Профилирование транскрипции микроглии сетчатки во время дегенерации колбочек после сверхэкспрессии sCX3CL1. ( A ) Вулканический график активированных и подавленных генов из микроглии сетчатки P70 rd10 после инфицирования в точке P0 – P1 с помощью AAV8-GFP или AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1. Пунктирными линиями обозначено скорректированное значение P <0,05 и величина кратного изменения ≥2. Полные списки генов представлены в приложении SI , таблицах S2 и S3. ( B ) Проверка изменений экспрессии генов в микроглии сетчатки P70 rd10 с помощью AAV8-sCX3CL1 с помощью ОТ-ПЦР.( C ) GSEA микроглии P70 rd10 из сетчатки, инфицированной AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1 (оранжевый), по сравнению с одним AAV8-GFP (зеленый). Отображаются генные наборы с коэффициентом ошибок в семье <0,05. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 7–8 животных на условие). * P <0,05; ** P <0,01; **** P <0,0001 по двустороннему тесту Стьюдента t .

Нормальное количество микроглии не требуется для спасения конуса с помощью AAV8-sCX3CL1.

В здоровых глазах CX3CR1, единственный известный рецептор CX3CL1, как полагают, специфически экспрессируется микроглией (65). Этот факт и приведенные выше данные RNA-seq побудили нас задаться вопросом, какое влияние удаление микроглии может иметь на выживаемость колбочек. Кроме того, нам было любопытно, была ли микроглия необходима для спасения колбочек с помощью AAV8-sCX3CL1. Фармакологически истощить микроглию можно с помощью PLX3397, мощного ингибитора рецептора колониестимулирующего фактора 1 (CSF1R) (23, 66). С этой целью мышей rd1 кормили PLX3397, и истощение микроглии сетчатки оценивали с помощью проточной цитометрии.Обработка PLX3397 привела к истощению ~ 99% микроглии через 30 дней (рис. 7 A и B ). Чтобы определить, продлевает ли уменьшение микроглии выживаемость колбочек, и проверить, требуется ли для активности AAV8-sCX3CL1 микроглия для сохранения колбочек, мышей rd1 инфицировали AAV8-GFP с AAV8-sCX3CL1 или без него и вводили PLX3397 в течение 30 дней в течение 30 дней. период дегенерации шишки. Истощение микроглии незначительно ( P > 0,05) увеличивало выживаемость колбочек в обоих условиях (рис.7 C и D ). Более того, истощение микроглии не отменяет способности AAV8-sCX3CL1 спасать колбочки ( P <0,0001).

Влияние истощения микроглии на восстановление конуса AAV8-sCX3CL1. ( A ) Репрезентативная проточная цитометрия, стробирующая микроглии (CD11b ⁺ Ly6G / Ly6C ^— ) и CD11b ^— Ly6G / Ly6C ^{+ + популяции в P50 rd1 сетчатке с лечением PLX339749 от P20 или без него. .Панели закрываются на живых клетках (DAPI —) после исключения дублетов. ( B ) Фракция микроглии и CD11b — Ly6G / Ly6C + клеток, остающихся относительно контроля в сетчатках P50 rd1 , инфицированных в P0 – P1 только AAV8-GFP или AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1 после 30 лет d обработки PLX3397. Сетчатку от однопометников без обработки PLX3397 использовали в качестве контроля. ( C ) Плоские сетчатки P50 rd1 от мышей, обработанных PLX3397, инфицированных AAV8-GFP или AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1.(Масштаб: 1 мм.) ( D ) Количественная оценка выживаемости колбочек в центральной сетчатке сетчатки P50 rd1 мышей, обработанных PLX3397, инфицированных AAV8-GFP или AAV8-GFP плюс AAV8-sCX3CL1. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM [ n = 3–4 животных на условие ( A ), n = 9–18 животных на условие ( D )]. **** P <0,0001 по двустороннему тесту Стьюдента t . Н.С., не имеет значения.}

Обсуждение

В этом исследовании мы разработали вектор для генной терапии, AAV8-sCX3CL1, который увеличивал выживаемость колбочек в трех различных моделях мышей RP и задерживал потерю опосредованного конусами зрения.Сохранение колбочек с AAV8-sCX3CL1 происходило, несмотря на повышенные уровни цитокинов в сетчатке и несмотря на продолжающееся присутствие микроглии в ONL. Истощение до ∼99% микроглии во время дегенерации колбочек незначительно улучшало выживаемость колбочек и не нарушало спасительный эффект AAV8-sCX3CL1. Хотя механизм, с помощью которого AAV8-sCX3CL1 сохраняет колбочки, еще предстоит выяснить, наши результаты показывают, что генная терапия sCX3CL1 может быть полезной для широкого круга пациентов с RP и, возможно, для других пациентов с воспалительными процессами, которые влияют на зрение или другие области ЦНС.

CX3CL1 представляет собой белок из 373 аминокислот с одним трансмембранным доменом, который может подвергаться протеолитическому расщеплению с высвобождением sCX3CL1 во внеклеточную среду (38). В ЦНС и fCX3CL1, и sCX3CL1 в основном продуцируются нейронами, и, связывая CX3CR1 с микроглией, они, как полагают, регулируют ключевые аспекты физиологии микроглии (67, 68). Одна из основных функций CX3CL1 во взаимодействиях нейронов с микроглией — подавление активации микроглии (69, 70). Подтверждая это мнение, было показано, что экзогенная доставка CX3CL1 снижает активацию микроглии, а также неврологический дефицит на животных моделях болезни Паркинсона и инсульта (71–73).Основываясь на этих данных, мы сверхэкспрессировали CX3CL1 у мышей RP в надежде, что он ослабит иммунные ответы в сетчатке, которые увековечивают неавтономную гибель колбочек. Использование sCX3CL1 действительно увеличивало выживаемость колбочек во время дегенерации, хотя и не уменьшало воспаление или количество микроглии в ONL. Интересно, что спасение колбочек наблюдалось, когда sCX3CL1 секретировалось с помощью RPE, но не когда полноразмерный мембраносвязанный CX3CL1 экспрессировался на колбочках. Этот результат может быть связан с различиями в уровне экспрессии, поскольку специфический для RPE промотор Best1 человека является довольно сильным по сравнению с промотором красного опсина человека.Альтернативно, возможно, что sCX3CL1 действует на другие типы клеток, помимо микроглии, и может лучше достигать этих клеток при секреции. Напротив, сверхэкспрессия CD200, другого репрессора активации микроглии (24), не смогла спасти колбочки, независимо от того, экспрессируются они как sCD200 из RPE или как fCD200 на колбочках. Следует отметить, что недавно мы сообщили о дозозависимой векторной токсичности с некоторыми промоторами, включая Best1 человека, что приводило к дисморфическому РПЭ и легкому повреждению фоторецепторов (74). В этом исследовании AAV8-sCX3CL1, содержащий человеческий промотор Best1, тем не менее, был способен улучшить выживаемость колбочек.

Активированная микроглия является отличительной чертой ранней РП, учитывая их миграцию в ONL, продукцию воспалительных цитокинов и фагоцитоз живых фоторецепторов (33, 34, 45). На ранней стадии RP палочки дегенерируют, и эти активности микроглии вредны, поскольку генетическое удаление микроглии, как было показано, улучшает гибель палочки (34). Острая отслойка сетчатки, еще одно состояние, вызывающее потерю фоторецепторов, аналогичным образом характеризуется воспалительными цитокинами и фагоцитарной микроглией (75, 76).Однако, в отличие от случая раннего РПЖ, удаление микроглии во время отслоения сетчатки ускоряет дегенерацию фоторецепторов, что подразумевает защитную роль активированной микроглии (76). Здесь мы нашли доказательства активации микроглии во время гибели колбочек при RP, о чем свидетельствует присутствие микроглии в ONL и активация Il1a , Tnf , C1qa и Cd68 . Мы предположили, что, как и при раннем РП, эти микроглии могут быть вредными; Следовательно, нашей целью было разработать AAV, способные подавлять активацию микроглии сетчатки.Интересно, что вызванное лекарствами истощение микроглии в сетчатках rd1 и предоставило доказательства лишь небольшого отрицательного эффекта активированной микроглии на колбочки; только небольшое увеличение количества колбочек наблюдалось при истощении микроглии, и это изменение не достигло статистической значимости. Одно из объяснений этого может заключаться в том, что, хотя активированная микроглия при RP действительно препятствует выживанию колбочек, они также могут давать некоторые преимущества. Мы предполагаем, что одним из таких преимуществ может быть увеличение очистки от вредных клеточных остатков.С помощью RNA-seq мы обнаружили небольшие количества специфичных для колбочек РНК в микроглии из сетчатки rd10 , инфицированных AAV8-GFP, возможно, в результате фагоцитоза колбочек или фрагментов колбочек. Поскольку таких РНК было меньше в микроглии сетчатки, инфицированной AAV8-sCX3CL1, обломки колбочек могут накапливаться в контрольной микроглии, если переваривание этих материалов не может поспевать за поглощением. Неспособность микроглии завершить фагоцитоз может затем вызвать высвобождение факторов, повреждающих колбочки, аналогично модели «фрустрированного фагоцитоза», испытываемого микроглией при болезни Альцгеймера (77).Поскольку мы наблюдали повышающую регуляцию лизосомных путей в микроглии с помощью AAV8-sCX3CL1, эти клетки могут более эффективно переваривать материал колбочек, облегчая это расстройство и способствуя сохранению колбочек.

Примечательно, что истощение до ∼99% микроглии также не отменяет спасение конуса AAV8-sCX3CL1. Хотя это может указывать на то, что sCX3CL1 продлевает выживаемость колбочек независимо от микроглии, мы не можем исключить возможность того, что sCX3CL1 опосредует эффект спасения через микроглии до их истощения.Поскольку AAV8-sCX3CL1 вводили до PLX3397, у микроглии могло быть достаточно времени, чтобы отреагировать на sCX3CL1 и изменить микросреду сетчатки таким образом, чтобы способствовать выживанию колбочек. Хотя обычно для достижения пика субретинальной экспрессии AAV8 требуется около 2 месяцев, небольшое количество сигнала может быть обнаружено уже через 5 дней после заражения (78). В соответствии с этим мы действительно наблюдали некоторые транскрипционные изменения в микроглии сетчатки через 20 дней после доставки AAV8-sCX3CL1 ( SI, приложение , рис.S6), хотя трудно интерпретировать значимость таких изменений для задержки дегенерации конуса. Другой сценарий может заключаться в том, что для сохранения колбочек AAV8-sCX3CL1 необходимо всего несколько микроглии. В недавнем исследовании Liddelow et al. (23), истощение микроглии с помощью PLX3397 не смогло устранить фенотип в астроцитах, индуцированный микроглией. В частности, авторы обнаружили, что воспалительные цитокины из активированной микроглии заставляют астроциты повреждать нейроны. Нейротоксичность астроцитов отсутствовала у CSF1R-нулевых мышей, лишенных микроглии (79).Однако у других штаммов нейротоксичность все еще наблюдалась, несмотря на фармакологическое истощение 95% микроглии (23). Таким образом, возможно, что ~ 1% микроглии сетчатки, которая выживает после лечения PLX3397, достаточна для ответа на sCX3CL1 и сохранения дегенерирующих колбочек. Для этих оставшихся микроглий более высокая передача сигналов sCX3CL1 на клетку может дополнительно объяснять небольшую аддитивность AAV8-sCX3CL1 и истощение микроглии при спасении колбочек.

