерирующей сетчатке сетчатки cpfl1 подтвердило такое аберрантное расположение колбочек, как in vitro, , так и in vivo (рис. 5). Важно отметить, что мы наблюдали улучшенную миграцию колбочек после обработки сетчатки in vitro и in vivo TSA (рис.5). Чтобы оценить степень улучшения миграции конуса, мы измерили расстояние центра отдельных ядер конуса от внешнего плексиформного слоя (OPL, рис. 5, пунктирные красные линии), который разграничивает нижнюю границу области фоторецептора. Процент расстояния миграции конуса от OPL представлен относительно толщины ONL. В случае in vitro и при PN24 вес конусов мигрировал приблизительно на 70% толщины ONL (вес необработанного: 69,25% ± 2.3 SEM, n = 3; вес обработанных: 72,66% ± 5,1, n = 3), в то время как в необработанных сетчатках cpfl1 они достигли только 55%. После обработки 10 нМ TSA сетчатки cpfl1 и в культурах эксплантов ядра колбочек достигли положения, очень похожего на положение колбочек дикого типа ( cpfl1, необработанные: 55,31% ± 3,1 SEM, n = 6; cpfl1 , обработанные: 65,95% ± 2,8, P = 0,029 ). Аналогичным образом миграция колбочек также улучшилась в сетчатке cpfl1, , in vivo, , после обработки 1 нМ TSA.Здесь колбочки были локализованы значительно дальше от внешнего плексиформного слоя ( cpfl1 необработанных: 71,68% ± 1,09 SEM, n = 10, cpfl1 обработанных: 77,18% ± 0,84, n = 11, P = 0,02 ). Сопоставимые результаты были получены после обработки 10 нМ TSA ( cpfl1 необработанных: 67,47% ± 1,92 SEM, n = 9, cpfl1 обработанных: 76,38% ± 0,73, n = 9, P = 0,0005 ).Мы не наблюдали изменений в локализации колбочек в сетчатке дикого типа после обработки TSA (вес необработанных: 86,89% ± 0,26 SEM, n = 7; вес обработанных: 85,49% ± 0,23, n = 7). Тем не менее, даже несмотря на то, что обработка TSA значительно улучшила миграцию конусов cpfl1 и , положение конусов все еще значительно отличалось по сравнению с колбочками масс ( cpfl1 1 нМ TSA: 77,18% ± 0,84 SEM по сравнению с масс без обработки: 86,89% ± 0,26, P = 0,0002 ; cpfl1 10 нм: 76.38% ± 0,73 по сравнению с мас. Без обработки: 86,89% ± 0,26, P = 0,0004 ).Рисунок 5.
Ингибирование HDAC улучшает миграцию колбочек. Cpfl1 сетчатка обнаружила неправильную локализацию конуса, как in vitro, , так и in vivo по сравнению с диким ( A — C ). В PN24 ядра колбочек были разбросаны по всей ONL в культивируемых (A) и in vivo cpfl1 мутантных сетчатках (B), тогда как в сетчатках дикого типа конусы располагались исключительно в верхней части ONL (C).Обработка TSA значительно улучшила миграцию колбочек как в парадигмах лечения in vitro, ( D ) и in vivo, ( E )), в то время как на сетчатках, обработанных диким животным ( F ), никакого эффекта не было обнаружено. Для количественной оценки расстояние миграции колбочек оценивали путем измерения расстояния между центрами ядер колбочек от внешнего плексиформного слоя (пунктирная линия) относительно толщины ONL, измеренной для каждого отдельного участка анализируемой сетчатки. Количественные оценки показывают значительное улучшение миграции колбочек in vitro, ( G ) и in vivo, ( H ) при обработке TSA.Шкала 20 мкм. ONL-внешний ядерный слой.
Рисунок 5.
Ингибирование HDAC улучшает миграцию колбочек. Cpfl1 сетчатка обнаружила неправильную локализацию конуса, как in vitro, , так и in vivo по сравнению с диким ( A — C ). В PN24 ядра колбочек были разбросаны по всей ONL в культивируемых (A) и in vivo cpfl1 мутантных сетчатках (B), тогда как в сетчатках дикого типа конусы располагались исключительно в верхней части ONL (C).Обработка TSA значительно улучшила миграцию колбочек как в парадигмах лечения in vitro, ( D ) и in vivo, ( E )), в то время как на сетчатках, обработанных диким животным ( F ), никакого эффекта не было обнаружено. Для количественной оценки расстояние миграции колбочек оценивали путем измерения расстояния между центрами ядер колбочек от внешнего плексиформного слоя (пунктирная линия) относительно толщины ONL, измеренной для каждого отдельного участка анализируемой сетчатки. Количественные оценки показывают значительное улучшение миграции колбочек in vitro, ( G ) и in vivo, ( H ) при обработке TSA.Шкала 20 мкм. ONL-внешний ядерный слой.
Ранее мы обнаружили, что высокое накопление цГМФ и повышенная активность цГМФ-зависимой протеинкиназы G (PKG) связаны с фенотипами колбочек cpfl1 (3). Чтобы выяснить, влияет ли ингибирование HDAC на активность цГМФ и PKG после десяти дней лечения TSA, мы искали накопление цГМФ и статус фосфорилирования хорошо известного субстрата PKG, белка, стимулируемого вазодилататорами (pVASP) (20), с лечением TSA и без него.Необработанные сетчатки cpfl1 обнаруживали накопление цГМФ в сегментах колбочек, а также в телах колбочек (о чем свидетельствует совместное мечение Glyphos). Не было очевидных различий в накоплении цГМФ в колбочках после обработки TSA. (Дополнительный материал, рис. S4A). Аналогичным образом, некоторые колбочки, визуализированные окрашиванием Glyphos, также были положительными на pVASP как в обработанных TSA, так и в необработанных сетчатках cpfl1 , без явных различий между ними (рис. S4B). Взятые вместе, эти результаты показали, что активность HDAC (и ингибирование TSA) действует после накопления цГМФ, индуцированного мутациями.