Альтернативная модель, учитывая, насколько скромным было влияние истощения микроглии на выживаемость колбочек, заключается в том, что неавтономная гибель колбочек вызывается механизмами, в значительной степени независимыми от микроглии (9, 13–15).Для AAV8-sCX3CL1 причина спасения колбочек может быть связана с тем, что sCX3CL1 действует на тип клеток, экспрессирующих CX3CR1, отличный от микроглии. Этот тип клеток должен быть внешним по отношению к сетчатке, поскольку ни одна из клеток немикроглии в наших сетчатках rd1 ; Cx3cr1 ^{GFP / +} не экспрессировала CX3CR1 при анализе с помощью проточной цитометрии. Вне ЦНС CX3CR1 также присутствует в нескольких популяциях иммунных клеток, включая моноциты; периферические макрофаги; и определенные подмножества Т-клеток, естественных клеток-киллеров и дендритных клеток (35, 80).В этих популяциях одна из ролей CX3CR1 — опосредовать хемотаксический ответ на CX3CL1 (80, 81). Следовательно, вероятно, что sCX3CL1, секретируемый RPE, может действовать на один из этих типов клеток в сосудистой сосудистой оболочке, возможно, чтобы индуцировать миграцию в субретинальное пространство. Дальнейшая работа необходима для изучения этих возможностей и определения на молекулярном уровне, как sCX3CL1 сохраняет колбочки. Такая информация поможет в разработке более эффективных методов лечения РПЭ, более конкретно направленных на дегенерацию колбочек.

В 2017 году AAV, кодирующий ген RPE65, стал первой генной терапией, одобренной для лечения наследственного заболевания сетчатки (82). Несмотря на это достижение, до сих пор существуют тысячи мутаций заболеваний сетчатки, от которых не существует эффективного лечения (83). Устранение этих поражений по одному было бы дорогостоящим и трудоемким, и особенно для RP, стержни, несущие мутацию, часто умирают к моменту постановки диагноза (1), что делает терапию генной коррекции невозможной. Генная терапия, не зависящая от мутаций, представляет собой альтернативный подход, который, хотя и не является лечебным, может улучшить зрение у гораздо большего числа пациентов, включая тех, у которых не было выявлено никаких причинных мутаций.Ранее было показано, что только два примера независимой от мутаций генной терапии спасают колбочки на животных моделях RP (84). В 2015 году Бирн с соавторами (85) сообщили о лучшей выживаемости колбочек и зрении у двух линий мышей RP с вирусной экспрессией фактора жизнеспособности колбочек (RdCVF), белка, обычно секретируемого палочками, который стимулирует колбочки поглощать глюкозу. (86). В том же году наша группа обнаружила, что количество колбочек и функция у трех линий RP мышей могут быть улучшены с помощью AAV-опосредованной доставки антиоксидантной терапии, в частности, основного антиоксидантного фактора транскрипции, NRF2 (13).Здесь мы продемонстрировали, что AAV8-sCX3CL1 также является независимой от мутаций генной терапией, способной сохранять колбочки у разных типов мышей RP. Наши результаты подтверждают дальнейшую оценку AAV8-sCX3CL1 на более крупных животных моделях RP и подчеркивают его потенциал для лечения этого заболевания у пациентов, независимо от их мутации.

Наконец, смерть фоторецепторов происходит при других заболеваниях, таких как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), ведущая причина слепоты в промышленно развитых странах (87). Хотя патогенез AMD до конца не изучен, потеря палочек обычно предшествует потере колбочек (88, 89), в отличие от неавтономной гибели колбочек при RP.Кроме того, генетический полиморфизм CX3CR1, рецептора CX3CL1, был связан с более высоким риском AMD у пациентов (90). Таким образом, было бы интересно проверить, может ли sCX3CL1 аналогичным образом облегчить дегенерацию сетчатки при AMD.

Материалы и методы

Животные. Мыши

CD-1 (номер в каталоге 022), rd1 (FVB / N; номер в каталоге 207) и B6 (номер в каталоге 027) были приобретены в Charles River Laboratories. Cx3cr1 ^GFP (каталожный номер 005582) (35) и rd10 (каталожный номер.004297) (27) мышей на фоне B6 были приобретены в The Jackson Laboratory. Родопсин-нулевые ( Rho ^{— / —} ) мыши были подарком Дженис Лем, Университет Тафтса, Бостон, Массачусетс (42). Впоследствии животных разводили и содержали в Гарвардской медицинской школе с 12-часовым чередованием светового и темного цикла. Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в Гарвардском университете.

Плазмиды.

Векторная плазмида AAV-красный опсин человека-GFP-вирус гепатита сурка посттранскрипционный регуляторный элемент (WPRE)-бычий гормон роста (bGH) polyA (AAV8-GFP) была подарена Botond Roska, Институт биомедицинских исследований Фридриха Мишера, Базель , Switzerland (91), и использовали промоторную область, первоначально разработанную Wang et al.(92). Вектор AAV8-mCherry был создан путем замены кодирующей последовательности GFP последовательностью mCherry, фланкированной сайтами рестрикции NotI и AgeI. Затем AAV8-fCD200 и AAV8-fCX3CL1 были клонированы путем переваривания AAV8-mCherry рестрикционными ферментами NotI и HindIII и замены кодирующей последовательности mCherry последовательностью Козака GCCGCCACC, за которой следовала полноразмерная кДНК мыши для CD200 (NM_010818.3) или CX3CL. (NM_009142.3) соответственно. Вектор, использующий промотор Best1 человека, был создан путем замены промотора CMV в плазмиде интрона AAV-CMV-Promega (PI) -EGFP-WPRE-bGH, подаренной Джеймсом М.Wilson, Пенсильванский университет, Филадельфия, Пенсильвания, с областью -540 / + 38 п.н. человеческого промотора Best1 (93). Векторные плазмиды для AAV8-sCD200 и AAV8-sCX3CL1 были клонированы путем переваривания вектора промотора AAV-human Best1 рестрикционными ферментами NotI и HindIII и замены кодирующей последовательности EGFP последовательностью Козака GCCGCCACC, за которой следовали первые 714 п.н. (аминокислоты 1– 238) CD200 или первые 1008 п.н. (аминокислоты 1–336) CX3CL1, соответственно, за которыми следует стоп-кодон.

Гистология.

Энуклеированные глаза для поперечных срезов сетчатки препарировали в PBS. После удаления роговицы, радужки, хрусталика и цилиарного тела оставшийся наглазник фиксировали в 4% параформальдегиде на 4 часа при комнатной температуре; криозащита в 10%, 20% и 30% сахарозе в PBS; и заключили в смесь 1: 1 30% сахарозы в PBS и компаунде с оптимальной температурой резки (Tissue-Tek) на сухом льду. Замороженные наглазники разрезали на криостате Leica CM3050S (Leica Microsystems) на срезы размером 50 мкм для сетчатки Cx3cr1 ^GFP или срезы размером 20 мкм в противном случае и окрашивали 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; Thermo Fisher Scientific. ) в течение 5 минут при комнатной температуре перед нанесением с помощью Fluoromount-G (SouthernBiotech).Для сетчатки, установленной на плоской поверхности, изолированные сетчатки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 30 мин при комнатной температуре. Делали четыре радиальных разреза для расслабления сетчатки на четыре листочка, которые расплющивали на предметном стекле микроскопа слоем ганглиозных клеток вверх, используя щеточку с тонким ворсом. Чтобы выполнить окрашивание антителами поперечных срезов сетчатки или целой сетчатки, ткани блокировали 5% козьей сывороткой или 5% BSA в PBS с 0,1% Triton X-100 в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего ткани инкубировали с первичными антителами в блокировать раствор при 4 ° C в течение ночи, а затем вторичные антитела в PBS в течение 2 часов при комнатной температуре.Первичные антитела включали кроличьи анти-CX3CL1 (ab25088, 1: 500; Abcam) и арахисовый агглютинин, конъюгированный с родамином (RL-1072, 1: 1000; Vector Laboratories). Козье антитело против кролика Alexa Fluor 594 (111-585-144, 1: 1000; Jackson ImmunoResearch) использовали в качестве вторичных антител.

Получение и анализ изображений.

Изображения микроглии в поперечных срезах сетчатки и сетчатки, закрепленной на плоской поверхности, получали на широкоугольном флуоресцентном микроскопе Keyence BZ-9000 с использованием воздушного объектива 10x. Все остальные изображения были получены на сканирующем конфокальном микроскопе Zeiss LSM710 с использованием 10-кратного воздушного, 20-кратного воздушного или 40-кратного масляного объектива.Анализ изображений выполнялся с помощью ImageJ (NIH). Чтобы рассчитать процент микроглии в ONL, вокруг ONL была нарисована маска по контурам ядер, меченных DAPI. Было определено, что каждая микроглия находится в ONL, если 50% или более ее клеточного тела находится внутри маски. Чтобы оценить выживаемость колбочек в сетчатке с плоским экраном, был создан специальный модуль ImageJ. Во-первых, чтобы указать границы сетчатки, пользователь отметил расположение головки зрительного нерва и каждой из четырех створок сетчатки, как показано в приложении SI , рис.S2. Затем модуль автоматически обработал изображение, определил центральную сетчатку и применил порог для количественной оценки количества GFP-положительных колбочек в этой области. Подробные процедуры представлены в SI Приложение , SI Материалы и методы .

ERG.

Регистрация ERG in vivo проводилась и измерялась наблюдателем, не знающим назначения лечения, с использованием системы Espion E3 (Diagonsys), как описано ранее (13, 96). Подробные процедуры представлены в SI Приложение , SI Материалы и методы .

Оптомоторный анализ.

Острота зрения измерялась наблюдателем, не осведомленным о назначении лечения, с помощью системы OptoMotry (CerebralMechanics), как описано ранее (13, 96). Подробные процедуры представлены в SI Приложение , SI Материалы и методы .

ОТ-ПЦР.

Для ОТ-ПЦР целых сетчаток только что рассеченные сетчатки гомогенизировали с использованием ручного пестика для гранул (Kimble Chase) в 350 мкл буфера для RLT, содержащего 1% -меркаптоэтанол.На образец использовали одну сетчатку. Для ОТ-ПЦР микроглии ~ 1000 микроглии на сетчатку сортировали в 10 мкл буфера TCL (Qiagen) для лизирования клеток, к которому добавляли 70 мкл буфера для RLT, содержащего 1% -меркаптоэтанол. Экстракцию РНК проводили с использованием набора RNeasy Micro Kit (Qiagen) с последующим синтезом кДНК с использованием системы синтеза первой цепи SuperScript III (Invitrogen). Реакции RT-PCR проводили в трех повторностях с использованием Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) на системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX96 (BioRad) для определения значений порога цикла (Ct).Уровни экспрессии определяли количественно путем нормализации к гену домашнего хозяйства Gapdh с кратными изменениями относительно сопоставимых по возрасту сетчаток дикого типа (CD-1 или B6). Значения P были рассчитаны с использованием значений ΔΔCt. Праймеры для ОТ-ПЦР были разработаны с использованием PrimerBank (97) с последовательностями, доступными в SI Приложение , Таблица S1.

Проточная цитометрия и сортировка клеток.

Микроглию сетчатки выделяли с помощью клеточной сортировки, активируемой флуоресценцией (FACS), и данные анализировали с помощью FlowJo 10 (TreeStar).Для диссоциации клеток свежесрезанные сетчатки инкубировали в 400 мкл раствора цистеин-активированного папаина (Worthington) в течение 5 минут при 37 ° C с последующим легким растиранием с помощью микропипетки. Затем диссоциированные клетки блокировали крысиным антимышиным CD16 / 32 (1: 100; BD Pharmingen) в течение 5 минут на льду с последующим окрашиванием конъюгированным с фикоэритрином-Cy5 анти-CD11b (M1 / 70, 1: 200; BioLegend) , конъюгированный с аллофикоцианином (APC) -Cy7 анти-Ly6G (1A8, 1: 200; BioLegend) и конъюгированный с APC-Cy7 анти-Ly6C (HK1.4, 1: 200; BioLegend) в течение 20 мин на льду. После промывок клетки ресуспендировали в буфере FACS (2% FBS, 2 мМ EDTA в PBS), содержащем 0,5 мкг / мл DAPI, для мечения нежизнеспособных клеток и пропускали через фильтр с размером ячеек 40 мкм. Сортировку выполняли на BD FACSAria II с использованием сопла 70 мкм в соответствии со стробированием, показанным в приложении SI , рис. S4.

РНК-последовательность микроглии.

Восемь биологических повторов были использованы для экспериментальных условий. Для каждой сетчатки 1000 микроглии (CD11b ⁺ Ly6G / Ly6C ^—) были отсортированы в 10 мкл буфера TCL (Qiagen), содержащего 1% -меркаптоэтанол, и немедленно заморожены на сухом льду.Для подмножества сетчатки также были отсортированы 1000 клеток немикроглии (CD11b ^— ). После сбора всех образцов замороженные лизаты микроглии и немикроглии размораживали на влажном льду и загружали в 96-луночный планшет для синтеза библиотеки кДНК и секвенирования. Модифицированный протокол Smart-Seq2 был выполнен на образцах с помощью Genomics Platform Broad Institute (98). Библиотеки из 96 образцов с уникальными штрих-кодами были объединены и секвенированы на системе секвенирования NextSeq 500 (Illumina) до ожидаемого охвата ~ 6 миллионов считываний на образец.После демультиплексирования считанные данные были подвергнуты мерам контроля качества и сопоставлены с эталонным геномом GRCm38.p6. Считывания, присвоенные каждому гену, были количественно определены с использованием функции featureCounts (99), а образцы с менее чем 30% назначенных считываний были исключены из дальнейшего анализа. Данные подсчета были проанализированы с использованием DESeq2 для идентификации дифференциально экспрессируемых генов, при этом скорректированное значение P менее 0,05 считалось значимым (100). GSEA выполняли с использованием программного обеспечения GSEA v3.0 от Broad Institute с настройками по умолчанию в коллекции GO Cellular Component Ontology (580 наборов генов) из базы данных молекулярных сигнатур (MSigDB).Наборы генов с коэффициентом ошибок в семье менее 0,05 считались значительно обогащенными.

Истощение микроглии.

Микроглии истощали с использованием PLX3397 (SelleckChem), перорально доступного ингибитора CSF1R. PLX3397 включали в корм для грызунов AIN-76A (Research Diets) в дозе 290 мг / кг и давали ad libitum в течение 30 дней перед отбором животных на P50.

Статистика.

Непарные, двусторонние тесты Стьюдента t были использованы для сравнения между двумя группами.Для сравнения трех или более групп к тесту добавляли поправку Бонферрони путем умножения полученного значения P на количество проверенных гипотез. Двусторонний двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA использовался для анализа экспериментов с ERG, оптомоторной системой и толщиной ONL, в которых одних и тех же субъектов сравнивают по ряду условий или временных точек. Во всех случаях значение P менее 0,05 считалось статистически значимым.

Благодарности

Мы благодарим Sophia Zhao и Microscopy Resources на Северном квадрате в Гарвардской медицинской школе за их техническую помощь.Эта работа стала возможной благодаря поддержке Медицинского института Говарда Хьюза (S.K.W. и C.L.C.), Фонда борьбы со слепотой (S.K.W.) и Fight for Sight (S.K.W.).

Сноски

• Автор: S.K.W. и C.L.C. спланированное исследование; S.K.W., Y.X., P.R. и C.M.H. проведенное исследование; S.K.W., Y.X., P.R. и C.M.H. проанализированные данные; и S.K.W. и C.L.C. написал газету.

• Рецензенты: S.H.T., Колумбийский университет; и M.L.V., Университет Юты.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.17116/-/DCSupplemental.

Пространственно-временная характеристика дегенерации S- и M / L-конусов в модели пигментного ретинита на мышах Rd1 | BMC Neuroscience

Идентификация S- и M / L-колбочек в сетчатке дикого типа и Rd1

S- и M / L-колбочки были идентифицированы иммунодетекцией с использованием хорошо охарактеризованных антител [15, 19].В сетчатке WT каждый опсин был в основном связан с внешним сегментом (дополнительный файл 1). Обнаруживалась также более низкая интенсивность мечения соматы конуса и синаптического конца, которая была сильнее в колбочках S-opsin ⁺ , чем в колбочках M / L opsin ⁺ . Предыдущие исследования продемонстрировали, что у мышей Rd1 внешние сегменты колбочек дегенерируют до гибели тела клетки, что приводит к эктопическому перераспределению опсинов в выжившее тело клетки [8]. Таким образом, в сетчатке Rd1 можно обнаружить как колбочки с интактными внешними сегментами, так и колбочки, лишенные внешних сегментов.В настоящем исследовании тельца колбочек были идентифицированы по их широкой яйцевидной морфологии и помечены с умеренной интенсивностью флуоресценции, в то время как внешние сегменты были идентифицированы по их узкому пучковидному виду и помечены с высокой интенсивностью флуоресценции (дополнительный файл 2). Эти различные клеточные структуры были проанализированы и количественно определены отдельно с использованием пороговых значений изображения (дополнительный файл 2). Ортин-Мартинес и др. [15] отметили, что надежная количественная оценка сегментов конуса в цельных кронштейнах зависит от тщательного удаления РПЭ без повреждения хрупких внешних сегментов.Сетчатка, использованная в этом исследовании, была успешно отделена от RPE, однако возможно, что это было не всегда так. В отличие от здоровой сетчатки мышей дикого типа, сетчатки Rd1 демонстрируют негомогенную дегенерацию колбочек. Следовательно, возможно, что любая очевидная гетерогенная дегенерация может иметь частично артефактный характер.

Пространственно-временная характеристика дегенерации S- и M / L-колбочек в сетчатке Rd1

Перед исследованием дегенерации колбочек мы проверили время дегенерации палочковидных фоторецепторов в нашей когорте мышей Rd1 путем иммуномечения родопсина с использованием лунок. характеризуемый клон антитела RET-P1.Результаты показали, что смерть палочки — это раннее фенотипическое событие. К P21, только очень редкая совокупность стержней все еще была очевидна (дополнительный файл 3), которая была полностью потеряна на P28. Результаты согласуются с большим объемом исследований, проведенных на мышах Rd1 [2].

Наши результаты показали однородное распределение колбочек M / L-опсина ⁺ по всей сетчатке Rd1 на P14, в то время как имелся градиент конусов S-опсина ⁺ от относительно редкой популяции в верхней сетчатке до высокая плотность колбочек в нижней сетчатке (рис.1, 2, 3). Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями, в которых изучали распределение колбочек в сетчатке Rd1 на очень ранней стадии дегенерации [8, 9]. На P14, самой ранней проанализированной временной точке, подавляющее большинство колбочек S-opsin ⁺ и M / L-opsin ⁺ сохранили внешние сегменты, но сегменты, как правило, были деформированы или опухли по внешнему виду, в то время как эктопическое перераспределение опсинов к выжившим клеточным телам началось в различной степени (рис. 3; дополнительные файлы 4, 5).Высокая концентрация сильно меченых внешних сегментов на P14 делала идентификацию тела колбочек у целых пород проблематичной. К P21 значительная часть внешних сегментов дегенерировала (рис. 3; дополнительные файлы 4, 5). Следовательно, плотность тела колбочек измерялась только по P21.

Репрезентативные изображения колбочек S-опсина ⁺ и M / L-опсина ⁺ в целых количествах сетчатки на сетчатке у мышей C57BL / 6 дикого типа (WT) и мышей Rd1 из послеродового периода, с малым увеличением. день (P) 14 — P300.Иммунофлуоресценцию с двойной меткой проводили с использованием антител, направленных против S-опсина (красный) и M / L-опсина (зеленый). Тела клеток и внешние сегменты не могут быть легко различимы на этих изображениях с низким увеличением; однако топографическая картина дегенерации конуса очевидна. S верхний, I нижний, N носовой, T височный. Масштабная линейка: 500 мкм

Репрезентативные, с большим увеличением, изображения колбочек S-opsin ⁺ и M / L-opsin ⁺ в целых количествах сетчатки мышей Rd1 от постнатального дня (P) 14 до P300.Иммунофлуоресценцию с двойной меткой проводили с использованием антител, направленных против S-опсина (красный) и M / L-опсина (зеленый). Внешние сегменты обоих типов конусов интенсивно метятся на P14. К P45 большое количество внешних сегментов дегенерировало, что позволило лучше визуализировать тела колбочек. S-P верхняя периферическая сетчатка, S-C верхняя центральная сетчатка, I-C нижняя центральная сетчатка, I-P нижняя периферическая сетчатка. Масштабная линейка: 100 мкм

Репрезентативные изображения колбочек S-opsin ⁺ и M / L-opsin ⁺ в поперечных срезах сетчатки мышей Rd1 на постнатальные сутки (P) 14, P21 и P60. Двойное мечение иммунофлуоресценции в верхней ( a — c ) и нижней сетчатке ( d — f ) проводили с использованием антител, направленных против S-опсина (красный) и M / L-опсина (зеленый). Двойные колбочки экспрессируют как S-опсин, так и M / L-опсин и выглядят желтыми (стрелки). Шкала шкалы: 20 мм. IPL , внутренний плексиформный слой; INL , внутренний ядерный слой; ONL , внешний ядерный слой

Количественная оценка временной прогрессии дегенерации колбочек S-opsin ⁺ и M / L-opsin ⁺ у цельных животных выявила поразительную разницу между центральными и периферическими областями сетчатки, а также между внешними сегментами и телами клеток. Для клеток S-opsin ⁺ и M / L-opsin ⁺ дегенерация внешнего сегмента колбочки в центральной части сетчатки была эффективно завершена к P21 (рис.2, 4а, б). Напротив, дегенерация внешнего сегмента периферической сетчатки была более постепенной, хотя более 90% внешних сегментов S-opsin ⁺ и M / L-opsin ⁺ все еще дегенерировали с помощью P45 (рис. 2, 4a, б). До P30 сегменты M / L-opsin ⁺ в периферической сетчатке казались несколько более сохраненными, чем сегменты S-opsin ⁺ (Fig. 4a, b). Что касается клеточных тел, то также наблюдалась более быстрая дегенерация конусов S-опсина ⁺ и M / L-опсина ⁺ в центральной сетчатке, чем в периферической сетчатке (рис.2, 4в, г). Например, относительно P21 было только 25% выживания конусов S-opsin ⁺ в центральной сетчатке, но примерно 75% оставалось в периферической сетчатке (рис. 4c). Общая кинетика потери тел колбочек S-опсина ⁺ и M / L-опсина ⁺ в центральной и периферической сетчатке была сходной (рис. 4c, d), но наблюдалось заметное несоответствие в пространственной структуре вырождение каждого типа конуса. Была полушарная асимметрия в скорости дегенерации колбочек S-опсина ⁺ и M / L-опсина ⁺ ; таким образом, колбочки S-opsin ⁺ были замечательно хорошо сохранены в нижней сетчатке по сравнению с верхней сетчаткой (рис.1, 2, 3, 5a), в то время как колбочки M / L-opsin ⁺ были гораздо более устойчивы к дегенерации в верхней сетчатке по сравнению с нижней сетчаткой (рис. 1, 2, 3, 5b). Несоответствие становилось более выраженным по мере прогрессирования дегенерации конуса (рис. 1, 2, 3, 5a, b). К P300 небольшое количество колбочек M / L-opsin ⁺ выжило в верхней периферической сетчатке, в то время как небольшая популяция колбочек S-opsin ⁺ осталась в периферической нижней сетчатке (рис. 1, 2, 5a, b). ). Потеря S-опсина ⁺ и M / L-опсина ⁺ конусных клеточных тел в назальном и височном квадрантах сетчатки демонстрирует сходную кинетику друг для друга (рис.5в, г).