Обсуждение
Наследственные болезни фоторецепторов колбочек в настоящее время неизлечимы и приводят к серьезным нарушениям зрения и слепоте. Наше исследование на мышиной модели cpfl1 демонстрирует выраженную защиту колбочек после ингибирования HDAC, in vitro и in vivo и, таким образом, подтверждает, что активность HDAC причинно участвует в наследственной дегенерации фоторецепторов колбочек. Это является доказательством принципа дальнейшего развития ингибирования HDAC как нового терапевтического подхода к дистрофии колбочек.
Было обнаружено, что ингибирование HDAC вызывает гибель клеток в опухолевых клетках, происходящих от различных видов рака (21), в то время как при нейродегенеративных заболеваниях такое же лечение может продлевать выживаемость клеток (22). В сетчатке ингибиторы HDAC обсуждались как потенциальная терапевтическая стратегия при ишемическом повреждении сетчатки, при этом различные ингибиторы HDAC обеспечивают структурную и функциональную нейрозащиту после экспериментальной ишемии (23). Кроме того, было показано, что ингибирование HDAC замедляет дегенерацию фоторецепторов палочек на животной модели пигментного ретинита (24).Важно отметить, что текущие клинические испытания предполагают благоприятные эффекты лечения ингибитором HDAC у пациентов, страдающих пигментным ретинитом (25,26). Мы впервые показываем здесь, что ингибирование HDAC значительно защищает колбочки на мышиной модели наследственной дистрофии колбочек. Помимо их значения для будущего лечения редких форм дегенерации сетчатки, представленные здесь результаты могут также распространяться на общие заболевания сетчатки, включая DR и AMD, где дегенерация конуса является причиной юридической слепоты.Важным результатом нашего исследования является то, что однократное внутриглазное введение значительно защищало колбочки cpfl1 в течение как минимум двух недель после инъекции. Это неожиданно, поскольку наши расчеты клиренса TSA показали, что концентрация препарата была ниже пороговой менее чем через 2 часа, и может указывать на механизм импринтинга, помимо временного присутствия TSA. Это согласуется с предыдущими исследованиями, которые показали, что TSA приводит к устойчивому ацетилированию белка через 3 часа (13) или к транскрипционным изменениям только через 5 минут (27), подтверждая возможность эпигенетических механизмов.Молекулярный механизм, лежащий в основе лечения ингибиторами HDAC, все еще недостаточно изучен. В сетчатке cpfl1 предыдущее исследование обнаружило повышенную регуляцию передачи сигналов STAT3, что было предложено как эндогенный нейропротекторный ответ (28). Интересно, что активация STAT3 может контролироваться активностью HDAC (29).
Важно отметить, что оценка клиренса TSA показала, что дегенерация конуса была остановлена уже после кратковременного внутриглазного воздействия. Это наблюдение может быть особенно актуальным для пациентов с дистрофиями сетчатки, у которых ежемесячные интравитреальные инъекции обычно хорошо переносятся (30).Поскольку у мышей защитный эффект присутствовал в течение по крайней мере 10 дней после инъекции, грубая экстраполяция от мыши к человеку позволяет предположить, что у людей может быть достаточно интравитреального дозирования один раз в три месяца (31). В качестве альтернативы составы для местного нанесения на глаз могут минимизировать потенциальные побочные эффекты, наблюдаемые в некоторых случаях длительного системного ингибирования HDAC (26,32,33).
Развитие конусных фоторецепторов характеризуется миграцией внутри ONL, от внешней ограничивающей мембраны внутрь к OPL, а затем наружу, пока они не достигнут своего конечного положения сразу под внешней ограничивающей мембраной, начиная с PN12 (34).Дегенерация конуса на моделях мышей характеризуется не только потерей колбочек, но и неправильной миграцией конусов развития (3,35). Фактически, об отсроченной миграции колбочек также сообщалось на моделях мышей с дегенерацией палочек как косвенным следствием гибели палочек (34). Миграция фоторецепторов колбочек также происходит в развитии сетчатки человека, где в фовеа конусы мигрируют латерально к фовеальной ямке (36). Неправильное смещение конуса связано с заболеваниями сетчатки человека различной этиологии, поскольку неправильная миграция конуса может привести к фовеальной гипоплазии (37).Это наблюдается, например, у пациентов, страдающих альбинизмом (38), идиопатическим врожденным нистагмом (37), а также ахроматопсией (39). Кроме того, сообщалось о смещении конуса у пожилых пациентов, страдающих AMD (40). Мы обнаружили, что лечение TSA не только предотвращало дегенерацию колбочек, но также значительно улучшало аберрантную миграцию колбочек при дегенерации сетчатки cpfl1 . Имеются многочисленные сообщения об эффектах ингибирования миграции клеток HDAC. Эффекты ингибирования HDAC на улучшенную миграцию клеток могут происходить за счет ингибирования цитоплазматической гистондеацетилазы (HDAC6), что приводит к более высокому ацетилированию α-тубулина, необходимого для стабильности микротрубочек в мигрирующих клетках (41).С другой стороны, ингибирование HDAC может приводить к эпигенетическим изменениям, управляющим миграцией фоторецепторов, процесс, который до сих пор полностью не изучен. Обработка TSA значительно улучшила миграцию неправильно установленных конусов cpfl1 как in vitro , так и in vivo . Тем не менее, одного только ингибирования HDAC было недостаточно для полного восстановления дефекта миграции колбочек в сетчатке cpfl1 . Правдоподобное объяснение может относиться к повышенной активности PKG в сетчатке cpfl1 , как мы ранее сообщали (3).Было показано, что PKG-специфическое фосфорилирование серина 239 остатка VASP отрицательно регулирует миграцию нейронов (42). Белки семейства Ena / VASP являются регуляторами сборки актина и подвижности клеток, поскольку они локализованы в очаговых адгезиях (43). cGMP-зависимая гиперактивация PKG приводит к фосфорилированию VASP, что приводит к удалению VASP из очаговых адгезий, что способствует измененной миграции клеток (44). Наши данные предполагают, что ингибирование TSA HDAC не снижает фосфорилирование серина 239 VASP по оценке с помощью иммуноокрашивания.Возможная двойная регуляция миграции фоторецепторов колбочек, одна через сверхактивацию PKG, а другая с участием аберрантной активности HDAC, потребует дальнейших специфических исследований. Кроме того, в модели мышей cpfl1 индуцированная мутациями потеря фоторецепторов колбочек частично совпадает с постнатальным развитием сетчатки (3,45). Поскольку лечение TSA в течение третьей постнатальной недели перекрывается по времени с установлением связи сетчатки (46), необходимы дальнейшие исследования (, т. Е. Анализ ERG стержней), чтобы определить, как восстановление нормального паттерна миграции конуса развития под влиянием Ингибиторы HDAC могут изменять связность и функцию палочек.