Графики, показывающие естественную историю дегенерации конусов S-опсина ⁺ и M / L-опсина ⁺ у мышей Rd1 с течением времени. a , b Количественная оценка S-опсина ⁺ и M / L-опсина ⁺ дегенерация внешнего сегмента конуса в центральной и периферической сетчатке. c , d Количественная оценка S-опсина ⁺ и M / L-опсина ⁺ дегенерация тельца колбочек в центральной и периферической сетчатке.Данные представляют собой среднее значение ± SEM

Пространственно-временная количественная оценка S-опсина ⁺ и M / L-опсина ⁺ дегенерация тела колбочек в верхнем и нижнем ( a , b ), а также назальном и временном ( c , d ) периферические квадранты сетчатки. Данные представляют собой среднее значение ± SEM

Чтобы поделиться видением результатов по белку опсина, мы использовали кПЦР для изучения уровней мРНК M / L- и S-опсина в сетчатке Rd1 (нормализованных к пулу из двух эталонных генов).По сравнению с сетчаткой дикого типа уровни мРНК S-опсина и M / L-опсина были ниже на P14, хотя различия не достигли значимости в это время (P = 0,43; P = 0,56, соответственно; рис. 6). После этого уровень мРНК M / L-опсина линейно снижался от P14 до P90, в этот момент он составлял 16% от уровня WT (фиг. 6a). Количество мРНК S-опсина снижалось незначительно быстрее, чем мРНК M / L-опсина, но также было снижено до 16% от уровня WT на P90 (фиг. 6c). По сравнению с P14 снижение мРНК M / L-опсина не было статистически значимым на P30 (P = 0.09; Рис. 6b), но уровень мРНК S-опсина был значительно ниже в тот же момент времени (P <0,05; Рис. 6d). Снижение мРНК опсина обоих колбочек было статистически значимым, начиная с P45 и далее. В целом данные КПЦР соответствовали данным, полученным при иммуногистохимии целых образцов и поперечных срезов.

Количественная оценка уровней мРНК M / L-опсина ( a , b ) и S-опсина ( c , d ) в сетчатке Rd1 от постнатального дня (P) 14 до P90 .Значения (представленные как среднее ± SEM) нормализованы к пулу двух эндогенных генов (GAPDH и циклофилин) и выражены относительно сетчатки дикого типа ( a , c ) и временной точки 14d Rd1 ( b , d ). ** P <0,01, *** P <0,001, по ANOVA с последующим апостериорным тестом множественного сравнения Даннета ( a , c против WT; b , d против 14 дней Rd1)

Исследование двойных колбочек в сетчатке Rd1

Вторая часть этого исследования включала характеристику популяции настоящих S-колбочек, настоящих M / L-колбочек и двойных колбочек в сетчатке мышей Rd1 в начале дегенерации колбочек, P14 и приблизительно в середине дегенерации, P60.Эти данные доступны в сетчатке мышей WT [15], но не в сетчатке Rd1. Целые ткани сетчатки иммуномечены антителами к S- и M / L-опсинам. Изображения периферической сетчатки были захвачены, предварительно обработаны, объединены, и плотности колбочек настоящих колбочек S-опсина, настоящих колбочек M / L-опсина и двойных колбочек затем количественно определены в каждом из четырех квадрантов сетчатки с использованием порогового значения цвета (см. « Методы »). На P14 были количественно определены внешние сегменты, а на P60 использовались клеточные тела (плюс любые выжившие внешние сегменты).Первоначально, однако, мы протестировали методологию, используя целиком сетчатку от мыши WT (см. Дополнительные файлы 6 и 7). Исследование сетчатки выявило 14% настоящих S-колбочек, 35% двойных колбочек и 50% настоящих M / L-колбочек, значения, которые не отличаются от ранее сообщенных [15].

На P14 верхняя сетчатка (рис.7, дополнительный файл 8), как и ожидалось, включала меньшую часть настоящих S-колбочек (15,6%) с гораздо большим количеством настоящих колбочек M / L-опсина (38,1%). и двойные конусы (40.4%). Напротив, нижняя сетчатка (рис. 7, дополнительный файл 9) содержала относительно одинаковое количество настоящих S-колбочек (37,5%), настоящих M / L-колбочек (27,2%) и двойных колбочек (35,3%). Носовая (рис.7, дополнительный файл 10) и височная (рис.7, дополнительный файл 11) области имели одинаковое количество настоящих S-колбочек (41,3%; 41,6% соответственно), настоящих конусов M / L-опсина (24,2%). ; 28,5% соответственно) и двойные конусы (34,5%; 29,9% соответственно).

Гистограммы, отображающие состав популяции колбочек в верхнем ( a ), нижнем ( b ), назальном ( c ) и височном ( d ) квадрантах сетчатки Rd1 на P14.Данные представляют собой среднее значение ± SEM

В соответствии с результатами пространственно-временной характеристики дегенерации S- и M / L-конусов, наблюдалось заметное расхождение в составе конусов между верхним (Рис. 8, Дополнительный файл 12) и нижним (Рис. 8, Дополнительный файл 13) сетчатка на P60. Верхняя сетчатка на P60 состояла из большинства двойных колбочек (53,7%), за которыми следовали настоящие M / L-колбочки (38,1%) и немногочисленная популяция настоящих S-колбочек (8,2%). Напротив, нижняя сетчатка на P60 содержала почти исключительно настоящие S-колбочки (97.7%) с небольшим количеством двойных колбочек (2,3%) и без идентифицируемых подлинных M / L-колбочек. Носовая (рис. 8, дополнительный файл 14) и височная (рис. 8, дополнительный файл 15) области имели сходный состав настоящих S-конусов (23,2%; 30,2%, соответственно), настоящих M / L-конусов (18,6%; 23,7% соответственно) и двойные конусы (46,3%; 58,1% соответственно). Что касается общей выживаемости колбочек в четырех квадрантах на P60, то есть комбинированного присутствия всех типов колбочек, результаты показали примерно в три раза большую общую выживаемость колбочек в нижней сетчатке (1,154,292 ± 42, 610 пикселей ² ) по сравнению с верхней ( 342,175 ± 30,593 пикселей ² ), носовой (402,722 ± 59,855 пикселей ² ) и временной (390,130 ± 52,139 пикселей ² ) квадранты.Эти результаты иллюстрируют замечательную выживаемость колбочек S-opsin ⁺ в периферических областях нижней сетчатки (см. Фиг. 8, дополнительный файл 13).

Гистограммы, отображающие состав популяции колбочек в верхнем ( a ), нижнем ( b ), назальном ( c ) и височном ( d ) квадрантах сетчатки Rd1 на P60. Данные представляют собой среднее значение ± SEM

Пространственно-временная характеристика микроглиальных ответов в сетчатке Rd1

В третьей части этого исследования мы исследовали количество и активацию микроглии / макрофагов в сетчатке Rd1 с использованием хорошо охарактеризованных антител к Iba1 и CD68.Iba1 представляет собой кальций-связывающий белок, экспрессируемый покоящейся и активированной микроглией, а также инфильтрирующими макрофагами, тогда как CD68 представляет собой гликопротеин, экспрессируемый только активированной фагоцитарной микроглией и макрофагами.

Мы обнаружили, что количество Iba1 + и CD68 + микроглии / макрофагов в сетчатке целого ряда Rd1 постепенно снижалось с P21 до P300 (рис. 9). Большинство (79,1%) клеток на P21 были активными и экспрессировали как CD68, так и Iba1. Эти активированные микроглии / макрофаги имели типичную амебовидную форму с редкими дендритами.К P60 67% микроглии Iba1 + все еще присутствовали в сетчатке и только 17,6% экспрессировали CD68. Неактивная микроглия имела типичную неподвижную морфологию с длинными дендритными отростками. К P300 осталось только 33,9% микроглии Iba1 + и только 2,6% были активными и экспрессировали CD68. Следовательно, профиль активации микроглии / притока макрофагов соответствовал дегенерации S- и M / L-колбочек в сетчатке Rd1 с высокой скоростью фагоцитарной активности, происходящей в пиковый период дегенерации колбочек.

Характеристика микроглиальных изменений в целых количествах сетчатки мышей Rd1 от постнатального дня (P) 21 до P300. a — c Репрезентативные, с малым увеличением, изображения целых тканей сетчатки от мышей P45, иммуномеченных на CD68 (красный) и Iba1 (зеленый). d — l Типичные изображения сетчатки Rd1 из P21, P60 и P300, иммуномеченные на CD68 (красный) и Iba1 (зеленый), с большим увеличением. Морфология Iba1-положительной микроглии изменяется от активированной амебоидной формы с втянутыми отростками на P21 (стрелки) до состояния покоя с разветвленными отростками на P300 (стрелка).Масштабные линейки: a — c 500 мкм; d — l 100 мкм. m Количественная оценка количества Iba1-положительных и CD68-положительных клеток с течением времени. Данные представляют собой среднее значение ± SEM

В поперечных срезах сетчатки Rd1 (рис. 10) большая популяция микроглии / макрофагов Iba1 + (62 клетки / мм) присутствовала в ONL и внутреннем / внешнем сегментах на P14, где происходит дегенерация фоторецепторов. Эти внешние клетки сетчатки характеризовались активированной амебоидной формой, тогда как резидентная популяция микроглии Iba + во внутренней сетчатке демонстрировала неподвижную (разветвленную) морфологию.Популяция клеток Iba1 + во внешней сетчатке была значительно уменьшена на Р21 (26 клеток / мм) и затем постепенно уменьшалась, при этом очень мало клеток Iba1 + оставалось во внешней сетчатке на Р75 (9 клеток / мм).

Характеристика микроглиальных изменений в поперечных срезах сетчатки мышей Rd1. a — e Репрезентативные изображения иммуномечения Iba1 у мышей C57BL / 6 дикого типа (WT) и у мышей Rd1 с 14-го по постнатальный день (P) до P75. В сетчатке WT Iba-положительная микроглия ограничена нервным волокном, внутренним плексиформным и внешним плексиформным слоями и имеет разветвленные клеточные отростки ( a , стрелка).У мышей Rd1 Iba1-положительная микроглия во внутренней сетчатке сохраняет свой разветвленный вид (b, , стрелка), но наблюдается скопление микроглии с амебовидным видом (стрелка) во внешнем ядерном слое (ONL) на P14, который совпадает с дегенерацией фоторецепторов ( b ). К P21 плотность микроглии Iba1 в ONL существенно снизилась ( c , стрелка) и продолжает снижаться в более поздние моменты времени ( d , e , стрелка). f Количественная оценка количества Iba1-положительных клеток в ONL с течением времени. Масштабная линейка = 50 мкм. GCL слой ганглиозных клеток, INL внутренний ядерный слой

границ | Соединение стержня и конуса модулирует фотопические ответы ERG в сетчатке мыши

Введение

Электроретинограмма (ЭРГ) — широко используемый неинвазивный инструмент для объективного измерения зрительной функции глаза (Heckenlively and Arden, 2006; Pinto et al., 2007; Weymouth and Vingrys, 2008).Сетчатка большинства млекопитающих содержит два типа фоторецепторов: палочки и колбочки, которые различаются своей светочувствительностью и кинетикой ответа. У полностью адаптированных к темноте животных стимуляция тусклым светом активирует только палочковидные фоторецепторы, которые можно использовать для изучения опосредованных стержнями путей сетчатки, в то время как опосредованные конусами пути сетчатки обычно изучаются с использованием адаптирующегося фонового света для насыщения стержневых фоторецепторов. Хорошо известно, что световая адаптация изменяет опосредованные конусом фотопические ответы ERG (Peachey et al., 1992а, б, 1993; Ekesten et al., 1999; Буй и Форчун, 2006). В частности, максимальная амплитуда фотопической b-волны постепенно увеличивается в процессе световой адаптации. Такой индуцированный световой адаптацией рост фотопических ERG-ответов наблюдался у нескольких видов, включая людей и мышей (Burian, 1954; Armington and Biersdorf, 1958; Gouras and MacKay, 1989; Peachey et al., 1993). Однако механизм того, как световая адаптация вызывает изменения в ответе ERG, все еще обсуждается (Alexander et al., 2006). Недавно было высказано предположение, что разделение щелевых контактов между фоторецепторами палочки и колбочки в сетчатке может способствовать усилению фотопической ЭРГ во время световой адаптации (Heikkinen et al., 2011; Bush et al., 2019).

В этом исследовании мы исследовали влияние световой адаптации на фотопическую ERG мышей и роль разъединения щелевых соединений. В сетчатке млекопитающих коннексин 36 образует щелевые соединения между фоторецепторами, которые опосредуют соединение палочка-колбочка (Bloomfield and Völgyi, 2009; Zhang et al., 2015; Bolte et al., 2016; Джин и Рибелайга, 2016). Чтобы проверить гипотезу о том, что изменения амплитуды ЭРГ во время световой адаптации отражают модуляцию связи палочки-колбочки в сетчатке, мы зарегистрировали фотопические ответы ЭРГ у мышей с нокаутом коннексина 36 (Cx36KO) и в глазах, которым вводили меклофенамовую кислоту (MFA). блокиратор щелевых соединений. Кроме того, мы также проследили амплитуды фотопических ответов ERG с возрастом у мышей rd10 во время прогрессирующей потери ими палочкообразных фоторецепторов.

Соединение стержень-колбочка служит вторичным путем для сигнала стержня в сетчатке млекопитающих (Deans et al., 2002; Völgyi et al., 2004; Файн и Сампат, 2018). Этот вторичный палочковый путь активирует подгруппу ганглиозных клеток сетчатки и обеспечивает зрение в мезопических условиях (Völgyi et al., 2004). В этом исследовании мы использовали мерцание ERG для изучения функционального преимущества соединения стержень-колбочка в сетчатке млекопитающих. Ранее мы показали, что зависимость частотной характеристики для ответов ЭРГ может быть определена гармоническими ответами на одиночный импульсный фликкер-стимул (Qian and Shah, 2011). Импульсный фликкер-ответ ERG, зарегистрированный у мышей дикого типа и мышей Cx36KO, указывал на усиление сигнала от фоторецепторов к внутренней сетчатке через соединение стержень-конус в мезопических условиях.

Материалы и методы

Экспериментальные животные

Все процедуры с участием животных проводились в соответствии с утвержденным протоколом NIH по уходу за животными и руководящими принципами ARVO по гуманному использованию животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Мыши с нокаутом коннексина 36 (Cx36KO) были созданы из штамма C57BL6 доктором Дэвидом Полом (Deans et al., 2001) и содержались группой доктора Джеффри Даймонда в Национальном институте неврологических расстройств и инсульта, NIH. Мыши C57BL / 6J (WT) и rd10 были получены от Jackson Labs (Бар-Харбор, Мэн, США).Всех мышей содержали в обычных помещениях для животных при цикле свет / темнота 50 люкс 14:10 ч.

Запись электроретинограммы

Все процедуры проводились при тусклом красном свете. Мышей адаптировали к темноте в течение ночи (~ 20 ч) и вводили анестезию внутрибрюшинно. введение смеси кетамина (100 мг / кг) / ксилазина (6 мг / кг). Зрачки были расширены с помощью 2% тропикамида и 0,5% фенилэфрина. Животных помещали на нагревательную пластину, чтобы поддерживать температуру тела 37 ° C. Фотопические ЭРГ-ответы регистрировали с помощью системы Espion E2 (Diagnosys), соединенной либо с обычным колордомом с четырьмя светодиодами (синий, 455 нм; зеленый, 516 нм; янтарный, 595; и красный, 636 нм), либо с ультрафиолетовым колордомом с синим светодиодом. заменен УФ-светодиодом (367 нм).Ответы регистрировали с помощью проволочного электрода с золотой петлей, помещенного в центре роговицы, электрода сравнения во рту и заземляющего электрода в хвосте. Фотопические ЭРГ были зафиксированы через 0, 5, 10 и 15 мин после появления адаптивного света (зеленый, 20 кд / м ² ) до серии увеличивающихся (<4 мс) интенсивностей вспышек (0,3, 1, 3). , 10, 30 и 100 кд.с / м ² для зеленых вспышек, 338, 1,13 × 10 ³ , 3,38 × 10 ³ , 1,13 × 10 ⁴ , 3,38 × 10 ⁴ , 1 .13 × 10 ⁵ фотонов / мкм ² для УФ-вспышек). ЭРГ с мерцанием пульса регистрировали с помощью цепочки зеленых вспышек с частотой 6 Гц, подаваемых с частотой 0,001, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5 и 10 кд.с / м ² .

Интравитреальная инъекция

Интравитреальных инъекций выполняли в соответствии с опубликованным протоколом (Qian et al., 2008). Все процедуры проводились при тусклом красном свете. Адаптированных к темноте мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (6 мг / кг) и одной капли 0.На роговицу наносили местный анестетик 5% тетракаина. Один микролитр препарата (MFA, 200 мкМ) вводили в стекловидное тело мыши. Инъекции проводили через склеру на носовой стороне глаза примерно на 1 мм кзади от лимба с помощью шприца Nanofil 10 мкл со съемной иглой 35-го размера (World Precision Instruments, Inc., Сарасота, Флорида, США). Концентрация MFA в стекловидном теле была оценена как 10 мкМ, исходя из предположения, что полная смесь и объем стекловидного тела составляет ~ 20 мкл для глаза мыши (Wang et al., 2015). Фосфатный буферный раствор (PBS) использовали в качестве контроля инъекции. Регистрацию ЭРГ проводили через 2 ч после инъекции у животных, содержащихся в темноте.

Анализ данных и статистический анализ

ответов ERG для обоих глаз мышей, и для анализа использовались усредненные значения. Данные «интенсивность-реакция» соответствовали уравнению Нака-Раштона:

, где R _max — максимальная амплитуда отклика, I — интенсивность вспышки, n — коэффициент Хилла, а K — константа полунасыщения.Колебательные потенциалы (ОП) выделялись с помощью полосового (40–200 Гц) цифрового фильтра (Ramsey et al., 2006). Амплитуды каждой гармонической составляющей для импульсных мерцаний ERG-ответов были получены из дискретного преобразования Фурье с использованием Matlab Signal Processing Toolbox (The Mathworks, Бостон, Массачусетс, США) из каждой 10-секундной записи формы волны ERG (Shah et al., 2010). ). Данные были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистические данные ( t -тест и ANOVA) выполняли с помощью Prism (версия 8, GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США).

Результаты

Влияние световой адаптации на мышь Photopic ERG

Поскольку циркадный ритм модулирует фотопическую ЭРГ и сцепление фоторецепторов (Cameron and Lucas, 2009; Sengupta et al., 2011; Jackson et al., 2012; Zhang et al., 2015), мы одновременно выполняли регистрацию ЭРГ. дня (т. е. 13:00) для всех экспериментов, описанных в этом исследовании. Рисунки 1, 2 иллюстрируют эффекты насыщающего палочки фонового света на световые реакции ERG у мышей. Поскольку сетчатка мышей содержит пигменты колбочек, чувствительные как к коротковолновой (УФ), так и к средневолновой (зеленый) длине, мы использовали как УФ, так и зеленый свет, чтобы исследовать опосредованные колбочками ответы ЭРГ.На рисунках 1A, B показаны примеры формы волны ERG, вызванной зеленым и УФ-вспышками, соответственно, в начале адаптации фонового света (зеленый 20 кд / м ² ) в 0 мин (левые панели) и после 15 мин световой адаптации. (правые панели). Обобщенные зависимости интенсивности-отклика для амплитуд b-волн, вызванных зеленым и ультрафиолетовым фонариками, показаны на рисунках 2A, B, соответственно, через 0, 5, 10 и 15 минут после начала адаптации света. Световая адаптация изменяет как чувствительность, так и максимальную амплитуду фотопической ЭРГ мыши.Непрерывные кривые были подогнаны к уравнению Нака-Раштона со значениями полунасыщения K и R _max , нанесенными в зависимости от времени световой адаптации на рисунках 2C, D, соответственно. Для значений K адаптация фона постепенно снижала чувствительность к зеленой вспышке ( p <0,0001, односторонний дисперсионный анализ), а 15-минутная световая адаптация снижала чувствительность к зеленой вспышке в 2,4 ± 0,5 раза ( n = 5 ). Напротив, чувствительность к УФ-вспышке относительно не меняется при адаптации зеленого фона ( p = 0.89, односторонний дисперсионный анализ). С другой стороны, такая же световая адаптация приводила к аналогичным улучшениям ( p = 0,92) максимальной амплитуды (R _max ) фотопической ЭРГ мыши для зеленых вспышек (2,3 ± 0,3 раза), что и для УФ-вспышек (2,4 ± 0,4 раза, n = 5). Амплитуды a-волны фотопической ЭРГ также увеличивались при световой адаптации (зеленая вспышка в 1,79 ± 0,18 раза и УФ-вспышка в 1,48 ± 0,10 раза). Однако a-волна фотопической ERG содержит множество компонентов с большим вкладом от OFF-биполярных клеток в сетчатке млекопитающих (Bush and Sieving, 1994; Frishman, 2006).Кроме того, амплитуда фотопической a-волны мала, что может привести к загрязнению шума при записи. По этим причинам в данном исследовании мы сосредоточились на анализе фотопической b-волны.

Рисунок 1 . Примеры фотопической зеленой и ультрафиолетовой электроретинограммы (ЭРГ) во время световой адаптации. Примеры форм волны нормальной фотопической ERG мыши, вызванной зеленым светом (A) и UV (B) , мигают сразу (0 мин) и через 15 мин после появления адаптирующегося фонового света.Ответы на зеленые и УФ-вспышки регистрировали для одного и того же глаза мыши.

Рисунок 2 . Влияние световой адаптации на зеленый и УФ-ответы ERG. Усредненные отношения интенсивности-ответа для зеленых ответов (A) и UV (B) у нормальных мышей ( n = 5), вызванных через 0, 5, 10 и 15 минут после начала адаптации света. Данные соответствовали уравнению Нака-Раштона. Коэффициент усиления световой адаптации (LAEF) определяется как отношение амплитуд b-волн, зарегистрированных после 15-минутной световой адаптации, к амплитудам, наблюдаемым в начале адаптации света (показано в виде скобки в A ). (C) Влияние световой адаптации на коэффициент чувствительности (K) для ответов, вызываемых зеленым (левая ось) и УФ (правая ось) вспышками. (D) Влияние световой адаптации на максимальную амплитуду ответа (R _max ) для ответов, вызываемых зелеными и УФ-вспышками.