Дегенерирующие колбочки в сетчатке cpfl1 характеризуются накоплением цГМФ как следствие нефункционального фермента фоторецептора колбочки PDE6 (3,4). Мы не наблюдали явных изменений в количестве клеток, показывающих накопление цГМФ после обработки, что указывает на то, что управляемая TSA защита колбочек, вероятно, действует ниже по течению в дегенеративном пути. Все больше данных свидетельствует о том, что PKG является одним из основных инициаторов каскада гибели фоторецепторных клеток (4,6,47).Ранее мы обнаружили, что повышенная активность PKG и HDAC была временно связана в 10 различных животных моделях наследственной дегенерации сетчатки (4). Это соответствует наблюдениям в C. elegans , где было обнаружено, что активность PKG регулирует активацию HDAC (48). Поскольку ингибирование HDAC, по-видимому, не влияет на фосфорилирование VASP в колбочках, наше исследование показывает, что во время гибели клеток активность HDAC может происходить независимо от или ниже PKG. Основные механизмы, с помощью которых ингибирование HDAC обеспечивает защиту колбочек, еще предстоит определить.
Активность HDAC также важна для развития фоторецепторов у мышей, поскольку ингибирование HDAC на раннем постнатальном развитии сетчатки (PN2) приводит к полной потере развивающихся фоторецепторов палочек (49). У мышей фоторецепторы колбочек сетчатки рождаются пренатально (45), поэтому мы не ожидаем влияния TSA на рождение колбочек, но происходит полное созревание и приверженность к синим колбочкам (S колбочек) или красным / зеленым колбочкам (M колбочек). в течение второй послеродовой недели (50). Поскольку мы выполнили ингибирование HDAC сразу после этого периода времени, мы оценили экспрессию и локализацию S- и M-опсина, чтобы выяснить, связано ли наблюдаемое увеличение выживаемости колбочек после ингибирования HDAC с задержками развития и созревания колбочек.Кроме того, мы проверили конус-специфический трансдуцин (GNAT2), член каскада фототрансдукции колбочек (51). Наблюдаемая правильная локализация опсинов колбочек и трансдуцина предполагает, что позднее постнатальное ингибирование HDAC не влияет на развитие и созревание клеток колбочек. Однако мы не можем исключить возможность того, что быстрая дегенерация колбочек cpfl1 была частично вызвана дефектами развития. В этом случае лечение TSA в критические сроки могло поддержать нормальное развитие, поскольку наблюдаемые эффекты длились более двух недель.Будущие исследования, например, на более медленно прогрессирующих моделях дегенерации колбочек, могут показать, можно ли применить защиту колбочек, опосредованную TSA и HDAC, к дегенерации колбочек в целом, независимо от стадии развития и патогенеза заболевания.
Таким образом, это исследование является первым, показывающим, что ингибирование HDAC может значительно замедлить потерю колбочек на мышиной модели дистрофии колбочек у человека. Хотя действие TSA на cpfl1, retina in vivo длится не менее одного месяца после родов, необходимы дальнейшие исследования для определения продолжительности защиты и установления долгосрочных парадигм лечения.Примечательно, что ингибирование HDAC, по-видимому, оказывает двойное влияние как на выживание колбочек, так и на миграцию колбочек без очевидных эффектов на дифференциацию и развитие колбочек. Таким образом, наше исследование обеспечивает доказательство принципа потенциала ингибиторов HDAC в качестве терапевтических средств для защиты фоторецепторов колбочек. Важно отметить, что это может быть применимо не только к наследственным дистрофиям колбочек, но, возможно, также к общим заболеваниям сетчатки, связанным с дегенерацией колбочек, таким как диабетическая ретинопатия (52,53), а также к заболеваниям, при которых дегенерация колбочек сопровождается неправильной миграцией колбочек, например возрастная дегенерация желтого пятна (40).
Материалы и методы
Животные
Cpfl1 и родственные C57BL / 6 животные дикого типа (wt) содержались при стандартном белом циклическом освещении, имели свободный доступ к пище и воде и использовались независимо от пола. Все процедуры были одобрены комитетом Тюбингенского университета по защите животных (Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde) и выполнялись в соответствии с заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических и визуальных исследованиях.Процедуры, выполненные в полистабе Университета Модены и Реджио-Эмилии (лечение in vivo на cpfl1, и животных дикого типа), были рассмотрены и одобрены местным этическим комитетом (Prot. No. 50 12/03/2010). Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму количество используемых животных и их страдания.
Иммунофлуоресценция
Retinae фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) в течение 45 мин при 4 ° C. Сагиттальные срезы 12 мкм собирали, сушили на воздухе и хранили при -20 ° C.Срезы инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами. Используемые первичные антитела были специфичными для гликогенфосфорилазы (Glyphos, разведение 1: 1000, любезно предоставлено профессором Пфайффер-Гульельми (17)), аррестина колбочки (1: 1000, AB15282, Millipore, Дармштадт, Германия), IBA1 (1: 200, 019-19741, Вако, Ричмонд, США), M-опсин (1: 200, AB5405, Millipore), S-опсин (1: 200, AB5407, Millipore), GNAT2 (1: 200, sc-390, Santa Cruz, Даллас, США), cGMP (1: 500, любезно предоставлено профессором Стейнбуш, Маастрихтский университет, Нидерланды (54)) и фосфо-VASP (Ser239) (разведение 1: 200, 0047-100 / VASP-16C2. , Nanotools, Тенинген, Германия (3,44)).В качестве вторичных антител использовали конъюгированные с Alexa Fluor 488 или 566 антитела (Molecular Probes, Inc. Eugene, США). Отрицательный контроль осуществляли, исключая первичное антитело. Специфичность мечения колбочек с помощью Glyphos была продемонстрирована совместной маркировкой агглютинином арахиса (дополнительный материал, рис. S5), хорошо зарекомендовавшим себя маркером колбочек (55).
HDAC
i Анализ активности n situ Анализы активностиHDAC были выполнены на криосрезе 4% фиксированных PFA глаз.Анализ основан на адаптации системы флуоресцентного анализа Fluor de Lys (Biomol, Гамбург, Германия). Срезы сетчатки подвергали воздействию 200 мкМ субстрата деацетилазы Fluor de Lys-SIRT2 (Biomol) с 500 мкМ NAD + (Biomol) в буфере для анализа (50 мМ Tris / HCl, 137 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 1 мМ MgCl2; pH 8,0) для 3 ч при комнатной температуре (8). Затем срезы промывали PBS и фиксировали в метаноле при -20 ° C в течение 20 мин. Слайды закрепляли проявителем (Biomol; KI105, разведенный 1:20 в буфере для анализа), содержащим 2 мкМ TSA (Sigma, Steinheim, Германия) и 2 мМ NAM (Sigma).Отрицательные контроли заключались в отсутствии субстрата (дополнительный материал, рис. S1E).
Культуры эксплантатов сетчатки
Органотипические культуры сетчатки от cpfl1, ( n = 7) и wt ( n = 4) животных, которые включали пигментный эпителий сетчатки (RPE), получали в стерильных условиях. Вкратце, животных PN14 умерщвляли, глаза энуклеировали и предварительно обрабатывали 0,12% протеиназой K (ICN Biomedicals Inc., Огайо, США) в течение 15 минут при 37 ° C в бессывороточной культуральной среде R16 (номер для заказа: 074-A; Гибко, Пейсли, Великобритания). Активность протеиназы К блокировали добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки с последующим промыванием бессывороточной средой. После этого роговица, хрусталик, склера и сосудистая оболочка были осторожно удалены, при этом к сетчатке остался только РПЭ. Затем эксплантат разрезали на четыре клина, чтобы получить структуру, похожую на лист клевера, которую переносили во вставку культуральной мембраны (Corning Life Sciences, Лоуэлл, США) с RPE, обращенным к мембране. Мембранные вставки помещали в 6-луночные культуральные планшеты со средой R16 (Gibco, Пейсли, Великобритания) и инкубировали при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 .Среду для культивирования меняли каждые 2 дня в течение 10 дней культивирования.
Эксплантаты сетчатки оставляли без обработки на 2 дня (до PN16) с последующей обработкой 10 нМ трихостатином A (TSA) (≥98% (ВЭЖХ), от Streptomyces sp., Sigma-Aldrich, St-Louis, USA). TSA растворяли в 0,2% диметилсульфоксиде (ДМСО; Sigma) и разводили в культуральной среде R16. Для контроля такое же количество ДМСО разводили в культуральной среде. Культивирование останавливали при PN24 путем фиксации в течение 2 часов в 4% PFA, криозащищали растворами сахарозы, содержащими 10, 20 и 30% сахарозы, а затем помещали в среду для замораживания тканей (Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Германия).
In vivo инъекцийЖивотных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией авертина (250 мг / кг) (1,25% (мас. / Об.), 2,2,2-трибромэтанола и 2,5% (об.)) 2-метил-2-бутанола; Sigma, Milan , IT) и согревала во время инъекций. Одиночные инъекции в стекловидное тело выполняли в PN14 в один глаз, в то время как в другой глаз имитировали фиктивную инъекцию 0,0001% ДМСО (в 0,9% растворе NaCl) в качестве контралатерального контроля. TSA (1 и 10 нМ) разбавляли в 0,9% растворе NaCl.Инъекции проводили с 0,5 мкл 10 нМ и 100 нМ TSA, чтобы получить конечную концентрацию 1 нМ и 10 нМ, соответственно, при условии, что свободный внутриглазный объем глаза мыши составляет 5 мкл (http: //prometheus.med.utah .edu / ∼marclab / protocol.html; дата последнего обращения — май 2016 г.). Одиннадцать cpfl1 животных и восемь весов из трех разных пометов использовали для интравитреальных инъекций и умерщвляли через 10 дней после обработки (PN24). Для лечения cpfl1 животных до PN30 инъекции выполняли при PN14 пяти различным животным, причем в один глаз вводили 10 нМ TSA, а в другой глаз вводили фиктивную инъекцию.Глаза были немедленно энуклеированы, зафиксированы в течение 2 часов в 4% PFA и подготовлены для криосрезов (см. «Культуры эксплантатов сетчатки»). Разделы были помечены неубедительным образом, чтобы можно было провести анализ слепым исследователем.
Микроскопия, подсчет клеток и статистический анализ
Флуоресцентную микроскопию выполняли на микроскопе Axio Imager Z1 ApoTome, оборудованном цифровой камерой Zeiss Axiocam MRm. Изображения были получены с помощью программного обеспечения Zeiss Axiovision 4.7.Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Incorporated, Сан-Хосе, Калифорния, США) использовался для первичной обработки изображений. Количественные оценки были выполнены на изображениях, снятых по крайней мере в девяти различных случайных положениях по крайней мере трех сагиттальных срезов по крайней мере четырех разных животных для каждого генотипа и лечения с использованием режима Z-stacks Axiovision 4.7 при 20-кратном увеличении. Среднюю площадь, занимаемую фоторецепторной клеткой (, т.е. размер клеток ) для каждого отдельного глаза, определяли путем подсчета ядер, окрашенных DAPI, в девяти различных областях (50 x 50 мкм) сетчатки.Общее количество фоторецепторных клеток оценивали путем деления площади внешнего ядерного слоя (ONL) на этот средний размер клетки. Количественную оценку колбочек проводили путем ручного подсчета количества положительно помеченных колбочек в ONL. Полученные значения представлены в виде доли от общего количества ячеек в ONL (, т.е. в процентах) и нормализованы к ситуации с массой. Значения выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). Для статистических сравнений использовали двусторонний непарный t-критерий Стьюдента, реализованный в Prism 6 для Windows (GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США).