Влияние соединения щелевого соединения на мышь Photopic ERG

Поскольку ответы ERG R _max ERG на зеленые и УФ-вспышки демонстрировали схожее увеличение амплитуды, мы использовали ответы на зеленую вспышку для изучения механизма этого увеличения амплитуды во время световой адаптации.Было высказано предположение, что опосредованные световой адаптацией изменения в сцеплении фоторецепторов палочка-колбочка способствуют увеличению амплитуды ERG во время световой адаптации (Heikkinen et al., 2011; Bush et al., 2019). Чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали эффекты адаптации к фоновому свету на световые ответы ERG у мышей с нокаутом коннексина 36 (Cx36KO), у которых отсутствуют щелевые соединения между фоторецепторами в сетчатке (Güldenagel et al., 2001; Deans et al., 2002; Asteriti et al., 2017). На рис. 3А показаны кривые ЭРГ для зеленых вспышек в начале (0 мин) и через 15 мин после адаптации к фоновому свету.В отличие от мышей дикого типа (рис. 1A), 15-минутная световая адаптация у мышей Cx36KO оказала минимальное влияние на ответы ERG, вызванные световыми вспышками высокой интенсивности (10, 30 и 100 кд.с / м ² ), в то время как ответы на тусклые вспышки (0,3, 1 и 3 кд.с / м ² ) были уменьшены, что указывает на десенсибилизацию в результате световой адаптации. Усредненные отношения интенсивности-отклика, полученные после 0, 5, 10 и 15 минут световой адаптации, показаны на рисунке 3B. Непрерывные кривые показаны, подогнанные к уравнению Нака-Раштона, со значениями K и R _max , показанными на рисунках 3C, D, соответственно.Значения для элементов управления WT повторно нанесены пунктирными линиями по сравнению со значениями, показанными на рисунках 2C, D. По сравнению с мышами дикого типа (WT) световая адаптация имела аналогичные эффекты в снижении чувствительности (K) фотопического ответа ERG у мышей Cx36KO. Нет статистической разницы в значениях K между мышами WT и Cx36KO в любой момент времени во время световой адаптации (рис. 3C). С другой стороны, мутация коннексина 36 устранила вызванное световой адаптацией усиление максимальной амплитуды (R _max ; фигура 3D) по сравнению с мышью WT.

Рисунок 3 . Влияние световой адаптации на световые ответы ERG мышей Cx36ko. (A) Примеры фотопической формы волны ERG, вызванной от мыши Cx36ko зелеными вспышками сразу (0 мин, красные следы) и через 15 мин после начала (черные следы) адаптирующегося фонового света. (B) Усредненные отношения интенсивности-отклика через 0, 5, 10 и 15 минут после начала адаптации света. Данные соответствовали уравнению Нака-Раштона с параметрами K, показанными в (C) , и R _max , показанными в (D) .Пунктирными линиями обозначены данные для мышей WT, отображенные на фиг. 2. ** p <0,01; *** р <0,001.

Чтобы количественно оценить увеличение амплитуды b-волны ERG во время световой адаптации, мы вычислили отношение амплитуд b-волны, записанных после 15-минутной световой адаптации, к амплитудам, наблюдаемым в начале адаптирующегося света, что называется коэффициентом усиления световой адаптации LAEF (как ранее показано на рисунке 2A). Для мышей C57b / 6J дикого типа LAEF в среднем составлял 2,64 ± 0,29 ( n = 5).У мышей Cx36KO световая адаптация мало влияла на амплитуды b-волн, со средним LAEF 1,136 ± 0,18 ( n = 6; Рисунок 4B). Точно так же интравитреальная инъекция MFA, блокатора щелевых соединений, также значительно снизила эффекты световой адаптации на амплитуды b-волн ERG у мышей WT, с LAEF 1,42 ± 0,28 ( n = 5), что значительно отличалось ( p <0,05), чем LAEF контрольных животных, которым вводили физиологический раствор (LAEF = 2,23 + 0,33, n = 4; Рисунок 4B).Осциллограммы ERG у мыши, интравитреально инъецированной MFA с интенсивностью 100 кд.с / м ² вспышек показаны на Фигуре 4A (левая панель) в начале (0 мин) и через 15 минут после адаптации к фоновому свету. С другой стороны, не наблюдалось статистической разницы в значениях LAEF между контрольными группами, которым вводили физиологический раствор, и контролями без инъекций ( p = 0,56; фигура 4B). Кроме того, ERG, записанная у мышей, которым вводили MFA, показала значительно большую амплитуду (107,9 ± 7,3 мкВ, p <0,01), чем у контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор (70.3 ± 7,7 мкВ).

Рисунок 4 . Фактор усиления световой адаптации B-волны (LAEF). LAEF определяется как отношение максимальной амплитуды, возникающей после 15-минутной световой адаптации, к амплитуде, наблюдаемой в начале адаптирующего света. (A) Примеры формы волны ERG, вызванной 100 кд.с / м ² вспышек на 0 и 15 мин световой адаптации для мышей, которым интравитреально инъецировали меклофенамовую кислоту (MFA), rd10 на P21 и rd10 на P31. (B) LAEF, полученное при каждом условии: контроль, n = 5; Cx36KO, n = 6; MFA, n = 5; P21 rd10, n = 8; P31 rd10, n = 8. (C) Влияние продолжительности адаптации к темноте на LAEF: 20 ч (то же, что и контроль в A ), n = 5; 30 мин, n = 4; 1 ч, n = 3. * p <0,05; ** p <0,01; *** р <0,001.

Эффекты дегенерации стержневых фоторецепторов на Photopic ERG у мышей

Если соединение палочкообразных фоторецепторов способствует изменениям, наблюдаемым на фотопической ERG мышей во время световой адаптации, уменьшение щелевых контактов, таких как во время дегенерации палочковидных фоторецепторов, также должно изменять эффекты световой адаптации на фотопические ERG-ответы.Мы исследовали влияние световой адаптации на фотопические ответы ERG мышей rd10, широко используемой мышиной модели дегенерации сетчатки (Chang et al., 2002; Zhao et al., 2015; Li et al., 2018). Пример сигналов ЭРГ от мыши rd10 на P21 (средняя панель) и P31 (правая панель) до 100 кд.с / м ^{2 вспышки} в начале (0 мин) и через 15 мин после адаптации фонового освещения показаны на рисунке 4A. . На P21 у мышей rd10 большие участки палочковидного фоторецептора сохраняются в сетчатке (Zhao et al., 2015; Li et al., 2018), а фотопическая ERG показала такое же усиление b-волны, что и контроль дикого типа, с LAEF 2,55 ± 0,19 ( n = 8, p = 0,99; Рисунок 4B). Однако на P31 большая часть палочковых фоторецепторов в сетчатке мышей rd10 дегенерировала (Zhao et al., 2015; Li et al., 2018), и наблюдалось значительно сниженное усиление b-волны (LAEF 1,54 ± 0,12, p <0,001; рис. 4B), предполагая, что LAEF зависит от количества неповрежденных щелевых контактов между фоторецепторами палочки и колбочки в сетчатке.В соответствии с этим представлением амплитуды b-волн фотопической ЭРГ в начале световой адаптации были больше для мышей P31 rd10 (139,3 ± 19,1 мкВ), чем ответы, вызванные при P21 (113,3 ± 16,7 мкВ), хотя разница не наблюдается. статистически значимо ( p = 0,16). После 15-минутной световой адаптации амплитуды b-волн на P31 были меньше (227,4 ± 24,9 мкВ, p = 0,17), чем ответы на P21 (259,5 ± 21,1 мкВ), скорее всего, из-за дегенерации фоторецепторов колбочек.

Влияние продолжительности адаптации к темноте на фотопическую реакцию ERG мыши

Поскольку модуляция щелевого перехода фоторецептора имеет медленный ход времени, мы исследовали влияние различной продолжительности адаптации к темноте на LAEF. Контрольные мыши, показанные в предыдущем разделе, адаптировались к темноте в течение ночи (около 20 часов). Световая адаптация увеличила амплитуды b-волн в 2,64 ± 0,29 раза ( n = 5). Гораздо меньший LAEF B-волны наблюдался у мышей, использующих более короткое время адаптации к темноте (рис. 4C).Когда мышей адаптировали к темноте всего за 30 минут до регистрации ERG, LAEF = 1,55 ± 0,42 ( n = 4). Это снижение статистически значимо ( p <0,05). Увеличение времени адаптации к темноте также увеличивало усиление адаптации к свету (LAEF). После 1 часа адаптации к темноте LAEF увеличился до 1,83 ± 0,07 ( n = 3, p <0,05), но все еще был намного меньше, чем значение, наблюдаемое после адаптации к темноте в течение ночи (Рисунок 4C). Односторонний анализ ANOVA объединенного набора данных показывает, что LAEF значительно зависит от времени адаптации к темноте ( p <0.05).

Влияние соединения щелевого соединения на фликкер ERG

Соединение стержень-колбочка служит вторичным сигнальным путем стержня в сетчатке. Мы использовали импульсную фликкерную ERG, чтобы исследовать, как на временные свойства зрительной системы влияет связь фоторецепторов. Как описано ранее (Qian and Shah, 2011), одиночный импульс мерцания состоит из серии гармоник, каждая из которых имеет одинаковую энергию. Следовательно, однократный импульс мерцания может обеспечить частотно-частотную зависимость для ответов ЭРГ менее 30 Гц.На рисунке 5A показаны примеры мерцания сигналов ERG при трех уровнях интенсивности вспышки для мыши WT (левая панель) и Cx36KO (средняя панель). Для сравнения формы волны ЭРГ на правой панели рисунка 5А показаны нормализованные по амплитуде формы волны мерцания ЭРГ. Для ответов, вызванных либо тусклыми (верхний ряд), либо яркими (нижний ряд) вспышками, формы сигналов ERG от мышей WT и Cx36KO были очень похожи. С другой стороны, для ответов, вызванных мезопическими вспышками (средний ряд), мерцание ERG, записанное от WT (указано стрелками), имело гораздо более узкую форму волны, чем те, которые были записаны от мышей Cx36KO.

Рисунок 5 . Мерцающие ответы ERG. ERG-ответы, вызванные импульсным мерцанием с частотой 6 Гц у мышей дикого типа и мышей Cx36KO. (A) Примеры формы волны мерцания ERG при трех интенсивностях стимула для мыши WT (левая панель) и мыши Cx36KO (средняя панель). Нормированные по амплитуде формы волны показаны на правой панели, иллюстрируя более узкую форму волны ответа для WT (указана стрелками), чем у Cx36KO, вызванного мезопическим световым стимулом (средний ряд). (B) Амплитуда основной частоты (6 Гц). (C) Отношение 4-й гармоники (24 Гц) к основной амплитуде отклика. В то время как интенсивности как скотопической, так и фотопической вспышки показали схожую 4-ю гармоническую составляющую для мышей WT ( n = 6) и Cx36KO ( n = 4), существует гораздо более высокая 4-я гармоническая составляющая для WT и мезопических интенсивностей света, чем у мышей. Мыши Cx36KO. * p <0,05.