Для оценки различий в миграции колбочек расстояние в мкм между внешним плексиформным слоем (OPL) и центром Glyphos-положительных клеточных тел измеряли с использованием программного обеспечения Axiovision (Zeiss). Значения расстояний для 150–250 колбочек во всей сетчатке были усреднены на иммуноокрашенных Glyphos срезах, по крайней мере, от 5 разных животных для каждого генотипа. Профиль миграции конусов был представлен как относительное расстояние миграции к толщине ONL, измеренное с помощью программного обеспечения Axiovision. Статистические различия между экспериментальными группами рассчитывались с использованием двустороннего непарного t-критерия Стьюдента и программного обеспечения Microsoft Excel (Microsoft, Сиэтл, Вашингтон, США).Столбики ошибок на рисунках указывают на SEM, уровни значимости были: * = P <0,05 , ** = P < 0,01 , *** = P < 0,001 .
Оценка интравитреального клиренса TSA
Интравитреальный клиренс (CL ivt ) TSA был рассчитан in silico с использованием недавно опубликованной модели количественных соотношений структура-свойство (QSPR) (56) на основе всеобъемлющих данных на кроликах из экспериментов по интравитреальной инъекции: LogCL ivt = — 0.25269–0,53747 (LogHD) + 0,05189 (LogD 7,4 ), где HD — количество донорных атомов водородной связи, а LogD 7,4 — рассчитанный коэффициент распределения н-октанол / вода при pH 7,4 соединения. Модель построена на основе соединений с малой молекулярной массой с использованием инструментов линейного многомерного анализа: анализа главных компонентов (PCA) и линейного частичного наименьших квадратов (PLS) (Simca Plus, версия 10.5, Umetrics AB, Умео, Швеция). Во-первых, химическая структура TSA была получена из ACD / Dictionary из программного обеспечения ACDlabs (версия 12, Advanced Chemistry Development, Inc., Торонто, Канада) и использовался в качестве входных данных в программе ACDlabs для генерации 30 молекулярных дескрипторов: pK a для наиболее кислой молекулярной формы, pK a для самой основной формы, LogD при pH 5,5 и 7,4, LogP, MW. , PSA (площадь полярной поверхности), FRB (свободно вращающиеся связи), HD (доноры водородных связей), HA (акцепторы водородных связей), Htot (HD + HA), правило 5, молярная рефракция, молярный объем, парахор, индекс преломление, поверхностное натяжение, плотность, поляризуемость, отношение C, отношение N, отношение NO, отношение гетеро, отношение галогенов, количество колец и количество ароматических, 3-, 4-, 5- и 6-членных колец.Область применимости модели интравитреального клиренса для TSA была проверена с созданием графика оценки PCA обучающего набора модели вместе с TSA (дополнительный материал, рис. S2). Соединения, которые лежат внутри эллипса, изображенного на графике, принадлежат тому же химическому пространству модели и предсказуемы моделью. После подтверждения области применимости значение интравитреального клиренса TSA было рассчитано с помощью приведенного выше уравнения с использованием значений дескриптора (LogD при pH 7.4 и HD). Период полувыведения рассчитывали с использованием уравнения t 1/2 = ln2 V d / CL, где V d — объем распределения, а CL — интравитреальный клиренс. Краткое обсуждение переносимости данных между кроликами и мышами см. В дополнительном примечании 1.
Дополнительные материалы
Дополнительные материалы доступны по адресу HMG онлайн.
Благодарности
Мы благодарны проф.Э. Зреннеру за плодотворные обсуждения и поддержку, мы также благодарим К. Масарини и Н. Ригера за умелую техническую помощь и М. Пауэра за критическое прочтение рукописи.
Заявление о конфликте интересов. Не заявлено.
Финансирование
Эта работа была поддержана Фондом Керстан, Deutsche Forschungsgemeinschaft [DFG TR 1238 / 4-1, DFG PA1751 / 4-1], Исследовательским институтом Alcon, Европейской комиссией [DRUGSFORD: HEALTH-F2-2012-304963], Министерством здравоохранения Германии. Образование и исследования [BMBF HOPE2 FKZ 01GM1108A] и Программа исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020 в соответствии с соглашением о гранте № 634479 (EyeRisk).
Список литературы
1Trifunovic
D.
Sahaboglu
A.
Kaur
J.
Mencl
S. Б.
Паке-Дюран
Ф.
(2012
)Нейропротективные стратегии лечения наследственной дегенерации фоторецепторов
.Curr. Мол. Med
.,12
,598
—612
,2Thiadens
A.A.
ден Холландер
А.И.
Роузинг
S.
Nabuurs
S.B.
Zekveld-Vroon
R.C.
Collin
R.W.
De Baere
E.
Koenekoop
R.K.
van Schooneveld
M.J.
Strom
T.М.
и др. . (2009
)Картирование гомозиготности выявляет мутации PDE6C у пациентов с ранним началом нарушений фоторецепторов колбочек
.г. J. Hum. Генет
.,85
,240
—247
.3Трифунович
Д.
Денглер
К.
Михалакис
С.
Э.
000 Б.
Паке-Дюран
Ф.
(2010
)cGMP-зависимая дегенерация фоторецепторов колбочек в сетчатке cpfl1 мыши
.J. Comp. Neurol
.,518
,3604
—3617
.4Аранго-Гонсалес
Б.
Трифунович
Д.
Сахабоглу
К.
0002 Сахабоглу
К.
S.
Farinelli
P.
Koch
S.
Koch
F.
Cottet
S.
Janssen-Bienhold
U.
, et al., et al.. (2014
)Идентификация общего механизма неапоптотической гибели клеток при наследственной дегенерации сетчатки
.PloS One
,9
,e112142.
5Kulkarni
M.