Для лучшего количественного определения мерцания ERG-ответов был проведен анализ частотных компонентов мерцания ERG (Qian and Shah, 2011).Отношения интенсивности-отклика основной амплитуды, вызванной частотой импульсов 6 Гц с увеличением интенсивности вспышки зеленого светодиода у мышей дикого типа и мышей Cx36KO, показаны на рисунке 5B. Подобно их отличиям от вспышки ERG от WT (рис. 3D), мыши Cx36KO имеют несколько меньшие амплитуды ответа ERG на мерцание при разных адаптационных фонах. Взаимосвязь интенсивности-ответа для обеих мышей демонстрирует сходную картину и может быть разделена на три области. Для интенсивностей вспышек в скотопической области (менее 0.02 кд.с / м ² ), амплитуды отклика увеличивались с интенсивностью вспышки, а основные амплитуды достигли пика на уровне 0,02 кд.с / м ² , что указывает на активацию пути первичного стержня в сетчатке. Для интенсивностей вспышек в мезопической области (0,02–0,5 кд.с / м ² ) амплитуды отклика уменьшаются с интенсивностью вспышки, указывая на постепенное насыщение пути первичного стержня. Здесь ответ мышей WT был больше, чем у Cx36KO. Для яркости вспышки в фотопической области (> 0.5 кд.с / м ² ), мерцание снова увеличивается с интенсивностью стимула, указывая на активацию колбочек в сетчатке (Lei, 2012). Мы использовали отношение четвертой гармоники (24 Гц отклика) к основной в качестве показателя для исследования временных свойств мерцания ERG-ответа, вызванного различной интенсивностью стимула, и результаты показаны на рисунке 5C. Отношения были намного меньше для ответов, вызванных скотопическими стимулами (все меньше 0,05), тогда как ответы, вызванные фотопическими стимулами, были намного выше (все больше 0.2), что согласуется с тем, что колбочковые пути имеют гораздо лучшие временные ответы, чем первичный стержневой путь в сетчатке. Кроме того, у мышей Cx36KO и WT были сходные значения гармонического отношения для световых стимулов в скотопической и фотопической областях, что указывает на то, что у этих двух мышей используются сходные пути первичных стержней и колбочек. С другой стороны, для световых стимулов в мезопической области отношения были постоянно выше у мышей WT, чем у мышей Cx36KO, что указывает на то, что вторичный сигнальный путь стержня через соединение стержень-конус обеспечивает усиленные временные ответы на сигнал стержня в зрительная система.

Влияние адаптации фона на колебательные потенциалы

При сравнении фотопических сигналов ERG, записанных у мышей дикого типа и мышей Cx36KO, примеры их нормализованных ответов показаны на рисунке 6A, одно из основных различий — это амплитуда вейвлетов OP, наложенных на их b-волну ERG. Фотопические ERG-ответы мышей с полосовой фильтрацией на 100 кд.с / м ² зеленых вспышек использовали для исследования OP в форме волны ERG. Ответы на максимальную интенсивность стимула были выбраны, чтобы избежать осложнений, связанных с изменением как чувствительности, так и амплитуды во время световой адаптации.Усредненные OP, суммированные из 6 вейвлетов для мышей дикого типа и мышей Cx36KO после 15-минутной световой адаптации, показаны в виде гистограммы на фиг. 6B. В ответах ERG мышей дикого типа количество OP было значительно выше, чем у мышей, лишенных коннексина 36 ( p <0,001). Эта разница сохранялась даже после нормализации их амплитуд b-волн (0,84 ± 0,07 для WT и 0,32 ± 0,07 для Cx36KO, p <0,0001).

Рисунок 6 . Влияние световой адаптации на амплитуды колебательного потенциала (ОП). (A) Сравнение форм волны ERG, вызванных 100 кд.с / м ² вспышек и нормализованных к их соответствующей амплитуде b-волны от мыши WT и Cx36KO, демонстрируя разницу в амплитудах OP в ответах. (B) Усредненные амплитуды OP (суммированные из первых шести вейвлетов) для ответов, вызванных от мышей WT ( n = 5) и Cx36KO ( n = 6). (C) Примеры формы волны OP мыши WT и Cx36KO, цифровой изолированной от ответов ERG через 0, 5, 10 и 15 мин после появления адаптирующегося света. (D) Усредненные амплитуды b-волны ERG и OP WT и OP Cx36KO во время световой адаптации ( n = 5). ** p <0,01; *** p <0,001 для разницы амплитуд ОП между мышами WT и Cx36KO. (E) ERG b-волна и OP мышей WT, нормализованные к значению во время адаптации света. Также показаны отношения ОП к амплитудам b-волн.

У мышей WT амплитуды ОП также увеличиваются с адаптацией к свету.На рисунке 6C показаны примеры формы волны OP, полученной от WT и мыши Cx36KO, записанной на 0, 5, 10 и 15 мин световой адаптации. Суммарные размах амплитуд первых четырех пиков OP были нанесены на график на фиг. 6D; вместе с измеренными амплитудами b-волн для WT. Для мышей WT ответы OP демонстрировали аналогичную тенденцию постепенного увеличения амплитуды во время световой адаптации, тогда как ответы OP мышей Cx36KO сохранялись на относительно постоянном уровне во время световой адаптации. На рисунке 6E представлены графики ответов WT, нормализованные к их значению во время появления фона ( t = 0), снова иллюстрирующие аналогичные эффекты световой адаптации на амплитуды OP и b-волн в WT.Следовательно, световая адаптация мало влияла на соотношение суммированных амплитуд OP и b-волны у мышей WT. Поскольку было показано, что ОП флеш-ЭРГ возникают в проксимальных отделах сетчатки из-за участия тормозящего внутреннего контура сетчатки (Wachtmeister and Dowling, 1978; Wachtmeister, 1998, 2001), эти результаты предполагают, что фоновая адаптация оказывает незначительное дополнительное влияние на внутреннюю сетчатку. ответы сетчатки, измеренные OP.

Обсуждение

В этом исследовании мы исследовали эффекты фонового адаптационного света, насыщающего палочки, на фотопическую ERG у мышей.Наши результаты по b-зубцу ЭРГ показывают, что во время световой адаптации происходит постепенное снижение ее чувствительности (K) и увеличение амплитуды ответа (R _max ; Рисунки 1, 2). За исключением небольшой доли настоящих S-колбочек (около 5% от общей популяции колбочек), большинство фоторецепторов колбочек мыши (M-колбочки) экспрессируют как УФ, так и зеленые опсины, что выявлено с помощью иммуноокрашивания и электрофизиологических записей (Любарский и др., 1999; Applebury et al., 2000; Haverkamp et al., 2005; Никонов и др., 2005). Следовательно, снижение чувствительности наблюдалось только для ответа, вызванного зеленым светом, но не для ответа, вызванного УФ-светом, что указывает на минимальное перекрестное взаимодействие между опсин-опосредованными зелеными и УФ-конусами сигнальными путями в М колбочки в сетчатке мыши. С другой стороны, как зеленый, так и УФ-ответы ERG были одинаково усилены во время световой адаптации, предполагая, что может быть задействован общий механизм увеличения амплитуды фотопической ERG.Кроме того, ОП фотопической ЭРГ следовали за тем же ходом времени увеличения амплитуды с адаптацией, что и волна b (рис. 6), что позволяет предположить, что модуляция фотопической реакции ЭРГ адаптацией к фоновому свету преобладает за счет изменений этих ответов, происходящих во внешнем пространстве. сетчатка.

Было высказано предположение, что индуцированные светом изменения в соединении стержень-колбочка в сетчатке вносят вклад в изменения светового ответа ERG во время световой адаптации (Heikkinen et al., 2011; Bush et al., 2019).Тем не менее, щелевые соединения широко распространены в сетчатке млекопитающих (O’Brien and Bloomfield, 2018). Помимо образования щелевых соединений между фоторецепторами, Cx36 также экспрессируется в амакринных клетках AII и опосредует связывание амакриновых клеток между AII и связывание между клетками AII и ON-биполярными клетками. Электрическое соединение между амакриновыми клетками AII и биполярными клетками колбочек служит основным сигнальным путем стержня (Hartveit and Veruki, 2012). Кроме того, MFA также является неизбирательным блокатором щелевых контактов.Хотя это исследование явно не предоставило прямых доказательств роли связи стержень-конус, наши результаты согласуются с гипотезой о том, что изменение электрической связи фоторецепторов модулирует изменения фотопической реакции ERG во время световой адаптации.

После длительной адаптации к темноте щелевые контакты между фоторецепторами палочки и колбочки открываются, что обеспечивает электрическую связь между обоими типами фоторецепторов (Li et al., 2013; O’Brien, 2019). В темноте фотоответы, инициированные фоторецепторами колбочек, будут шунтироваться на палочки, и только часть сигнала будет передаваться на внутреннюю сетчатку.Во время световой адаптации щелевые контакты между фоторецепторами палочки и колбочки постепенно закрываются, и больше фотоответа колбочек поступает во внутренние нейроны сетчатки. В этом исследовании мы дополнительно подтверждаем эту гипотезу (рисунки 3, 4). Во-первых, у мышей Cx36KO, у которых отсутствуют щелевые соединения между фоторецепторами (Güldenagel et al., 2001; Deans et al., 2002; Abd-El-Barr et al., 2009), отсутствует усиление светового ответа ERG на свету. приспособление. Во-вторых, усиление фотопических ответов ERG было значительно снижено внутриглазной инъекцией MFA, блокатора щелевого соединения при соединении стержень-конус.В-третьих, способность индуцированного световой адаптацией (LAEF) увеличения фотопической ERG прогрессивно снижается у мышей rd10, когда происходит потеря значительной части палочковых фоторецепторов. Интересно отметить, что хотя палочковые фоторецепторы уже начали дегенерировать на P21 в сетчатке rd10 (Zhao et al., 2015; Li et al., 2018), аналогичный LAEF наблюдался у мышей WT (Рисунок 4A). Вполне вероятно, что только первое кольцо палочковых фоторецепторов непосредственно рядом с колбочками могло действовать как сток для фотоответов колбочек.Следовательно, даже несмотря на то, что большое количество палочек дегенерировало на P21 для сетчатки rd10, все еще существует значительное количество палочек непосредственно рядом с каждым фоторецептором колбочек, как у мышей WT. На P31 палочковые фоторецепторы сильно дегенерируют у мышей rd10, и LAEF значительно снижается.

Индуцированная светом модуляция связывания фоторецепторов опосредуется изменением фосфорилирования белков коннексина 36 в этих клетках (Li et al., 2013; O’Brien, 2019). Такие изменения фосфорилирования происходят медленно.Точно так же мы также заметили медленные изменения LAEF во время адаптации к темноте. После 1-часовой адаптации к темноте, LAEF составляет лишь половину от того, что наблюдается после адаптации к темноте в течение ночи у мышей WT. С другой стороны, возможно, что дефосфорилирование еще не идентифицированной фосфатазой может разъединять щелевые соединения палочка-колбочка с относительно более быстрым течением времени (O’Brien, 2019), поскольку во время фотопической реакции ERG наблюдаются значительные изменения. 15 мин световой адаптации (рисунки 1, 2).

Соединение стержень-колбочка обеспечивает вторичный сигнальный путь стержня в сетчатке млекопитающих (Deans et al., 2002; Völgyi et al., 2004; Файн и Сампат, 2018). Этот вторичный путь стержня позволяет сигналу стержня использовать быстро реагирующие конические контуры внутренней сетчатки (Nelson, 1977). Следовательно, зрительная система демонстрирует более высокие временные ответы в мезопических условиях с неповрежденным этим путем, чем при использовании простой смеси палочко-конусных путей (рис. 5). Активность этого вторичного палочкового пути была также показана на фликкер-ERG-ответах человека (Bijveld et al., 2011; Park et al., 2015).Кроме того, вторичный палочковый путь питается субнабором ганглиозных клеток сетчатки и обеспечивает повышенную светочувствительность в мезопических условиях (Völgyi et al., 2004).