Trifunovic
D.
Schubert
T.
Euler
T.
Paquet-Durand
F.
() 2016Изменение динамики кальция в дегенерирующих фоторецепторах колбочек
.Hum. Мол. Genet
.,25
,3729
—3740
.6Paquet-Durand
F.
Hauck
S.M.
van Veen
T.
Ueffing
M.
Ekstrom
P.
(2009
) АктивностьPKG вызывает гибель фоторецепторных клеток в двух моделях пигментного ретинита
.J. Neurochem
.,108
,796
—810
.7Sahaboglu
A.
Tanimoto
N.
Kaur
J.
Sancho-Pelluz
J.
Huber
G.
Gahl
B.
Zrenner
E.
Ekstrom
P.
Lowenheim
H.
, et al. . (2010
)Нокаут гена PARP1 увеличивает устойчивость к дегенерации сетчатки, не влияя на ее функцию
.PloS One
,5
,e15495.
8Санчо-Пеллуз
Дж.
Алави
м.
Сахабоглу
А.
Кустерманн
С.
Фаринелли
Азади
ВеинеллиT.
Romero
FJ
Paquet-Durand
F.
Ekstrom
P.
(2010
)Чрезмерная активация HDAC критична для нейродегенерации у мышей rd1
.Cell Death Dis
.,1
,1
—9
.9Venkatesh
A.
Ma
S.
Le
Y.Z.
Зал
М.Н.
Ruegg
M.A.
Punzo
C.
(2015
)Активированный mTORC1 способствует долгосрочному выживанию колбочек у мышей пигментного ретинита
.J. Clin. Инвестируйте
.,125
,1446
—1458
.10Ян
Й.
Моханд-Саид
С.
Данан
А.
Симонутти
М.
Фонтейн
В.
Клерин
S.
Leveillard
T.
Sahel
JA
(2009
)Функциональное спасение колбочек с помощью белка RdCVF в доминантной модели пигментного ретинита
.Мол. Ther
.,17
,787
—795
.11Comitato
A.
Di Salvo
M.T.
Turchiano
G.
Montanari
M.
Sakami
S.
Palczewski
K.
Marigo
V.
(2016
)Доминантные и рецессивные мутации в родопсине активируют различные пути клеточной смерти
.Hum. Мол. Genet
., Pii: ddw137.12Egger
G.
Liang
G.
Aparicio
A.
Jones
P.A.
(2004
)Эпигенетика болезней человека и перспективы эпигенетической терапии
.Nature
,429
,457
—463
.13Chen
B.
Cepko
C.L.
(2009
)HDAC4 регулирует выживание нейронов в нормальной и больной сетчатке
.Science
,323
,256
—259
.14Peng
G.H.
Чен
S.
(2007
)Crx активирует транскрипцию опсина, рекрутируя HAT-содержащие коактиваторы и способствуя ацетилированию гистонов
.Hum. Мол. Genet
.,16
,2433
—2452
.15Marks
P.
Rifkind
R.A.
Ричон
В.M.
Breslow
R.
Miller
T.
Kelly
W.K.
(2001
)Гистоновые деацетилазы и рак: причины и методы лечения
.Nat. Rev. Cancer
,1
,194
—202
.16Haberland
M.
Montgomery
R.L.
Olson
E.N.
(2009
)Многие роли гистоновых деацетилаз в развитии и физиологии: значение для болезней и терапии
.Nat. Rev. Genet
.,10
,32
—42
.17Pfeiffer-Guglielmi
B.
Francke
M.
Reichenbach
B.Юнг
г.
Хампрехт
Б.
(2005
)Изофермент гликогенфосфорилазы в клетках Мюллера сетчатки (глиальных) млекопитающих и в астроцитах сетчатки и зрительного нерва
.Glia
,49
,84
—95
. 18Zhao
L.
Zabel
M.K.
Wang
X.
Ma
W.
Shah
P.
Fariss
R.N.
Qian
H.
Parkhurst
C.N.
Ган
W.B.
Вонг
W.T.
(2015
)Микроглиальный фагоцитоз живых фоторецепторов способствует наследственной дегенерации сетчатки
.EMBO Mol. Med
.,7
,1179
—1197
.19Kostic
C.
Crippa
S.V.
Pignat
V.
Bemelmans
A.P.
Samardzija
M.
Grimm
C.
Wenzel
A.
v000000000000000000000Генная терапия восстанавливает экспрессию белка в фоторецепторах колбочек у мышей Rpe65 (R91W / R91W)
.PLoS One
,6
,e16588.
20Дегучи
A.
Soh
J.W.
Li
H.
Pamukcu
R.
Thompson
W.J.
Weinstein
I.B.
(2002
)Фосфорилирование фосфопротеина, стимулированное вазодилататорами (VASP), является биомаркером действия экзисулинда и родственных ему агентов, которые активируют протеинкиназу G
.Мол. Cancer Ther
.,1
,803
—809
,21Bolden
J.E.
Peart
M.J.
Johnstone
R.W.
()Противораковая активность ингибиторов гистондеацетилазы
.Nat. Rev. Drug Discov
.,5
,769
—784
.22Казанцев
A.G.
Thompson
L.M.
(2008
)Терапевтическое применение ингибиторов гистондеацетилазы при заболеваниях центральной нервной системы
.Nat. Rev. Drug Discov
.,7
,854
—868
,23Alsarraf
O.
Fan
J.
Dahrouj
M.
Chou
DR
Crosson
н.э.
(2014
)Ацетилирование: модификация лизина с нейропротекторным действием при ишемической дегенерации сетчатки
.Exp. Eye Res
.,127
,124
—131
.24Mitton
K.P.
Guzman
AE
Deshpande
M.
Byrd
D.
DeLooff
C.
Mkoyan
K.
ace
000Wall
A. Меткалф
B.
Laux
K.
, et al. . (2014
)Различные эффекты вальпроевой кислоты на потерю фоторецепторов у мышей с дегенерацией сетчатки Rd1 и Rd10
.Мол. Vis
.,20
,1527
—1544
.25Кумар
A.
Midha
N.
Gogia
V.
Gupta
S. С.
Чохан
А.
(2014
)Эффективность перорального приема вальпроевой кислоты у пациентов с пигментным ретинитом
.J. Ocul. Pharmacol. Ther
.,30
,580
—586
.26Клемсон
C.M.
Цеков
R.
Krebs
M.
Checchi
J.M.
Bigelow
C.
Kaushal
S.
(2011
)Терапевтический потенциал вальпроевой кислоты при пигментном ретините
.руб. J. Ophthalmol
.,95
,89
—93
.27Mulholland
N.M.
Soeth
E.
Смит
C.L.
(2003
)Ингибирование транскрипции MMTV ингибиторами HDAC происходит независимо от изменений ремоделирования хроматина и повышенного ацетилирования гистонов
.Онкоген
,22
,4807
—4818
,28Schaeferhoff
K.
Michalakis
S.
Tanimoto
0002 N.
Eischer
Fischer
.
Beck
S.C.
Huber
G.
Rieger
N.
Riess
O.
Wissinger
B.
, et al. . (2010
)Индукция генов, связанных с STAT3, в быстро дегенерирующих фоторецепторах колбочек мышей cpfl1
.Ячейка. Мол. Life Sci
.,67
,3173
—3186
,29юаней
Z.L.
Гуань
Ю.J.
Chatterjee
D.
Chin
Y.E.
(2005
)Димеризация Stat3 регулируется обратимым ацетилированием одного остатка лизина
.Наука
,307
,269
—273
.30Modi
Ю.С.
Tanchon
C.
Ehlers
J.P.
(2015
)Сравнительная безопасность и переносимость терапии анти-VEGF при возрастной дегенерации желтого пятна
.Drug Saf
.,38
,279
—293
.31Hamlin
R.L.
Altschuld
R.A.
(2011
)Экстраполяция от мыши к человеку
.Circ. Кардиоваск. Визуализация
,4
,2
—4
.32Gojo
I.
Jiemjit
A.
Trepel
J.B.D.
Rollins
S.
Tidwell
M.L.
Грир
Дж.
Чанг
Э.Дж.
Ли
M.J.
, et al. . (2007
)Фаза 1 и фармакологическое исследование MS-275, ингибитора гистоновой деацетилазы, у взрослых с рефрактерными и рецидивирующими острыми лейкозами
.Кровь
,109
,2781
—2790
.33Минуччи
S.
Pelicci
P.G.
(2006
)Ингибиторы гистондеацетилазы и перспективы эпигенетических (и других) методов лечения рака
.Nat. Rev. Cancer
,6
,38
—51
.34Rich
K.A.
Zhan
Y.
Заготовки
J.C.
(1997
)Миграция и синаптогенез фоторецепторов колбочек в развивающейся сетчатке мыши
.J. Comp. Neurol
.,388
,47
—63
.35Michalakis
S.
Geiger
H.
Haverkamp
S. А.
Биль
М.
(2005
)Нарушение нацеливания опсина и миграции фоторецепторов колбочек в сетчатке мышей, лишенных циклического нуклеотид-управляемого канала CNGA3
.Инвест.Офтальмол. Vis. Sci
.,46
,1516
—1524
,36Юоделис
C.
Хендриксон
A.
(1986
)Качественный и количественный анализ ямки человека в процессе развития
.Vision Res
.,26
,847
—855
.37Tarpey
P.
Thomas
S.
Sarvananthan
N.
Mallya 9.000
Lisgo
S.
Talbot
C.J.
Roberts
E.O.
Awan
M.
Surendran
M.
McLean
R.J.
и др. . (2006
)Мутации в FRMD7, недавно идентифицированном члене семейства FERM, вызывают Х-сцепленный идиопатический врожденный нистагм
.Nat.Genet
.,38
,1242
—1244
.38McAllister
J.Т.
Дубис
А.М.
Таит
Д.М.
Ostler
S.
Rha
J.
Stepien
K.E.
Саммерс
C.G.
Кэрролл
Дж.
(2010
)Задержка развития: визуализация с высоким разрешением морфологии фовеа при альбинизме
.Vision Res
.,50
,810
—817
.39Коль
S.
Зобор
D.
Chiang
W.C.
Weisschuh
N.
Staller
J.
Gonzalez Menendez
I.
Chang
S.
Beck
SC
9000 S 9000 Vam 9000 Garrido и др. . (2015
)Мутации в регуляторе ответа развернутого белка ATF6 вызывают нарушение функции колбочек ахроматопсии
.Nat. Genet
.,47
,757
—765
.40Pow
D.V.
Салливан
R.K.
(2007
)Ядерный кинез, прорастание нейритов и аномальные проекции аксонов фоторецепторов колбочек в сетчатке пожилого человека и человека с поражением AMD
.Exp. Eye Res
.,84
,850
—857
.41Palazzo
A.
Ackerman
B.
Гундерсен
Г.Г.
(2003
)Клеточная биология: ацетилирование тубулина и подвижность клеток
.Nature
,421
,230.
42Kwiatkowski
A.V.
Рубинсон
Д.А.
Dent
E.W.
Edward van Veen
J.
Leslie
J.D.
Zhang
J.
Mebane
L.M.
Philippar 9.000
Pinheiro
E.M.
Burds
A.A.
и др. . (2007
)Ena / VASP Необходим для нейритогенеза в развивающейся коре головного мозга
.Neuron
,56
,441
—455
.43Reinhard
M.
Jouvenal
K.
Tripier
D.
1995 Walter
)Идентификация, очистка и характеристика белка, связанного с зиксином, который связывает фокальную адгезию и белок микрофиламентов VASP (фосфопротеин, стимулируемый вазодилататорами)
.Proc. Natl. Акад. Sci. США
,92
,7956
—7960
.44Смоленский
А.
Бахманн
К.
Рейнхард
К.
Хониг-
9000 ЛидлT.
Hoschuetzky
H.
Walter
U.
(1998
)Анализ и регулирование стимулируемого вазодилататорами фосфорилирования фосфопротеина серина 239 in vitro и в интактных клетках с использованием фосфоспецифических моноклональных антител
.J. Biol. Chem
.,273
,20029
—20035
.45Carter-Dawson
L.D.
LaVail
M.M.
(1979
)Палочки и колбочки в сетчатке глаза мышей. II. Авторадиографический анализ генерации клеток с использованием меченного тритием тимидина
.J. Comp. Neurol
.,188
,263
—272
.46Morgan
J.L.
Soto
F.
Вонг
Р.О.
Kerschensteiner
D.
(2011
)Развитие специфичных для клеточного типа паттернов связности сходящихся возбуждающих аксонов в сетчатке
.Neuron
,71
,1014
—1021
.47Ma
H.
Butler
MR
Thapa
A.
Belcher
J.
Baehr
W.
Biel
M.
Michalakis
S.
Ding
X.Q.
(2015
)Передача сигналов цГМФ / протеинкиназы G подавляет фосфорилирование инозитол-1,4,5-трифосфатного рецептора и способствует стрессу эндоплазматического ретикулума в фоторецепторах мышей с дефицитом циклических нуклеотидных каналов
.J. Biol. Chem
.,290
,20880
—20892
.48Hao
Y.
Xu
N.
Box
A.C.
Schaefer
L.
Kannan
K.
Zhang
Y.
Florens
L.
Wash2
Seidel
Wiegraebe
W.
, et al. . (2011
)Ядерная cGMP-зависимая киназа регулирует экспрессию генов посредством зависимого от активности рекрутирования консервативного гистон-деацетилазного комплекса
.PLoS Genet
.,7
,e1002065.
49Chen
B.
Cepko
C.L.
(2007
)Необходимость активности гистондеацетилазы для экспрессии критических генов фоторецепторов
.BMC Dev. Биол
.,7
,78
. 78.50Szel
A.
van Veen
T.
Rohlich
P.
(1994
)Дифференциация конуса сетчатки
.Nature
,370
,336.
51Lerea
C.L.
Somers
D.E.
Hurley
J.B.
Klock
I.B.
Бунт-Милам
хиджры
(1986
)Идентификация специфических альфа-субъединиц трансдуцина в фоторецепторах палочек и колбочек сетчатки
.Science
,234
,77
—80
.52Wolff
B.E.
Bearse
MA
Jr.Schneck
M.E.
Dhamdhere
K.
Harrison
W.W.
Барез
С.
Адамс
А.Дж.
(2015
)Цветовое зрение и нейроретинальная функция при диабете
.Док. Офтальмол
.,130
,131
—139
.53Valdes
J.
Trachsel-Moncho
L.
Sahaboglu
A.
Trifunovic
D.
Miranda
M.
Ueffing
M.
Paquet-Durand
000 F.
000000000000 )Органотипические культуры эксплантатов сетчатки как альтернатива in vitro для исследований диабетической ретинопатии
.ALTEX
,33
,459
—464
.54De Vente
J.
Steinbusch
H.W.
Шиппер
J.
(1987
)Новый подход к иммуноцитохимии 3 ‘, 5′-циклического гуанозинмонофосфата: получение, специфичность и начальное применение новой антисыворотки против фиксированного формальдегидом 3′, 5’-циклического гуанозинмонофосфата
.Neuroscience
,22
,361
—373
.55Бланки
J.C.
Johnson
L.V.
(1984
)Специфическое связывание лектина арахиса с классом фоторецепторных клеток сетчатки. Сравнение видов
.Инвест. Офтальмол. Vis. Sci
.,25
,546
—557
.56del Amo
E.M.
Vellonen
K.S.
Кидрон
Х.
Уртти
А.
(2015
)Интравитреальный клиренс и объем распределения соединений у кроликов: прогнозирование in silico и моделирование фармакокинетики для разработки лекарств
.евро. J. Pharm. Биофарм
.,95
,215
—226
.Заметки автора
© Автор, 2016. Опубликовано Oxford University Press. Все права защищены. Для получения разрешений обращайтесь по электронной почте: [email protected]
Мышь из сосновой шишки — Поделки из сосновой шишки для детей
Поделиться — это забота!
Самые милые поделки из сосновых шишек для детей! Превратите выкормленные сосновые шишки в супер милых мышей из сосновых шишек.Осенняя поделка детям обязательно понравится.
Craft Mouse CraftЭти маленькие мышки из сосновых шишек очаровательны! Это прекрасная осенняя поделка, которой могут заняться дети — вы можете сделать одну или вы можете сделать целое семейство мышей из сосновых шишек.
Что вам нужно, чтобы сделать мышь из сосновой шишки — поделки из сосновой шишки для детейВам просто понадобится горстка принадлежностей для поделок для нашей поделки для мыши из сосновой шишки
- сосновые шишки
- пуговицы в уши — они
- лента не должна совпадать с хвостом
- коричневая нить для усов
- ножницы
- клей точки, липкие подушечки или клей — в зависимости от того, что вы предпочитаете использовать при создании
Используя основание сосновой шишки в качестве носа мыши — вклините пуговицы, используя немного клея, по одной с каждой стороны в качестве ушей.
С помощью точки клея, липкой подушечки или клея нанесите глазки на мордочку мыши.
С помощью точки клея, липкой подушечки или клея прикрепите небольшой кусок ленты в качестве хвоста мыши.
Наконец, добавьте несколько усов — снова используйте точку клея, клей или липкую подушечку, чтобы прикрепить усы к носу мыши.
Вот и все — супер простая осенняя поделка для самых маленьких.
Попробуйте другие осенние поделки для детейОсень — прекрасное время года для творчества на природе, здесь так много всего, что вы можете собрать и использовать для создания великолепных художественных проектов.
Попробуйте другие детские поделки с мышкамиЕсли у вас получится, не забудьте пометить нам свои творения в Twitter @daisiesandpieUK или Instagram @daisiesandpie и расскажите, как все прошло!
Направляйтесь сюда, чтобы получить больше развлечений для детей
Здесь вы найдете больше детских художественных проектов и мероприятий
Получите больше осенних мероприятий для детей здесь
Еще BRILLIANT kids ремесел здесь