Одним из заметных различий в форме волны ERG, вызванной WT и Cx36KO, является значительное снижение OP у мышей KO (Рисунки 6A, B). OP представляют собой высокочастотные колебания, движущиеся на b-волне ERG, которые опосредуются тормозными цепями во внутренней сетчатке (Wachtmeister and Dowling, 1978; Wachtmeister, 1998, 2001). Интересно отметить, что у мышей Cx36KO также отсутствуют высокочастотные колебания (гамма-волны) в головном мозге (Hormuzdi et al., 2001). С другой стороны, для ERG-ответов, вызванных от мышей WT, доля OP в форме волны существенно не изменяется во время световой адаптации (рис. 6). Есть несколько возможностей объяснить эти наблюдаемые результаты. Вызванное световой адаптацией снижение связи щелевых соединений может не совпадать с полным удалением электрических связей между нейронами, как у мышей KO. Кроме того, мыши KO врожденно лишены связи по щелевому соединению, что может изменять развитие нейронной цепи и модифицировать путь, который генерирует OP для flash ERG.

В этом исследовании мы представили новый подход к неинвазивному измерению динамики щелевого соединения стержень-конус в интактных глазах. Наше исследование предоставляет дополнительные доказательства, подтверждающие, что изменения фотопической ЭРГ, наблюдаемые во время световой адаптации, в значительной степени опосредуются модуляцией связи стержень-конус. Величина увеличения фотопической амплитуды ЭРГ во время световой адаптации может быть использована в качестве клинического показателя для неинвазивного изучения динамики соединения щелевого соединения стержень-колбочка в интактных глазах.

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Комитетом по уходу и использованию животных Национального института глаз (NEI).

Авторские взносы

YL задумал исследование, провел эксперименты, проанализировал данные и подготовил рукопись для интеллектуального содержания. ЭК оказал помощь в разработке и завершении эксперимента, проанализировал данные и подготовил рукопись для интеллектуального содержания.Штаб-квартира задумала исследование, оказала помощь в разработке и завершении эксперимента, проанализировала данные и подготовила рукопись для интеллектуального содержания.

Финансирование

Эта работа была поддержана программой очных исследований в Национальном глазном институте (EY000503 и EY000530).

Заявление об ограничении ответственности

Упоминание коммерческих продуктов, их источников или их использования в связи с материалами, приведенными в данном документе, не должно толковаться как фактическое или подразумеваемое одобрение таких продуктов Министерством здравоохранения и социальных служб.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Hua Tian из Национального института неврологических расстройств и инсульта / NIH предоставил мышей Cx36KO, используемых в этом исследовании.

Список литературы

Абд-Эль-Барр, М. М., Пеннеси, М. Э., Сашик, С. М., Барроу, А. Дж., Лем, Дж., Брамблетт, Д.E., et al. (2009). Генетическое рассечение палочковидных и колбочек в сетчатке адаптированных к темноте мышей. J. Neurophysiol. 102, 1945–1955. DOI: 10.1152 / jn.00142.2009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Александр, К. Р., Рагурам, А., Раджагопалан, А. С. (2006). Конусная фототрансдукция и рост b-волны ERG при световой адаптации. Vision Res. 46, 3941–3948. DOI: 10.1016 / j.visres.2006.04.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эпплбери, М.Л., Антох, М. П., Бакстер, Л. К., Чун, Л. Л., Фальк, Дж. Д., Фархангфар, Ф. и др. (2000). Фоторецептор колбочек мыши: один тип колбочек экспрессирует как S-, так и M-опсины с пространственным паттерном сетчатки. Нейрон 27, 513–523. DOI: 10.1016 / S0896-6273 (00) 00062-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Астерити, С., Гаргини, К., и Кангиано, Л. (2017). Экспрессия коннексина 36 необходима для электрического соединения палочек и колбочек мыши. Vis. Neurosci. 34: E006. DOI: 10.1017 / S0952523817000037

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бийвельд, М. М., Капперс, А. М., Римслаг, Ф. К., Хёбен, Ф. П., Фрайлинг, А. К., и ван Гендерен, М. М. (2011). Расширенный протокол ERG с частотой 15 Гц (1): вклад первичных и вторичных стержневых путей и колбочек. Док. Офтальмол. 123, 149–159. DOI: 10.1007 / s10633-011-9292-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Блумфилд, С.A., и Völgyi, B. (2009). Разнообразные функциональные роли и регуляция нейрональных щелевых контактов в сетчатке. Nat. Rev. Neurosci. 10, 495–506. DOI: 10.1038 / nrn2636

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bolte, P., Herrling, R., Dorgau, B., Schultz, K., Feigenspan, A., Weiler, R., et al. (2016). Экспрессия и локализация коннексинов во внешней сетчатке мыши. J. Mol. Neurosci. 58, 178–192. DOI: 10.1007 / s12031-015-0654-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Буй, Б.В. и Форчун Б. (2006). Причина роста амплитуды электроретинограмм при световой адаптации у пигментированных крыс. Vis. Neurosci. 23, 155–167. DOI: 10.1017 / s0952523806232024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Буш Р. А., Сивинг П. А. (1994). Проксимальный компонент сетчатки в a-волне фотопической ERG приматов. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 35, 635–645.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Буш, Р.А., Таникава А., Цзэн Ю., Сивинг П. А. (2019). Конусная ERG изменяется во время световой адаптации у двух мутантных мышей: последствия для взаимодействий пути палочка-колбочка. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 60, 3680–3688. DOI: 10.1167 / iovs.19-27242

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кэмерон, М. А., и Лукас, Р. Дж. (2009). Влияние фотоответа палочки на световую адаптацию и циркадную ритмичность в ЭРГ колбочек. Mol. Vis. 15, 2209–2216.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Чанг Б., Хоуз Н. Л., Херд Р. Э., Дэвиссон М. Т., Нусиновиц С. и Хекенливли Дж. Р. (2002). Мутанты по дегенерации сетчатки у мышей. Vision Res. 42, 517–525. DOI: 10.1016 / s0042-6989 (01) 00146-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Динс, М. Р., Гибсон, Дж. Р., Селлитто, К., Коннорс, Б. У. и Пол, Д. Л. (2001). Синхронная активность тормозных сетей в неокортексе требует электрических синапсов, содержащих коннексин 36. Нейрон 31, 477–485. DOI: 10.1016 / s0896-6273 (01) 00373-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Динс, М. Р., Волги, Б., Гуденаф, Д. А., Блумфилд, С. А., и Пол, Д. Л. (2002). Коннексин 36 необходим для передачи опосредованных стержнями зрительных сигналов в сетчатке млекопитающих. Нейрон 36, 703–712. DOI: 10.1016 / s0896-6273 (02) 01046-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Экестен, Б., Gouras, P., and Moschos, M. (1999). Конические свойства адаптированной к свету мышиной ERG. Док. Офтальмол. 97, 23–31. DOI: 10.1023 / A: 10018639

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фришман, Л. Дж. (2006). «Истоки электроретинограммы», в книге Принципы и практика клинической электрофизиологии зрения , ред. Дж. Р. Хекенливли и Дж. Б. Арден (Кембридж, Массачусетс: MIT Press), 139–183.

Гоурас П. и Маккей К. Дж. (1989). Рост амплитуды электроретинограммы колбочек человека при световой адаптации. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 30, 625–630.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Güldenagel, M., Ammermuller, J., Feigenspan, A., Teubner, B., Degen, J., Sohl, G., et al. (2001). Дефицит зрительной передачи у мышей с направленным разрушением гена щелевого соединения коннексина 36. J. Neurosci. 21, 6036–6044. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.21-16-06036.2001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хартвейт, Э., Веруки, М.Л. (2012). Электрические синапсы между амакриновыми клетками AII в сетчатке: функция и модуляция. Brain Res. 1487, 160–172. DOI: 10.1016 / j.brainres.2012.05.060

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Haverkamp, ​​S., Wassle, H., Duebel, J., Kuner, T., Augustine, G.J., Feng, G., et al. (2005). Изначальная цветовая система сетчатки глаза мышей — синий конус. J. Neurosci. 25, 5438–5445. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.1117-05.2005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Heckenlively, J.Р., и Арден, Г. Б. (2006). Принципы и практика клинической электрофизиологии зрения. Кембридж, Массачусетс: MIT Press.

Google Scholar

Хейккинен, Х., Винберг, Ф., Нимарк, С., и Коскелайнен, А. (2011). Мезопический фоновый свет усиливает адаптированные к темноте колбочки ERG-вспышки в интактной сетчатке мышей: возможная роль в разделении щелевого соединения. J. Neurophysiol. 105, 2309–2318. DOI: 10.1152 / jn.00536.2010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ормузди, С.Г., Пайс, И., ЛеБо, Ф. Э., Тауэрс, С. К., Розов, А., Буль, Э. Х. и др. (2001). Нарушение передачи электрических сигналов нарушает колебания гамма-частоты у мышей с дефицитом коннексина 36. Нейрон 31, 487–495. DOI: 10.1016 / s0896-6273 (01) 00387-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джексон, К. Р., Руан, Г. Х., Асим, Ф., Абей, Дж., Гэмбл, К., Стэнвуд, Г. и др. (2012). Дофамин сетчатки опосредует различные аспекты адаптированного к свету зрения. Дж.Neurosci. 32, 9359–9368. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.0711-12.2012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джин, Н. Г., и Рибелайга, К. П. (2016). Прямое доказательство ежедневной пластичности электрической связи между палочковыми фоторецепторами в сетчатке млекопитающих. J. Neurosci. 36, 178–184. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.3301-15.2016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Х., Чжан, З., Блэкберн, М. Р., Ван, С. В., Рибелайга, К. П., и О’Брайен, Дж. (2013). Аденозиновые и дофаминовые рецепторы совместно регулируют связывание фоторецепторов через фосфорилирование щелевых соединений в сетчатке мышей. J. Neurosci. 33, 3135–3150. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.2807-12.2013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли Ю., Чжан Ю., Чен С., Вернон Г., Вонг В. Т. и Цянь Х. (2018). Светозависимые изменения структуры ОКТ в фоторецепторной дегенеративной сетчатке мышей rd 10. Инвест. Офтальмол. Vis. Sci. 59, 1084–1094. DOI: 10.1167 / iovs.17-23011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Любарский А. Л., Фальсини Б., Пеннеси М. Э., Валентини П. и Пью Э. Н. мл. (1999). Ультрафиолетовые и чувствительные к средним волнам ответы сетчатки колбочек мыши: возможный фенотип для совместной экспрессии фотопигментов колбочек. J. Neurosci. 19, 442–455. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.19-01-00442.1999

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нельсон Р.(1977). У кошачьих колбочек есть стержневой ввод: сравнение характеристик реакции колбочек и горизонтальных клеточных тел в сетчатке кошки. J. Comp. Neurol. 172, 109–135. DOI: 10.1002 / cne.0106

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Никонов С. С., Даниэле Л. Л., Чжу X., Крафт К. М., Сваруп А. и Пью Э. Н. мл. (2005). Фоторецепторы Nrl — / — мышей коэкспрессируют функциональные опсины S- и M-конусов, имеющие различные механизмы инактивации. J. Gen. Physiol. 125, 287–304. DOI: 10.1085 / jgp.200409208

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

О’Брайен, Дж., И Блумфилд, С.А. (2018). Пластичность щелевых контактов сетчатки: роль в синаптической физиологии и болезни. Annu. Преподобный Vis. Sci. 4, 79–100. DOI: 10.1146 / annurev-vision-0-034133

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Парк, Дж. К., Цао, Д., Коллисон, Ф. Т., Фишман, Г.А., Макэнани, Дж. Дж. (2015). Вклады стержня и диффузора в адаптированную к темноте фликкер-электроретинограмму с частотой 15 Гц. Док. Офтальмол. 130, 111–119. DOI: 10.1007 / s10633-015-9480-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пичи, Н. С., Александр, К. Р., Дерлацки, Д. Дж., И Фишман, Г. А. (1992a). Световая адаптация, стержни и человеческий конус мерцания Erg. Vis. Neurosci. 8, 145–150. DOI: 10.1017 / s0952523800009305

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar