Как избавиться от неприятного запаха в обуви: полезные рекомендации
Покупая новенькую пару обуви, нам всем хочется, чтобы она подольше оставалась нарядной. Но иногда уже после нескольких дней носки, мы замечаем, что наша обувь начала издавать неприятный запах. Что же делать, если вдруг появился неприятный запах из обуви? Давайте подойдем к проблеме с нескольких сторон.
Народные средства.
- Протирайте обувь изнутри ватой, смоченной или в уксусе, или в перекиси водорода. Это быстрый и эффективный способ. Но не переусердствуйте, если нальете на диск слишком много жидкости, потом придется обувь сушить.
- Если нет аллергии на масла, то можете капнуть на стельку несколько капель масла лаванды или лимонного сока. И лаванда, и лимонный сок уничтожают микробов, вызывающих запах, ну и к тому же у них очень приятный аромат.
- Чайные пакетики. Этот способ распространен в армии, когда нет другой возможности избежать проблемы запаха пота. Чайные пакетики просто кладете на ночь и утром их удаляете. Чай обладает удивительным свойством впитывать в себя, как губка, любой запах (именно поэтому чай раньше перевозили только на специальных торговых судах, чтобы чай не стал пахнуть еще чем-то, кроме чая).
- Сода, детская присыпка, активированный уголь. Все перечисленные средства удивительно гигроскопичны (способны впитывать в себя влагу, которая является благотворной средой для размножения бактерий, вызывающих запах). Что нужно сделать? Просто высыпаете в ботинок на ночь одно из средств (уголь, конечно, надо измельчить), а утром или вытряхиваете в ведро, или быстро пылесосите ботинок. Если не хотите возиться с пылесосом, то воспользуйтесь следующим советом: положите толченый уголь в новый холщовый пакет.
- Заморозить обувь. Если на дворе морозная зима, то обувь можно просто на ночь вынести на балкон. Если же зима теплая и дождливая (или вообще на дворе лето), то на ночь убираем обувь в холодильник. В условиях холода бактерии, вызывающие запах пота погибают. Только не забудьте и в первом и во втором случае прежде чем морозить обувь, вытащите из нее стельки.
- Высушить феном или хорошо просушить на батарее. Вариант противоположный предыдущему. Но и в этом случае сначала нужно убрать стельки из ботинок или туфель.
- Листья мяты, шалфея, измельченная кора дуба тоже помогут вам быстро справиться с неприятным запахом. Достаточно положить их на ночь внутрь обуви. Если нет свежих листьев, то вполне подойдут и высушенные. Просто положите их в холщовый или льняной мешочек.
- Если ваша обувь долгое время оставалась в сыром помещении, то появляется неприятный запах плесени. От него избавиться несколько сложнее, но тоже возможно. Первое, что нужно сделать, это хорошо промыть обувь изнутри и снаружи мыльным раствором. Далее нужно протереть обувь хлорным раствором (это поможет её продезинфицировать). Для следующего этапа возьмите в равных долях нашатырный спирт и водку (нет водки: ее легко можно заменить разведенной уксусной эссенцией). Этим раствором тщательно протираете обувь изнутри и снаружи и затем ставите в хорошо проветриваемое место на просушку.
- Стиральная машина. Это, конечно, не совсем «народный метод», скорее «современный», но тоже достаточно распространенный. Если вашу обувь можно постирать, то сделайте это не вручную, а в стиральной машине, использовав для этого нужный режим стирки.
Современные средства.
- Спреи-дезодоранты. Их большое количество. Достаточно эффективное средство, которое действует на причину запаха на молекулярном уровне. Стоимость дезодорантов зависит от их объема.
- Хлоргексидин (лучше взять 0,05% раствор). Обувь нужно протереть со всех сторон, включая стельки. После обработки помещаете свои туфли или ботинки в полиэтиленовый пакет, часа на четыре. Потом обувь нужно в течение двух дней просушить.
- «Формидрон». Это раствор на основе формальдегида и его можно купить в аптеке. Обладает антисептическим и дезинфицирующим средством. Перелейте в пульверизатор и распылите изнутри. Но будьте осторожны: раствор достаточно токсичен.
- Фрешеры и стикеры с антибактериальными свойствами лучше всего подойдут для спортивной обуви. Они быстро избавят ваши кроссовки от запаха пота.
- Стельки. Основной вопрос, который встанет перед вами: какие именно стельки выбрать. Есть одноразовые, есть с активированным углем, противогрибковые, стельки из натурального льняного нетканого материала. Удобство стелек в том, что дезодорант вы можете и забыть распылить, ну а без стелек точно никуда не пойдете.
Ну и в заключении хотелось сказать следующее: всегда лучше предотвратить, чем исправлять. Проблема не в обуви, а в наших ногах. Следите за их чистотой.
Если материальные средства позволяют, то лучше купить вторую пару обуви, чтобы вы могли более тщательно просушить свои ботинки, туфли, кроссовки. Тогда обувь будет дольше оставаться чистой и свежей.
Как можно навсегда избавиться от запаха пота под мышками в домашних условиях?
Пятна пота в области подмышечных впадин способны разрушить репутацию самого успешного человека. Они доставляют массу неудобств от неприглядного внешнего вида и резкого запаха, до порчи одежды выцветшими пятнами материи.
Заботливыми хозяйками и экспертами в области гигиены разработано немало способов избавления от выделений сальных желез в области подмышек. Широкий спектр средств включает составы промышленного производства: тальк, аэрозоль или стик против пота, таблетки и инъекции, даже специальные подкладки на одежду. Любителями народных средств собраны рецепты специальных отваров и настоев, снижающих уровень потливости.
Причины
Сталкиваясь с проблемой повышенного потоотделения, большинство людей начинают пристальное внимание уделять гигиене тела. Вместе с тем, частое использование моющих средств сушит кожу и приводит к ее раннему старению. Если по внешним параметрам и самочувствию человека выделение пота и специфический запах этого процесса действительно отличаются от нормы, то следует искать причину такой реакции организма и работать над ее устранением.
Причинами повышенного потоотделения могут быть разные факторы:
Повышение уровня тестостерона: в определенные периоды жизни человека (половое созревание, климакс) происходит гормональная перестройка его биологических процессов.
Переживание стрессовых ситуаций: волнение человека перед важными переговорами или знакомством способствует повышению адреналина в крови, выделению испарины.
Избыточный вес: полнота приводит к нарушениям процессов метаболизма, терморегуляции, при которых становится более интенсивным потоотделение.
Болезни внутренних органов: нарушения в правильном функционировании даже одной из систем организма приводит к гипергидрозу и изменениям запаха пота (при проблемах с печенью секрет пахнет ацетоном, при дифтерии появляется сладковатый запах, при нарушении пищеварения пот приобретает запах сероводорода).
Отсутствие сбалансированного питания: чрезмерное увлечение острой, жирной, жареной пищей, крепким кофе, чаем, блюдами фастфуда, спиртными напитками провоцирует повышенное потоотделение и изменение состава секреции сальных желез.
Физические нагрузки: повышенная двигательная активность вызывает повышение температуры тела, в ответ на которое для терморегуляции организм реагирует выделением пота.
Несоблюдение гигиенических норм: необходимости удаления волос в подмышечной впадине, регулярности водных процедур.
Нарушение правил гигиены чрезмерным увлечением моющими средствами: частое использование антибактериального мыла вызывает вымывание собственной микрофлоры организма, снижая защитные функции биологической среды, что приводит к развитию болезнетворных бактерий и неприятному запаху.
Одежда из синтетических материалов: непродуваемая искусственная ткань мешает вентиляции и доступу воздуха к коже человека, создавая «парниковый эффект», тем самым провоцируя выделение пота.
Способы избавления от пота
Навсегда избавиться от запаха пота под мышками поможет ответственное отношение к перечисленным выше факторам, вызывающим повышенное потоотделение. Если причина так и не найдена, то следует принять меры, рекомендуемые специалистами:
дважды в день принимать душ, утренний без моющих средств, вечерний с увлажняющим мылом;
в период предстоящих стрессовых ситуаций заниматься самоубеждением, пить чай с ромашкой, мелиссой, мятой, в сложных ситуациях принимать успокоительные аптечные средства на травах;
провести полную диагностику организма на предмет выявления заболеваний внутренних органов;
перейти на правильное питание или хотя бы снизить употребление жирной, жареной, острой пищи;
включить в рацион продукты, содержащие фосфор, железо и кальций;
употребление чая, кофе заменить травяными настоями;
нормализовать физические нагрузки на организм;
внимательно изучить инструкции к лекарственным препаратам, которые используются в настоящее время, возможно они оказывают побочный эффект, вызывая повышенное выделение секреции потовых желез;
Если предлагаемые меры не помогли снизить потоотделение, запах по-прежнему остается ярко выраженным, то рекомендовано периодически применять специальные средства в области подмышечных впадин. Предлагаемые специалистами составы могут быть в разной форме: косметические средства, аптечные лекарственные препараты, народные рецепты на основе отваров и настоек.
Косметические средства
Быстрым решением вопроса является использование косметических средств, которые своим составом помогают избавиться от резкого запаха пота.
Приспособления такого вида могут быть следующих типов:
дезодоранты — призваны остановить размножение бактерий, создавая неблагоприятную для них среду обитания, устранять неприятные запахи;
антиперспиранты — способны блокировать активность потовых желез благодаря наличию в своем составе солей металлов;
дезодоранты-антиперспиранты — совмещает преимущества первых двух, предназначен для людей с активным образом жизни.
Для людей с раздражительной кожей и подростков из представленных типов рекомендовано пользоваться дезодорантами. Состав этих приспособлений содержит минимальное количество агрессивных компонентов, ароматизирующих веществ, парфюмерных отдушек. Взрослым людям с явными проблемами повышенного потоотделения при интенсивных тренировках и физических нагрузках рекомендовано применять дезодорант-антиперспирант.
Аптечные препараты
Если процесс гипергидроза ярко выражен и причиняет неудобства, то следует применять лекарственные препараты. Составы этих средств помогают навсегда убрать повышенное выделение пота на ладонях, под мышками, на ногах. К таким кардинальным мерам приступают только в том случае, если предварительно выполнены рекомендации специалистов, изложенные ранее.
Лекарственные препараты для уменьшения потоотделения:
Паста Лассара для ежедневного применения на основе цинка нормализует работу потовых желез. Применяется не меньше месяца.
Салицилово-цинковая мазь с оксидом цинка подобна пасте, подсушивает кожу, блокирует тем самым активность потовых желез. Ацетилсалициловая кислота в составе препарата способствует истреблению бактерий, продукты жизнедеятельности которых создают неприятный запах.
Гальманин в форме присыпки в составе содержит цинк и салициловую кислоту для достижения антибактериального эффекта.
Формидон — недорогой раствор применяют в крайних случаях при отсутствии эффекта от других средств снижения потоотделения. Такая осторожность в назначениях препарата связана с наличием в его составе формальдегида, который негативно влияет на работу репродуктивных органов и ЦНС.
Паста Теймурова содержит в высокой концентрации окись цинка. Действует непродолжительное время — до трех дней. Для пациентов с проблемной или чувствительной кожей препарат противопоказан, как и людям с ослабленным здоровьем, отягощенным хроническими заболеваниями, беременным женщинам.
Кроме перечисленных средств промышленного производства, оказываются не менее эффективными прокладки на одежду, гипоаллергенный состав которых способен нормализовать работу потовых желез. Применять их можно для одежды из любых материалов, что обеспечит ей сохранность и отсутствие белых потовых разводов. Для удобства пользователей таких приспособлений производителями продуманы разные размеры и формы прокладок.
Народные рецепты
Если видимых причин для повышенного потоотделения при первом анализе найдено не было, медицинских причин для этого тоже нет, то рекомендуют применять аптечные препараты или народные средства. Первые имеют много ограничений и побочные эффекты, противопоказаны для организма, отягощенного хроническими заболеваниями, для людей с раздражительной, нежной кожей.
Народные средства имеют более щадящее действие и, несмотря на необходимость длительного использования, гарантировано обеспечивают желаемый результат.
К последним относятся:
поваренная соль, пищевая сода;
аптечные травы: кора дуба, цветки ромашки;
натуральный сок лимона, картофеля.
Соль и сода
Некоторые привычные в бытовой сфере порошки, чистящие средства оказывают благоприятное воздействие на поры кожи подмышечных впадин. Преимущества рекомендуемого метода борьбы с повышенным потоотделением состоит в щадящем воздействии и безопасности. Единственным недостатком является необходимость длительного применения для достижения желаемого результата.
Две столовые ложки соли добавляют в стакан теплой воды и тщательно размешивают. Марлю или иную хлопковую материю смачивают в полученном растворе. Смазывают перед интенсивными физическими нагрузками, перед сном прикладывают на некоторое время, не менее четверти часа.
Применяя пищевую соду, чайную ложку порошка растворяют в стакане кипятка. Дожидаются, когда раствор остынет, добавляют три капли эфирного масла чайного дерева. Полученным составом протирают чистую кожу три раза, равномерно распределяя процедуры в течение суток.
Отвары трав
Рекомендуемые травы можно легко приобрести в аптеке без предъявления рецепта, щадящее их действие позволяет решить вопрос потоотделения даже у ребенка. При регулярном применении рекомендованных отваров можно гарантированно устранить обильное потоотделение через месяц. К наиболее действенным травам относят кору дуба и цветки ромашки.
Пять столовых ложек коры дуба заливают двумя стаканами воды и нагревают. Когда состав закипит, снимают емкость с огня и настаивают под закрытой крышкой в течение некоторого времени, но не менее двух часов. Спустя указанное время жидкость процеживают и полученным составом протирают проблемные зоны несколько раз в день.
Три чайные ложки цветков аптечной ромашки заливают половиной литра кипятка. Настаивают до тех пор, пока жидкость не остынет до комнатной температуры. Жидкость процеживают и добавляют в полученный отвар чайную ложку пищевой соды. Полученным составом обрабатывают подмышечные впадины дважды в сутки: утром и вечером.
Соки продуктов
Избавиться от сильного пота под мышками в домашних условиях можно при помощи рецептов из доступных на кухне продуктов. К ним относят: натуральный выжатый сок лимона, картофеля, яблока, редьки. Аналогичным эффектом обладает протирание проблемных зон с помощью разведенного яблочного уксуса.
Свежевыжатый сок лимона для чувствительной кожи разводят наполовину водой и обрабатывают проблемные зоны подмышечных впадин. Рецепт имеет ряд преимуществ: сужает поры, очищает их и ароматизирует кожу.
Сок редьки и глицерин берут в равных долях, тщательно размешивают. Полученный состав втирают в зону подмышечных впадин.
[adinserter block=»4″]
Как вывести пятна от пота и дезодоранта: 12 дешёвых и действенных средств
Белые следы появляются при соприкосновении ещё не высохшего дезодоранта с одеждой. Они напоминают восковое покрытие.
А вот когда содержащиеся в дезодорантах и антиперспирантах соли алюминия смешиваются с потом, на светлой ткани появляются жёлтые пятна. Химикаты стирального порошка лишь способствуют этой реакции.
От подобных загрязнений лучше избавляться немедленно, а не после нескольких стирок.
Помните: вещь нельзя стирать в горячей воде. От этого пятна только закрепятся. Кроме того, все способы лучше сначала опробовать на незаметном участке одежды.
1. Капрон
В женском гардеробе точно найдётся это чудо-средство.
- Что выводит: белые пятна от дезодоранта.
- Для каких тканей подходит: для тёмных.
- Что нужно: капроновый носок.
Просто энергично потрите носком белое пятно, и оно сойдёт на нет.
Как продлить жизнь капроновым колготкам →
2. Лимонный сок
Сок лимона способен вывести только свежие пятна. Для застарелых этот способ не подойдёт.
- Что выводит: белые следы от дезодоранта и жёлтые пятна от пота.
- Для каких тканей подходит: для светлых. Можно использовать для тёмных или разноцветных, если вы уверены, что они окрашены стойкой краской.
- Что нужно: 1 лимон.
Выдавите на каждое пятно сок ½ лимона. Пятна должны быть полностью покрыты соком.
Оставьте на 2–10 минут в зависимости от степени загрязнения. Затем прополощите одежду в прохладной воде.
30 необычных способов использования лимона →
3. Средство для мытья посуды
В составе средства должен быть глицерин. Именно он борется с пятнами.
- Что выводит: белые следы от дезодоранта и жёлтые пятна от пота.
- Для каких тканей подходит: для светлых (прозрачное средство для мытья посуды), тёмных и разноцветных (любое средство для мытья посуды).
- Что нужно: густое средство для мытья посуды + губка.
Толстым слоем нанесите средство на пятна и вотрите влажной губкой. Оставьте на 30–60 минут и постирайте вещь вручную.
6 вещей, которые не стоит чистить средством для мытья посуды →
4. Аспирин
Ацетилсалициловая кислота тоже хорошо справляется с загрязнениями.
- Что выводит: запах и жёлтые пятна от пота.
- Для каких тканей подходит: для светлых, тёмных и разноцветных.
- Что нужно: 2 таблетки аспирина + ½ стакана прохладной воды + зубная щётка.
Измельчите аспирин и растворите его в воде. Смочите получившимся раствором пятна, потрите щёткой и оставьте на 2–3 часа.
Прополощите и постирайте вещь вручную или в стиральной машине. Если пятна старые, во время полоскания можно намылить их хозяйственным мылом или мылом-пятновыводителем и тщательно потереть.
Волшебная таблетка: 11 необычных способов использования аспирина →
5. Уксус
Уксус разъедает въевшиеся вещества дезодоранта и пота. Это средство нельзя наносить на белые вещи, иначе на них останутся жёлтые разводы.
- Что выводит: белые следы от дезодоранта, жёлтые пятна и запах пота.
- Для каких тканей подходит: для тёмных и цветных.
- Что нужно: ватный диск + уксус 9%.
Смочите ватный диск уксусом и протрите загрязнённые участки. Очень важно, чтобы ткань хорошо пропиталась кислотой.
Оставьте на несколько часов, а если пятна старые, то на всю ночь. Затем постирайте в стиральной машине.
13 неочевидных способов использовать яблочный уксус в хозяйстве →
6. Хозяйственное мыло
Мыло хорошо справляется со свежими загрязнениями.
- Что выводит: белые пятна от дезодоранта.
- Для каких тканей подходит: для светлых, тёмных и разноцветных.
- Что нужно: хозяйственное мыло + тёрка.
Натрите кусок мыла на крупной тёрке и растворите получившуюся стружку в тазике с тёплой водой. Потрите пятна мылом, замочите вещь в тазике на пару часов и постирайте.
Как ухаживать за одеждой, чтобы она прослужила дольше →
7. Сода
Пищевая сода — это натуральный дезодорирующий очиститель.
- Что выводит: запах и жёлтые пятна от пота.
- Для каких тканей подходит: для светлых.
- Что нужно: ½ стакана прохладной воды + 4 столовые ложки соды + зубная щётка.
Разведите соду в воде, чтобы получилась густая паста. При необходимости добавьте ещё соды. Вотрите пасту в пятна и оставьте на несколько часов до высыхания.
Затем хорошо потрите пятна зубной щёткой, чтобы счистить соду, и прополощите вещь в прохладной воде.
5 кулинарных лайфхаков с содой →
8. Аммиак
Это очень мощное средство, справляющееся даже с застарелыми пятнами. Но использовать его можно только при крайней необходимости. Длительное воздействие аммиака на ткань может её деформировать.
И не забудьте надеть перчатки.
- Что выводит: запах и жёлтые пятна от пота.
- Для каких тканей подходит: для светлых, тёмных и разноцветных тканей.
- Что нужно: аммиак + чуть тёплая вода + губка.
Смешайте аммиак и воду в пропорции 1 : 1. Смочите в растворе губку и потрите пятна. Оставьте на пару минут, прополощите и постирайте вручную или в стиральной машине.
Как удалить пятна с одежды →
9. Водка
Водку можно заменить медицинским спиртом, разведённым с водой в соотношении 1 : 1.
- Что выводит: белые пятна от дезодоранта.
- Для каких тканей подходит: для тёмных и разноцветных.
- Что нужно: ватный диск + водка.
Обильно смочите ватный диск водкой и протрите пятна. Результат будет заметен уже через 2–5 минут. Если нет, оставьте вещь пропитываться водкой ещё на 30–60 минут.
После этого вещь следует прополоскать и постирать в стиральной машине.
Как можно использовать дешёвую водку в быту →
10. Соль
Эффективное средство, которое найдётся на кухне у каждого. Но наносить соль можно только на грубые ткани.
- Что выводит: запах и жёлтые пятна от пота.
- Для каких тканей подходит: для светлых, тёмных и разноцветных.
- Что нужно: 1–2 чайные ложки соли + зубная щётка.
Вотрите соль в пятна от дезодоранта и оставьте на 10–12 часов. Затем почистите эти места щёткой и постирайте одежду в стиральной машине.
Как выбрать стиральную машину и не прогадать →
11. Соль + хозяйственное мыло
Более щадящий метод для деликатных тканей.
- Что выводит: запах и жёлтые пятна от пота.
- Для каких тканей подходит: для светлых, тёмных и разноцветных.
- Что нужно: хозяйственное мыло + вода + 1 чайная ложка соли + губка.
Растворите хозяйственное мыло в тёплой воде и замочите в ней вещь на 10 минут. Разведите соль в 1 стакане прохладной воды, смочите раствором губку и хорошо протрите загрязнённые участки.
Через 15 минут постирайте вещь вручную или в стиральной машине.
20 способов применения поваренной соли в быту →
12. Перекись водорода
Перекись водорода можно просто нанести на пятно, оставить на пару часов и прополоскать. Но есть ещё более эффективный метод.
- Что выводит: запах и жёлтые пятна от пота.
- Для каких тканей подходит: для светлых.
- Что нужно: 2 столовые ложки соды + 1 чайная ложка средства для мытья посуды + перекись водорода.
Смешайте соду и средство для мытья посуды. Нанесите смесь на пятно, обильно полейте перекисью водорода и оставьте на 1,5–2 часа.
Затем тщательно прополощите вещь и постирайте вручную или в стиральной машине.
Читайте также
Как Избавиться от Неприятного Запаха Кожаных Изделий
Натуральная кожа — довольно дорогой и практичный материал, который отличается долговечностью, роскошным видом, способностью «дышать», удобством в использовании. Однако он также обладает одним весомым недостатком — способностью впитывать неприятные запахи, в том числе табака или пота. Также особый аромат имеют новые натуральные изделия, которому они обязаны дубильным веществам, использующимся в процессе обработки материала. Давайте узнаем, как избавиться от неприятного запаха кожаных изделий в домашних условиях.
Самые распространенные способы устранения запаха натуральной кожиСуществует несколько способов устранения специфичного аромата кожаных изделий. В их числе следующие варианты:
- Выветривание. Продержав кожаную вещь на балконе в течение пары недель, неприятный запах новой кожи улетучится. Такой способ подойдет для обуви, курток, сумок и другой одежды.
- Использование старых газет. Этот способ станет превосходным решением для предметов, имеющих внутреннее пространство: сюда можно отнести обувь или сумки. Нужно набить кожаное изделие старыми газетами изнутри, ими же обернуть, а затем положить в наполненную ими коробку примерно на 2 суток. После этого запах кожаных изделий должен остаться на газетах.
- Кофе или сода. Метод подойдет для любых предметов из темной кожи. Достаточно осыпать кожаную вещь подобными веществами, а спустя время отряхнуть и проветрить. Но не стоит использовать кофе для светлых кожаных изделий, так как он может окрасить материал.
- Нашатырный спирт или уксус. Этот метод рекомендуется применять, если не помогли вышеуказанные способы. Наберите стакан воды, добавьте туда две столовые ложки уксуса или столовую ложку мыла и нашатырного спирта. Перед обработкой изделия протестируйте полученное средство на невидимом участке.
Новые предметы мебели из натуральной кожи поначалу также могут издавать неприятный запах, из-за чего находиться в помещении не совсем уютно. Вот несколько способов, которые помогут решить проблему:
- Проветривайте помещение, где находится новая кожаная мебель, как можно чаще.
- Уберите на время из комнаты предметы, впитывающие запах, в числе которых могут оказаться ковры или шторы.
- Осыпьте поверхность дивана или кресла содой, после чего стряхните вещество и пропылесосьте мебель.
- Положите на изделие, от которого исходит запах новой кожи, мешочки с мятой или лавандой (подойдут и пакетики с фруктовым чаем). Также можно разложить на мебели газеты и насыпать сверху натуральный молотый кофе, что даст возможность избавиться от аромата дивана или кресла.
Специалисты рекомендуют применять все вышеперечисленные методы в комплексе. Это позволит быстрее добиться желаемого результата.
Как избавиться от неприятного запаха кожаной курткиСпецифичный запах характерен для новых кожаных курток, который проходит спустя определенное время их использования. Но если устранить аромат хочется как можно скорее, можно воспользоваться следующими способами:
- Протереть всю поверхность куртки внутренней стороной цедры цитрусовых.
- Обработать поверхность изделия мыльным раствором с небольшим количеством нашатырного спирта.
- Повесить куртку над горячей ванной, в которой предварительно смешали воду со стаканом уксусной эссенции. После нескольких часов изделие нужно просушить на свежем воздухе, избегая прямых солнечных лучей.
В конце каждой из процедур можно обработать куртку глицерином, что размягчит кожу и придать ей привлекательный вид.
Как избавиться от неприятного запаха кожаной обувиНеприятный запах с новой кожаной обуви выводится достаточно сложно. Отличным выходом из ситуации станет методы выветривания или обертывание туфель старыми газетами. В случае неприятного запаха ношеной кожаной обуви, устранить проблему помогут лишь специальные дезодоранты. Подобные вещества помогают избавиться от запаха пота и бактерий, придают туфлям и ботинкам приятный аромат.
Как избавиться от неприятного запаха кожаных сумок и других аксессуаровКожаные сумки обычно имеют специфичный аромат, когда они новые. Для его устранения достаточно обработать внешнюю поверхность аксессуара мыльным раствором нашатырного спирта. Темные изделия можно также обработать слабым раствором марганцовки, в то время как для светлых вещей этот способ не подойдет. Для устранения запаха с кожаных сумок и кошельков также могут быть использованы все методы, которые подходят для обуви и курток.
Что касается ремешка часов и кожаных браслетов, то неприятный запах от них исходит на протяжении всего периода использования. Поверхность изделий соприкасается с кожей руки, которая под ними потеет и, как результат, образуются бактерии. Решить проблему можно, побрызгав антиперспирантом, препятствующим появлению бактерий, на кожаное изделие.
Вот и все! Теперь вы знаете обо всех возможных способах устранения неприятного запаха с большинства кожаных изделий. Смотрите также все доступные для заказа товары по уходу за натуральной кожей на этой странице.
Как устранить неприятный запах из сумки, рюкзака и чемодана: советы от Grizzly
Нередко с наличием посторонних запахов сталкиваются владельцы рюкзаков – сказываются активный образ жизни и довольно жесткие условия эксплуатации. Чемоданы для путешествий тоже не застрахованы от неприятностей: в них может пролиться сок или какая-нибудь бытовая химия. Мишка Гризли решил дать несколько советов тем, кто не знает, как устранить неприятный запах из сумки.
О коже
Кожаные изделия категорически не рекомендуется стирать, потому что после высыхания натуральная кожа становится ломкой и сухой. Оптимальный вариант – обработка специальным мылом для кожи, причем не прямым контактом, а путем образования легкой мыльной пены, которую после обработки поверхности сумки надо хорошо вытереть сухой тканью. Чтобы окончательно нейтрализовать запах, следует протереть сумку уксусом, разведенным напополам с водой. Финальная обработка касторовым маслом или глицерином поможет вернуть сумке окончательную мягкость и приятный влажный блеск.
Иногда достаточно хорошо проветрить новую сумку: на воздухе запах казеинового клея и других средств, при помощи которых обрабатывают и красят кожу, может быстро выветриться. Главное при этом – вывернуть подкладку сумки наружу. Посторонние запахи хорошо адсорбирует ржаной хлеб; положите в сумку несколько ломтиков хлеба и оставьте там на два-три дня.
Кожзаменитель
Первый способ – все то же проветривание на открытом воздухе. После этого можно положить в сумку кусочки ваты или ватные диски, пропитанные эфирным маслом. Мишка Гризли советует использовать масло цитрусовых – апельсиновое, грейпфрутовое. Хотя можно воспользоваться и более простым вариантом, насыпав на какое-то время в сумку кожуру апельсина или лимона.
Сумку из кожзаменителя можно стирать без использования отжима, на деликатном режиме. Изделие лучше вывернуть наизнанку и поместить в специальный сетчатый мешок. При этом стоит либо использовать жидкое средство для стирки, либо вообще отказаться от порошка в пользу обычного кондиционера для белья.
Универсальное средство и для кожи, и для кожзаменителя – молотый или растворимый кофе, а также кофейные зерна. Достаточно насыпать кофе в карманы и отделения, и уже спустя недолгое время неприятный запах исчезнет, а на смену ему придет аппетитный кофейный аромат. К сожалению, этот способ не годится, если подкладка сумки светлая – кофе может окрасить ткань. И кожаную сумку, и изделие из кожзама можно протирать мыльным раствором, смешанным с нашатырным спиртом в пропорции один к одному.
Если сумкой заинтересовались домашние питомцы
Не всегда наши любимцы умеют вести себя идеально, и любимая сумка может стать объектом их повышенного внимания. Если вы столкнулись с такой ситуацией, используйте медицинский спирт или водку. Сумку нужно тщательно протереть, не пропуская ни единого сантиметра и ни одного шва. Альтернативой может стать раствор из перекиси водорода и марганцовки в равных частях. Но помните: если ваша сумка светлая, обязательно протестируйте действие раствора на незаметном участке – не исключено, что он может окрасить изделие в неприятный и неравномерный оттенок.
О рюкзаках
В рюкзаках самая «проблемная» с точки зрения запаха деталь – лямки. Устранить посторонний аромат поможет полоскание в воде с добавлением уксуса, после чего изделие сушат и обрабатывают влагозащитным спреем. Бывалые владельцы рюкзаков утверждают, что отлично справляется с запахами обыкновенная водка. Она полностью впитывается, не оставляя следов и устраняя, к примеру, запах пота, которым пропитались лямки.
Для обработки рюкзаков и чемоданов также подойдет лизол – это средство-дезинфектант, которое активно используют в боулингах и на скалодромах. Лизол в спрее хорошо справляется с неприятным запахом и не дает размножаться бактериям. Это средство быстро выветривается и не оставляет следов.
Универсально – для чемоданов
Неожиданный вариант, но… наполнитель для кошачьего туалета справится с запахом, который не сможет устранить кофе в зернах или спиртово-водный раствор. Просто насыпьте в чемодан гранулы наполнителя, закройте молнию и оставьте дней на семь-восемь. После этого останется только выбросить кошачий наполнитель и хорошенько вытряхнуть его остатки из чемодана.
Напоследок мишка Гризли напоминает: если вы не уверены в том, что хотя бы один из предложенных способов действительно поможет избавиться от неприятного запаха, или если вы пробовали все эти способы, но они не помогли, то всегда есть возможность отнести чемодан или сумку в химчистку. Современные технологии способны справиться даже с самыми сложными задачами, и ваша сумка или рюкзак будут снова радовать вас не только внешним видом и удобством, но и комфортом использования.
Понравилась статья? Поделитесь с друзьями!
31.05.2017 19603 Поделиться с друзьями:Ученые выяснили, как избавиться от запаха пота без дезодоранта
https://ria.ru/20190413/1552651581.html
Ученые выяснили, как избавиться от запаха пота без дезодоранта
Ученые выяснили, как избавиться от запаха пота без дезодоранта — РИА Новости, 13.04.2019
Ученые выяснили, как избавиться от запаха пота без дезодоранта
Раствор, содержащий в себе частицы окиси цинка, оказался намного более эффективным средством для борьбы с запахом пота, чем самые популярные дезодоранты. О… РИА Новости, 13.04.2019
2019-04-13T01:00
2019-04-13T01:00
2019-04-13T01:00
наука
дания
здоровье — общество
здоровье
бактерии
гигиена
кожа
/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content
/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content
https://cdn23.img.ria.ru/images/144204/98/1442049867_0:303:5000:3116_1920x0_80_0_0_6d0840f45cf71c244d54570021aadb03.jpg
МОСКВА,13 апр – РИА Новости. Раствор, содержащий в себе частицы окиси цинка, оказался намного более эффективным средством для борьбы с запахом пота, чем самые популярные дезодоранты. О результатах испытания этого средства ученые рассказали на конференции ECCMID 2019 в Нидерландах.Вопреки общепринятым представлениям, человеческий пот не обладает своим собственным запахом. Его неповторимый «аромат», а также запах ношенных носков и одежды, возникает благодаря жизнедеятельности микробов, которые живут на нашей коже. Некоторые из них «съедают» органику, содержащуюся в поте, и выделяют взамен различные летучие соединения.Многие современные дезодоранты убивают этих микробов в подмышках и других уязвимых частях тела, откуда обычно исходит этот запах. Недавно ученые обнаружили, что подобные средства радикально меняют микрофлору кожи и делают ее уязвимой для воспалений, что заставило их искать альтернативные способы избавления от неприятных ароматов.Агрен и его коллеги, как выражается сам ученый, фактически случайно создали замену для дезодорантов, экспериментируя с оксидом цинка (ZnO). Как давно знают ученые, это вещество обладает достаточно сильными антибактериальными свойствами, и оно давно применяется в стоматологии, при производстве зубной пасты и различных медицинских инструментов.В последнее время оно начало рассматриваться как средство для дезинфекции открытых ран и хирургических швов. Проводя подобные опыты, Агрен заметил, что эмульсионный раствор ZnO не только ликвидировал воспаления, но и уничтожал все колонии бактерий из родов Corynebacterium и Staphylococcus.Эти микробы, как отмечает биолог, вырабатывают большие количества жирных кислот, которые сегодня считаются главным источником неприятного аромата пота. Эта идея натолкнула его на мысль проверить, что произойдет, если обработать этим раствором не рану, а подмышки здоровых людей.Набрав группу из трех десятков добровольцев, Агрен и его коллеги попросили их не пользоваться дезодорантами на протяжении трех недель. Через семь дней после отказа от антиперспирантов, ученые пригласили добровольцев в свою лабораторию, собрали образцы пота и микробов, после чего обработали их подмышки двумя «новыми дезодорантами». В половине случаев один из них был заменен на пустышку, о чем не знали ни сами участники опытов, ни экспериментаторы. Повторяя эту процедуру каждые три дня, ученые интересовались у добровольцев тем, как пахнут их подмышки и какое средство они считали более эффективным.Эти опыты неожиданно показали, что раствор оксида цинка очень эффективно справлялся с этой задачей, уничтожая все колонии Corynebacterium и Staphylococcus на коже добровольцев. Сила его действия не зависела от пола участников опытов, уровня кислотности их кожи и других ее свойств, чего изначально опасались Агрен и его коллеги.Подобные успехи, по его словам, уже привлекли внимание компании Colgate-Palmolive, одного из крупнейших производителей гигиенических средств в мире. Ученые планируют провести более масштабные эксперименты вместе с ее специалистами в ближайшее время.
https://ria.ru/20160519/1436595385.html
https://ria.ru/20180228/1515441699.html
дания
РИА Новости
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
2019
РИА Новости
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
Новости
ru-RU
https://ria.ru/docs/about/copyright.html
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/
РИА Новости
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
https://cdn21.img.ria.ru/images/144204/98/1442049867_321:0:4770:3337_1920x0_80_0_0_5716a5077beea6c30d98ca4f596a4b37.jpgРИА Новости
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
РИА Новости
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
дания, здоровье — общество, здоровье, бактерии, гигиена, кожа
МОСКВА,13 апр – РИА Новости. Раствор, содержащий в себе частицы окиси цинка, оказался намного более эффективным средством для борьбы с запахом пота, чем самые популярные дезодоранты. О результатах испытания этого средства ученые рассказали на конференции ECCMID 2019 в Нидерландах.
«Участники нашего эксперимента постоянно спрашивали у нас, «где мы можем купить это фантастическое средство?». Оно не содержало в себе ароматических добавок, как обычные дезодоранты, однако наши добровольцы всегда замечали, что оно подавляло любые неприятные запахи в их подмышках», — отмечает Магнус Агрен (Magnus Agren) из госпиталя Биспеберга в Копенгагене (Дания).
Вопреки общепринятым представлениям, человеческий пот не обладает своим собственным запахом. Его неповторимый «аромат», а также запах ношенных носков и одежды, возникает благодаря жизнедеятельности микробов, которые живут на нашей коже. Некоторые из них «съедают» органику, содержащуюся в поте, и выделяют взамен различные летучие соединения.
Многие современные дезодоранты убивают этих микробов в подмышках и других уязвимых частях тела, откуда обычно исходит этот запах. Недавно ученые обнаружили, что подобные средства радикально меняют микрофлору кожи и делают ее уязвимой для воспалений, что заставило их искать альтернативные способы избавления от неприятных ароматов.
19 мая 2016, 17:23НаукаУченые выяснили, почему нестираные носки и одежда плохо пахнутБританские химики выяснили, что за неприятный запах пота ответственны шесть органических молекул бактериального происхождения, которые разрушаются только при стирке горячей водой.Агрен и его коллеги, как выражается сам ученый, фактически случайно создали замену для дезодорантов, экспериментируя с оксидом цинка (ZnO). Как давно знают ученые, это вещество обладает достаточно сильными антибактериальными свойствами, и оно давно применяется в стоматологии, при производстве зубной пасты и различных медицинских инструментов.
В последнее время оно начало рассматриваться как средство для дезинфекции открытых ран и хирургических швов. Проводя подобные опыты, Агрен заметил, что эмульсионный раствор ZnO не только ликвидировал воспаления, но и уничтожал все колонии бактерий из родов Corynebacterium и Staphylococcus.
Эти микробы, как отмечает биолог, вырабатывают большие количества жирных кислот, которые сегодня считаются главным источником неприятного аромата пота. Эта идея натолкнула его на мысль проверить, что произойдет, если обработать этим раствором не рану, а подмышки здоровых людей.
Набрав группу из трех десятков добровольцев, Агрен и его коллеги попросили их не пользоваться дезодорантами на протяжении трех недель. Через семь дней после отказа от антиперспирантов, ученые пригласили добровольцев в свою лабораторию, собрали образцы пота и микробов, после чего обработали их подмышки двумя «новыми дезодорантами».
В половине случаев один из них был заменен на пустышку, о чем не знали ни сами участники опытов, ни экспериментаторы. Повторяя эту процедуру каждые три дня, ученые интересовались у добровольцев тем, как пахнут их подмышки и какое средство они считали более эффективным.
28 февраля 2018, 12:59НаукаБиологи нашли связь между обонянием и политическими идеалами людейЭти опыты неожиданно показали, что раствор оксида цинка очень эффективно справлялся с этой задачей, уничтожая все колонии Corynebacterium и Staphylococcus на коже добровольцев. Сила его действия не зависела от пола участников опытов, уровня кислотности их кожи и других ее свойств, чего изначально опасались Агрен и его коллеги.
Подобные успехи, по его словам, уже привлекли внимание компании Colgate-Palmolive, одного из крупнейших производителей гигиенических средств в мире. Ученые планируют провести более масштабные эксперименты вместе с ее специалистами в ближайшее время.
Убрать запах мочи с дивана, как удалить запах с дивана, запах нового дивана
Как известно, самое действенное средство от болезни – это профилактика. А что есть профилактика от загрязнения мягкой мебели, кроме как более аккуратное и бережное обращение с ней?
Но ведь даже новый диван может пахнуть. Может, но недолго. Запахи от новой мебели быстро выветриваются, если мебель сделана из качественных материалов. Резкий, неприятный запах может издавать новый диван, в котором некачественное наполнение. Если Вы почувствуете неприятный запах нового дивана, то такой диван лучше сразу же возвратить в магазин.
Как правило, самый сильный запах остаётся от мочи. Немногие владельцы диванов знают, как удалить запах с дивана, поэтому чистку дивана лучше поручить специалистам. Обратитесь к работникам клининговых компаний, и они приведут старый диван в порядок.
Расценки на такой вид работы в различных клининговых организациях очень разнятся, поэтому лучше обговаривайте стоимость услуг ещё по телефону, когда вызываете «чистку» на дом. Если Вам показалось, что расценки завышены, то попробуйте произвести чистку дивана и убрать запах мочи с дивана самостоятельно.
Чаще всего владельцы испорченных диванов используют специальные средства, которые предназначены для чистки мягкой мебели.
Современная индустрия бытовой химии сегодня предлагает обывателю огромное количество средств для чистки мягкой мебели. Основным недостатком этих средств является их не всесильность. Нередки случаи, когда удалить сильные загрязнения и запахи химическим бытовым средствам чистки мягкой оказывается не под силу.
Иногда потребители жалуются на остающиеся после применения некоторых чистящих средств разводы на обивке дивана. В этом случае рекомендуем пользователям внимательно читать инструкцию по использованию выбранного чистящего средства и выдерживать рекомендуемые пропорции.
Как избавиться от запаха мочи на диване?
- Химические бытовые средства.
Некоторые пользователи для выведения запаха мочи рекомендуют использовать канадское средство eko-max в составе которого есть масло чайного дерева, или американским средством Odorgone Gold Animal. Обильно побрызгайте этими средствами пятна мочи и на следующий день Вы не почувствуете запаха.
- Водный раствор столового уксуса.
Если Вы ищите менее вредный способ убрать запах мочи с дивана, то воспользуйтесь слабым водным раствором столового уксуса.
Возьмите ненужную пелёнку или старую простынь и опустите её в раствор, выжмите её и положите на диван, прижмите посильнее к обивке так, чтобы уксусный раствор мог проникнуть в верхние слои мебели. Сделать это нужно несколько раз. Уксус нейтрализует неприятный запах и очистит обивку от загрязнения. - Раствор марганцовки.
Вывести запах кошачьей мочи с дивана Вам поможет раствор марганцовки. Это вещество является сильным окислителем, обладающим к тому же и дезодорирующим эффектом.
Намочите раствором испорченный участок дивана и дайте мебели высохнуть. Если запах полностью не исчезнет, процедуру следует повторить.
- Лимонный сок.
Лимонный сок также является превосходным окислителем, способным удалить запах кошачьей мочи с дивана. Выжмите сок из половинки лимона, смочите в нем губку и протрите помеченное питомцем место.
- Другие средства.
Устранить запах от свежего пятна вы можете с помощью таких средств как водка, глицерин, ополаскиватель для полости рта, концентрированный раствор соды, хозяйственное мыло, содержащее расщепляющий кристаллы мочевой кислоты.
Понимание микробной основы запаха тела у детей до полового созревания и подростков
Микробиом. 2018; 6: 213.
, 1 , 2 , 1 , 2 , 3 , 3 , 3 , 1 , 1 , 4 , 1 , 1 , 4 , 1 , 1 и 2, 5Tze Hau Lam
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Сингапур, 13854741 Давид Верзот
2 Вычислительная и системная биология, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
Purbita Brahma
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Amanda Hui Qi Ngutational
2 Computing и системной биологии, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
Ping Hu
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Dan Schnell 9 0041
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Jay Tiesman
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Rong Kong
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Singapore, 138547 Singapore
Thi My Uyen Ton
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Singapore, 138547 Singapore
Jianjun Li
4 Procter & Gamble Sharon Woods Innovation Center, Sharonville, OH 45241 США
May Ong
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Ян Лу
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Дэвид Свайл
4 0002 9000 Procter & Gamble Центр инноваций Шэрон Вудс, Шаронвилл, Огайо 45241 СШАПинг Лю
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Цзицюань Лю
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Ниранджан Нагараджан
2 Институт вычислительной и системной биологии of Singapore, Singapore, 138672 Singapore
5 Медицинская школа Yong Loo Lin, Национальный университет Сингапура, Сингапур, 119228 Сингапур
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
2 Вычислительный и системной биологии, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
4 Procter & Gamble Sharon Woods Innovation Center, Sharonville, OH 45241 USA
5 Медицинский факультет Юн Лу Линя, Национальный университет Сингапур, Сингапур, 119228 Сингапур
Автор, ответственный за переписку.Поступило 28.05.2018 г .; Принято 2 ноября 2018 г.
Открытый доступ Эта статья распространяется в соответствии с условиями Международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы должным образом укажете автора (авторов) и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения. Отказ от лицензии Creative Commons Public Domain Dedication (http: // creativecommons.org / publicdomain / zero / 1.0 /) применяется к данным, представленным в этой статье, если не указано иное. Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.- Дополнительные материалы
Дополнительный файл 1: Рисунки S1-S10 , Таблицы S1, S3 и S4 . (PDF 3276 кб)
GUID: 4D6F7D72-9FB1-448F-A881-A5C17FD171DD
Дополнительный файл 2: Таблица S2. Оценка запаха и данные метагеномного секвенирования для всех образцов в этом исследовании. Таблица S5. GC-ольфактометрия пота, взятого у детей и подростков. Таблица S6. Обнаруженные пути MetaCyc, которые, как было установлено, связаны с неприятным запахом, на основании значений обилия путей из HUMAnN2. Для области головы значимой ассоциации не обнаружено. Таблица S7. Ключевые пути, связанные с производством неприятного запаха, и их таксономические факторы. Таблица S8. Информация о том, как образцы были распределены в партиях для подготовки библиотеки и секвенирования, чтобы избежать эффекта партии. Таблица S9. Считывает сопоставленные (%) семейств генов UniRef90 и пути MetaCyc. (ZIP, 92 кб)
GUID: 36CA9ED0-CC48-4DB0-8510-8A2BEB1497C8
- Заявление о доступности данных
Наборы данных, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны в Европейском архиве нуклеотидов в рамках проекта id ERP1084 https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB26427).
Аннотация
Предпосылки
Несмотря на то, что человеческий пот не имеет запаха, считается, что рост бактерий и разложение определенных предшественников запаха в нем вызывает запах тела у людей.Хотя механизмы образования запаха широко изучены у взрослых, мало что известно о подростках и детях, не достигших полового созревания, у которых состав пота отличается от незрелых апокринных и сальных желез, но, возможно, они более восприимчивы к социальному и психологическому воздействию неприятного запаха.
Результаты
Мы интегрировали информацию из анализа всего микробиома нескольких участков кожи (подмышки, шея и голова) и нескольких временных точек (1 час и 8 часов после ванны), проанализировав в общей сложности 180 образцов для проведения самого большого метагенома. проведенное ассоциацией исследование неприятного запаха.Значительные положительные корреляции наблюдались между интенсивностью запаха и относительной численностью Staphylococcus hominis , Staphylococcus epidermidis и Cutibacterium avidum , а также отрицательная корреляция с видами Acinetobacter schindleri и Cutibacterium. Анализ метаболических путей выявил связь продукции изовалериановой и уксусной кислот (кислый запах) из обогащенных S. epidermidis (подростковая подмышечная область) и S.hominis (детская шея) и продукция серы из Staphylococcus видов (подмышечная впадина подростка) с интенсивностью запаха, что хорошо согласуется с наблюдаемыми характеристиками запаха у детей и подростков в предпубертатном возрасте. Эксперименты с культурами человеческого и искусственного пота подтвердили способность S. hominis и S. epidermidis независимо производить неприятный запах с отчетливыми характеристиками запаха.
Выводы
Эти результаты демонстрируют возможности метагеномики кожи для изучения ко-метаболических взаимодействий между хозяином и микробами, выявления различных путей образования запаха от пота у детей и подростков в предполовозрелом возрасте и выделения ключевых ферментативных мишеней для вмешательства.
Электронные дополнительные материалы
Онлайн-версия этой статьи (10.1186 / s40168-018-0588-z) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.
Введение
Запах тела в животном мире часто играет важную роль в защите от хищников и выживании [1–3]. Считается, что у людей обонятельные сигналы играют роль в обнаружении родства и выборе партнера [4]. Несмотря на эти функции, запах тела, как правило, вызывает сильную социальную стигматизацию, а его социальное и психологическое воздействие на затронутых субъектов до конца не изучено.
Считается, что запах тела у людей в первую очередь опосредован бактериальным разложением естественно секретируемых, не пахнущих компонентов пота, особенно жирных кислот, алифатических аминокислот с разветвленной цепью, глицерина и молочной кислоты, происходящих из эккринных, апокринных и сальных желез. железы [5–8]. В исследованиях у взрослых с использованием секвенирования маркерных генов (16S рРНК) и других подходов, ряд бактерий, но в первую очередь видов Corynebacterium , были связаны с неприятным запахом [6, 9, 10].Кроме того, определенные бактериальные ферменты и пути, которые воздействуют на непахучие белковые предшественники или продуцируют молекулы запаха, такие как уксусная кислота, летучие жирные кислоты, сульфанилы и тиоспирты, также были идентифицированы с использованием подходов, основанных на культуре [5-7, 10, 11] . Однако существуют значительные различия между физиологией, связанной с запахом, и микробиотой кожи взрослых и не взрослых. Например, апокриновые железы (в основном находящиеся в местах тела с волосяными фолликулами, например, в подмышечной впадине) неактивны до тех пор, пока не будут стимулированы гормональными изменениями в период полового созревания, и в отличие от эккринных желез, которые секретируют непрерывно, апокриновые железы секретируют периодически [12].Эккриновый пот (прозрачный, без запаха, pH 4,0–6,8, на 98–99% состоит из воды, но также содержащий хлорид натрия, жирные кислоты, молочную кислоту, лимонную кислоту, аскорбиновую кислоту, мочевину и мочевую кислоту) и апокриновый пот (без запаха, pH 6,0–7,5, содержащие воду, белки, углеводы, липиды и стероиды) имеют различный состав и распределение (все участки тела против внутренних волосяных фолликулов) [13]. Кроме того, сальные железы, которые выделяют маслянистое вещество без запаха, называемое кожным салом, в волосяные фолликулы (pH 4,5–5,5), имеют повышенную активность в период полового созревания [14].Таким образом, запах тела обычно считается значимым только у лиц, достигших полового созревания, и у взрослых, и в основном он изучался в области подмышечной впадины, где количество апокринных желез превышает количество эккринных желез в 10 раз.
Большинство исследований неприятного запаха проводилось в умеренном климате и на субъектах из Европы и Северной Америки. Считается, что азиаты, особенно выходцы из Восточной Азии, генетически предрасположены к уменьшению неприятного запаха [15, 16]. Однако жаркая и влажная тропическая среда может увеличить выделение потоотделения и связанное с этим возникновение неприятного запаха.Основываясь на обширных исследованиях в контексте Юго-Восточной Азии, мы определили, что запах тела действительно является серьезной проблемой для детей и подростков, не достигших полового созревания, как с точки зрения оценок родителей, так и с точки зрения экспертных оценок (дополнительный файл 1: таблица S1). Влияние неприятного запаха в детстве на эмоциональное, социальное и психологическое благополучие субъектов является неизведанной областью, но, вероятно, вызывает большее беспокойство, чем неприятный запах взрослых. Более того, поскольку секреция апокринных желез у детей неактивна, метаболические взаимодействия между хозяином и микробами, которые приводят к неприятному запаху, остаются невыясненными.
Для решения этой темы мы набрали когорту детей и подростков до полового созревания на Филиппинах, которые были оценены профессиональным парфюмером на предмет определения интенсивности запаха (диапазон 0–100) и характера (например, сладкого, жирного, прогорклого, кислого и т. hircine, сера), в дополнение к оценке их родителей (дополнительный файл 2: таблица S2). В план исследования входили отбор образцов из нескольких участков тела (шея, подмышки, голова), связанных с запахом тела, а также из нескольких временных точек после ванны и активного отдыха, чтобы систематически понять микробную основу запаха тела у этих людей.В общей сложности 180 образцов были подвергнуты глубокому анализу секвенирования всего метагенома, что позволило нам изучить членов бактериального, вирусного и эукариотического сообществ и их функциональную связь с неприятным запахом. Мультимодальный анализ, сочетающий регрессию к интенсивности запаха и дифференциальные сигнатуры до и после активного отдыха, использовался для выявления таксонов и функций микробов, связанных с неприятным запахом у детей (5–9 лет) и подростков (15–18 лет). Эти подписи частично перекрываются (например, S.hominis ), но также отличные от того, что было зарегистрировано во взрослых когортах. В целом, наше исследование подчеркивает важность перехода от «мешка генов» к анализу метагеномов «мешка геномов» для всестороннего изучения метаболических взаимодействий между хозяином и микробами.
Результаты
Отчетливая интенсивность запаха и характеристики, связанные с различными частями тела у детей и подростков
Наше исследование было основано на двух разных возрастных группах лиц: дети предпубертатного возраста (5–9 лет) и подростки (15–18 лет). лет), что позволяет более детально изучить микробную основу неприятного запаха на ранних этапах жизни (см. раздел «Материалы и методы», рис.a, Дополнительный файл 2: Таблица S2). В то время как подмышечная впадина (подмышечная впадина) была основным местом исследования неприятного запаха, исследования потребителей показали, что неприятный запах из области шеи (затылка) и головы (средняя часть волосистой части головы) также является областью, вызывающей беспокойство у семей, и поэтому были включены в это исследование ( Дополнительный файл 1: Таблица S1). Субъекты оценивались в двух временных точках, разделенных 7 часами отдыха и упражнений для образования потоотделения, что обеспечивало хорошо подходящую экспериментальную установку для учета вариабельности между хозяевами и исследования того, как микробы превращают предшественники пота в неприятный запах (рис.а). Кроме того, первая временная точка была сделана через 1 час после душа, что обеспечило стандартизованный исходный уровень для всех людей. Образцы были взяты в тот же день и в тот же день на Филиппинах (Манила) при относительно постоянной температуре окружающей среды 32 ° C и влажности 66%.
Дизайн исследования и взаимосвязь между интенсивностью запаха, характеристиками запаха, возрастом и участками тела. a Схема с подробным описанием целевых групп исследования, номеров образцов и точек времени сбора. b Распределение интенсивности запаха по участкам тела до (1 ч) и после (8 ч) упражнений и по возрастным группам (дети и подростки; ** p -значение <0.05, * p -значение <0,1). c Линии тренда, показывающие взаимосвязь между различными характеристиками запаха и интенсивностью запаха на разных участках тела (1 = присутствует, 0 = отсутствует). d Относительное распределение кислого запаха и запаха серы у субъектов до (1 ч) и после (8 ч) упражнений по возрастным группам и участкам тела. Точками отмечена интенсивность запаха, как показано на левой оси, в то время как гистограммы показывают количество субъектов, как показано на правой оси
В дополнение к группам запахов, оцененным родителями (дополнительный файл 2: таблица S2), запах оценивался одним профессиональным парфюмером. интенсивность и характер во всех предметах, местах и во все моменты времени.Как и ожидалось, интенсивность запаха, измеренная профессиональным парфюмером, была значительно выше в подмышках у детей и подростков после физических упражнений (тест Вилкоксона p — значение <0,05) (рис. B). Незначительное увеличение интенсивности запаха было также обнаружено в области шеи и головы у подростков и детей, соответственно (критерий Вилкоксона p — значение <0,1). У подростков раньше была более высокая интенсивность запаха, чем у детей в подмышечной области (тест Вилкоксона , p -значение = 2.4 × 10 — 4 ) и после (тест Вилкоксона p -значение = 2,6 × 10 — 4 ) упражнений, и в целом интенсивность запаха была ниже в области шеи и головы по сравнению с областью подмышек. Что касается характеристик запаха, то в области подмышек и шеи наблюдались кислые запахи и запахи серы со средней и высокой интенсивностью запаха, соответственно (рис. C). Напротив, область головы в первую очередь характеризовалась жирным запахом, подчеркивая, что разные области тела, вероятно, имеют разный микробный метаболизм, способствующий возникновению неприятного запаха.Анализ характеристик запаха по возрастным группам и временным точкам показал, что, в то время как дети в первую очередь определяются характеристиками запаха кислого или кислого + серы, подростки с большей вероятностью будут иметь характеристику кислый + сера, которая смещается к доминирующей характеристике серы после упражнений (рис. D). . Однако это свойство, по-видимому, характерно для подмышек, а в области шеи и головы как у детей, так и у подростков преобладает кислый запах (рис. D). Эти наблюдения обеспечивают важный фон для нашего анализа микробного вклада в неприятный запах в следующих разделах.
Особенности микробиома кожи в разных возрастных группах и в связи с неприятным запахом
Для изучения таксономического и функционального состава микробиома кожи в нашей когорте образцы были собраны с использованием недавно установленного протокола снятия ленты [17], обеспечивающего достаточное количество ДНК для построения метагеномные библиотеки дробовика для 100% наших образцов и ни одного из контрольных образцов (коллекционные и лабораторные контроли). Глубокое секвенирование на платформе Illumina было использовано для характеристики образцов микробиома кожи для всех людей, участков и временных точек (180 образцов, ~ 69 миллионов считываний в среднем; дополнительный файл 2: таблица S2).В среднем чтения были высокого качества (> Q30), при этом более 98% чтений можно было использовать после качественной фильтрации (дополнительный файл 2: таблица S2). Используя метагеномные данные для перекрестного анализа царств, мы отметили, что разные участки тела демонстрировали различное распределение уровней царства (дополнительный файл 1: рисунок S1). Бактерии в большей степени присутствовали в образцах подмышек (тест Вилкоксона p — значение <3 × 10 — 4 ), в то время как эукариоты были сравнительно более многочисленными на детских головах (тест Вилкоксона p — значение <2 × 10 — 9 ), а образцы шеи имели уникально более высокую относительную долю вирусов (тест Вилкоксона p — значение <7 × 10 — 3 ).Повышенное количество вирусов и эукариот в областях головы и шеи аналогично тому, что наблюдалось в близлежащих участках (ретроаурикулярная складка, затылок) у взрослых, что свидетельствует об уникальных нишах, которые они предлагают [18].
Определенные сигнатуры микробиома появились для каждого участка тела на уровне видов и рода бактерий (дополнительный файл 1: рисунки S2, S3), несмотря на наличие явных различий между микробиомами подростков и детей (рисунок а, дополнительный файл 1: Рисунок S4).Например, Staphylococcus hominis является наиболее распространенным видом бактерий в подмышечной области, несмотря на заметные различия между детьми и подростками (70% против 37%; тест Вилкоксона p -значение <5 × 10 — 4 ). Точно так же, хотя повышенное присутствие M. globosa и C. acnes отличает шею и голову от подмышек, у детей на голове относительно больше M. globosa , тогда как у подростков преобладают C.acnes (рис. а, дополнительный файл 1: рис. S3, S4). Эти различия коррелируют с изменениями активности апокринных желез в период полового созревания и могут служить основой для различий в характеристиках неприятного запаха между детьми и подростками. Кроме того, у всех субъектов было гораздо меньшее количество видов Corynebacterium в подмышечных впадинах, чем то, что наблюдалось у взрослых [9], что позволяет предположить, что отдельные виды могут играть роль в неприятном запахе в этих возрастных группах.
Связь между микробиомом кожи, интенсивностью запаха, возрастом и временем отбора проб. a Относительная численность кожных микробов (> 0,1%) на разных участках на уровне родов и видов. Данные представлены как средняя относительная численность внутри группы. b Диаграммы распределения для канонического анализа основных координат (CAP), иллюстрирующие силу связи между интенсивностью запаха, возрастом, временем отбора проб и микробиомом кожи. Анализ CAP основан на несходстве Брея-Кертиса. Размер каждой точки представляет собой оценку относительной интенсивности запаха в каждом образце, а число, перекрывающее каждую точку, указывает образцы, собранные до (1) или после (8) упражнения
Канонический анализ основных координат изменения микробиома кожи на разных участках тела в отношение к возрастной группе, полу и временным точкам (1 час или 8 часов) дополнительно иллюстрирует силу связи между интенсивностью запаха, возрастом, временем отбора проб и микробиомом кожи (рис.б). В подмышечной области конкретные возрастные группы и время отбора образцов хорошо коррелируют с интенсивностью запаха (значение p <0,001) и в меньшей степени с полом (значение p <0,05) в зависимости от состава микробиома кожи. Этот образец также наблюдается на шее, но не имеет значения на голове, где существует более сильная связь с полом (дополнительный файл 1: рисунок S5). Состав микробиома в области головы также уникален тем, что не кажется, что он заметно меняется после тренировки.Одна из возможностей для этого - ограниченное воздействие душа на микробиом кожи головы по сравнению с другими участками, поскольку микробы, находящиеся в волосяном фолликуле, делают микробиом кожи головы более стабильным и эластичным.
Виды Staphylococcus сильно коррелируют с интенсивностью запаха у детей и подростковМы отметили, что дети, принадлежащие к определенным родителями категориям («неприятный запах» и «без неприятного запаха»), не демонстрировали существенно различающуюся интенсивность запаха, как это определено профессиональным парфюмером. , по возрастным группам и временным точкам (Дополнительный файл 1: Рисунок S6), потенциально подчеркивая проблемы, связанные с тем, чтобы при таком анализе полагаться исключительно на восприятие потребителей.Однако группы «неприятного запаха» действительно показали тенденцию к более высокой интенсивности запаха, и эта разница может достигать статистической значимости при больших размерах выборки. Вместо проведения категориального анализа в этом исследовании мы искали таксоны и функции микробов, которые напрямую связаны с определяемой парфюмером интенсивностью запаха (см. Раздел «Материалы и методы»). Кроме того, доступность данных из двух временных точек, до и после тренировки, в дальнейшем использовалась для определения таксонов и функций микробов, которые изменяются в долгосрочном плане в связи с повышенным выделением пота и запаха (см. Раздел «Материалы и методы», Дополнительный файл 1: Рисунок S7, таблица).
Таблица 1
Список микробов на уровне видов, которые показывают значительную корреляцию с интенсивностью запаха, по крайней мере, в одной возрастной группе
Виды | Молодежь | Дети | Подростки | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Спирмена 18 4 902 Wilcoxon | Spearman’s ρ | Wilcoxon | Spearman’s ρ | Wilcoxon | | |||||||
ρ | p -значение | p -значение | ρ | p -значение | p -значение | ρ | p -значение | p -значение | ||||
Подмышки | ||||||||||||
Staphylococcus epidermidis | 0.67 | 5 × 10 −7 | ↑ | 0,04 | 0,44 | н.у. | ↑ | н.у. | 0,40 | н.у. | ↑ | н.у. |
Cutibacterium avidum | 0,63 | 5 × 10 −6 | ↑ | н.у. | 0,52 | н.у. | ↑ | н.у. | 0,31 | н.у. | ↑ | н.у. |
Corynebacterium pseudogenitalium | 0.44 | 10 −2 | ↓ | н.у. | 0,42 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,13 | н.у. | ↑ | н.у. |
Corynebacterium tuberculostearicum | 0,38 | 0,06 | ↓ | н.у. | 0,35 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,18 | н.у. | ↑ | н.у. |
Malassezia globosa | 0.53 | 7 × 10 −4 | ↓ | н.у. | 0,37 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,33 | н.у. | ↑ | н.у. |
Шея | ||||||||||||
Staphylococcus hominis | 0,32 | n.s. | ↑ | н.у. | 0,65 | 10 −2 | ↑ | н.у. | 0,09 | н.у. | ↑ | н.с. |
Staphylococcus phage StB27 | 0,49 | 0,02 | ↑ | n.s. | 0,77 | 10 −4 | ↑ | н.у. | 0,19 | н.у. | ↑ | н.у. |
Cutibacterium granulosum | — 0,45 | 0,03 | ↓ | 0,06 | — 0,48 | н.у. | ↓ | н.у. | — 0,38 | н.у. | ↓ | н.у. |
Acinetobacter schindleri | — 0,43 | 0,03 | ↓ | 0,07 | — 0,47 | н.у. | ↓ | н.у. | — 0,30 | н.у. | ↓ | н.у. |
Cutibacterium acnes | — 0,28 | n.s. | ↓ | н.у. | — 0.54 | 0,08 | ↓ | н.у. | — 0,21 | н.у. | ↓ | н.у. |
В целом, между поперечным и продольным анализом наблюдались устойчивые тенденции, где таксоны, которые были положительно коррелированы с неприятным запахом, также увеличивались в изобилии после упражнений (таблица). Анализ по возрастным группам выявил ключевые различия между группами; хотя в некоторых случаях тонкие, но устойчивые тенденции усиливались путем объединения данных по возрастным группам (обозначенным как «Молодежь»).Например, в подмышечной области Staphylococcus epidermidis продемонстрировал наиболее сильную связь с неприятным запахом, когда обе возрастные группы были проанализированы совместно (дополнительный файл 1: рисунок S7, таблица), хотя тенденция постоянно наблюдалась в каждой возрастной группе и во временные точки до и. после тренировки. Напротив, на шее Staphylococcus hominis было связано с интенсивностью неприятного запаха, но только у детей ( ρ = 0,65) и с низкой корреляцией, наблюдаемой у подростков ( ρ = 0.09; Дополнительный файл 1: рисунок S7, таблица). Интересно, что фаг Staphylococcus также обнаружил положительную корреляцию с неприятным запахом, что потенциально обусловлено ассоциацией его видов-хозяев и подчеркивает важность взаимодействия фага-бактерии на коже [19, 20]. Этот анализ дополнительно подчеркивает важную роль, которую виды Staphylococcus играют в неприятном запахе у детей, и определяет их конкретный вклад в различных участках тела и возрастных группах [5, 8].
A Cutibacterium видов ( C. avidum ) был единственным другим организмом с устойчивой ассоциацией с более сильным неприятным запахом, особенно в подмышечной области, хотя его значение остается неясным. Другие виды Cutibacterium ( C. granulosum , C. acnes ) были отрицательно связаны с неприятным запахом в области шеи (таблица), возможно, из-за межбактериальной конкуренции с видами Staphylococcus [21, 22]. Corynebacterium видов ( C.pseudogenitalium и C. tuberculostearicum ) положительно коррелировали с интенсивностью запаха в подмышечной области, но с постоянным увеличением относительной численности после упражнений, наблюдаемым только у подростков (таблица). Поскольку известно, что виды Corynebacterium продуцируют запахи серы [23, 24], это наблюдение может быть отражением того факта, что в микробиоме кожи подмышек до полового созревания отсутствуют предшественники из апокринной секреции, чтобы поддерживать их метаболизм в сернистый неприятный запах.
Интересно, что видов Acinetobacter (в частности, A. schindleri ) были обогащены в области шеи детей с более низкой интенсивностью неприятного запаха, а также в 1-часовой временной точке. Пути, задействованные у этих видов в ослаблении восприятия неприятного запаха, неясны, но один из возможных механизмов — это конкуренция с другими микробами через разложение предшественников неприятного запаха на алифатические молекулы [25]. В соответствии с нашим более ранним анализом (дополнительный файл 1: рис. S5), не было обнаружено, что микробы связаны с неприятным запахом в области головы.
В целом, эти анализы подчеркивают различные микробные ассоциации с запахом тела и то, что различное распределение ключевых микробных факторов и компонентов запаха по людям, участкам тела, возрастным группам и временным точкам может играть роль в образовании запаха. Примечательно, что анализ микробиома на уровне родов не смог выявить ключевые ассоциации в подмышечной области (дополнительный файл 1: таблица S3), что подчеркивает важность видовых различий и сильные стороны метагеномного анализа дробовика для изучения микробов, связанных с неприятным запахом.В частности, наши результаты подчеркивают доминирующую роль, которую S. epidermidis может играть в неприятном запахе подмышек с кислыми характеристиками, который мы часто отмечали у детей и, в некоторой степени, у подростков (рис. D). Переходный период полового созревания приводит к усилению преобладания серы в запахе, и сдвиги в активности Staphylococcus и Corynebacterium могут способствовать этому [5] . Мы дополнительно исследуем эти отношения в следующем разделе с помощью анализа путей, связанных с неприятным запахом, в микробиоме кожи.
Идентификация продукции изовалериановой и уксусной кислоты как ключевого пути, связанного с неприятным запахом, у детей и подростков
В рамках плана исследования пот тела был собран у субъектов, объединен и использован для различных анализов (высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), жидкостная хроматография и газовая хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ / ГХМС)) для выявления предшественников запаха, которые могут по-разному присутствовать у детей и подростков (см. Раздел «Материалы и методы»).Этот анализ показал, что молочная кислота была самым распространенным предшественником у детей и подростков, за ней следовали глицерин (больше у подростков), изолейцин и лейцин (дополнительный файл 1: таблица S4). Затем объединенный пот инкубировали в течение 24 часов для измерения продукции молекул, связанных с неприятным запахом, с использованием GC-ольфактометрии (GC-O) и анализа GCMS (дополнительный файл 1: рисунок S8 и дополнительный файл 2: таблица S5). В целом, дети и подростки выявили схожие профили GCMS и GC-O, причем подростки были более богаты доминирующими соединениями — уксусной кислотой и изовалериановой кислотой.Эти два сильнодействующих одоранта имеют характер кислого / кислого запаха, что позволяет предположить, что наблюдаемый «букет кислинки» у наших испытуемых в значительной степени обусловлен этими двумя одорантами.
На основе этой информации мы затем перешли к функциональному анализу, чтобы обнаружить гены и пути, связанные с неприятным запахом, in vivo и на основе данных. Мы использовали подход, аналогичный тому, который использовался для таксономического анализа, чтобы идентифицировать гены и начальный набор путей, коррелирующих с интенсивностью неприятного запаха, и тех, которые чрезмерно представлены после физических упражнений и образования потоотделения (см. Раздел «Материалы и методы»; Дополнительный файл 2: Таблица S6 ).Затем значительно ассоциированные гены были агрегированы в путях, чтобы понять их вклад в производство соединений, вызывающих неприятный запах. Сначала мы использовали подход «мешка генов», который обычно используется в метагеномике, агрегируя изобилие генов без учета таксономического происхождения считываний, чтобы найти ассоциации с неприятным запахом. Однако сопоставление идентифицированных генов с путями не выявило устойчивых ассоциаций внутри пути (например, Дополнительный файл 1: Рисунок S9), вероятно, из-за присутствия нескольких родственных видов (например.g., S. epidermidis и S. hominis ) с явным вкладом в неприятный запах. Напротив, анализ «мешка геномов», который включал видовую идентичность генов, выдвинул на первый план несколько значимых и последовательных ассоциаций путей и соответствующий вклад видов (дополнительный файл 2: таблица S7).
В частности, в подмышечной области метаболизм пирувата и метаболизм аминокислот с разветвленной цепью были обогащены генами S. epidermidis , которые значительно положительно коррелировали с неприятным запахом, что согласуется с нашим таксономическим анализом (рис.а) . Ферменты, полученные из S. epidermidis , участвуют в каскаде множества метаболических путей, ведущих к выработке как уксусной кислоты, связанной с кислым запахом, так и изовалериановой кислоты. Молочная кислота и глицерин превращаются в пируват в процессе гликолиза. В присутствии пирувата ферменты, ответственные за биосинтез и последующее разложение лейцина, валина и изолейцина с образованием изовалериановой кислоты жирной кислоты с разветвленной цепью (например, ключевые ферменты ацетолактатсинтазы (EC: 2.2.1.6) и трансаминазы аминокислот с разветвленной цепью (EC: 2.6.1.42)), как было обнаружено, в значительной степени связаны с неприятным запахом (рис. B, c). Независимым путем было обнаружено, что ферменты, участвующие в окислительной деградации алифатических карбоксилатов пирувата до ацетил-КоА (конверсия Свансона) в процессе, который является ключевым для производства уксусной кислоты и кислого запаха, связаны с неприятным запахом у S. epidermidis (Рис. D; например, пируватдегидрогеназа (EC: 1.2.4.1)). Эти результаты согласуются с ранее опубликованными исследованиями in vitro [10].Подобные пути были также связаны с неприятным запахом в шее, но на этот раз ассоциации были замечены в первую очередь с генами S. hominis и, что более важно, у детей (рис.).
Пути и ферменты, связанные с производящими кислый запах соединениями в подмышечной области. a Количество ферментов (КО), кодируемых микробами, связанными с неприятным запахом, в подмышечной области для путей «биосинтеза / разложения валина, лейцина и изолейцина» и «метаболизма пирувата» KEGG. Цифры в столбиках указывают количество КО, относительное содержание которых в значительной степени коррелирует с интенсивностью запаха. b — d Соответствующие диаграммы путей KEGG, где розовые прямоугольники указывают на значимые положительно коррелированные КО в S. epidermidis среди подростков, а серые прямоугольники указывают на ферменты, которые присутствуют, но не имеют значительной корреляции с интенсивностью запаха. Соединения, вызывающие запах, и их прекурсоры отмечены звездочкой (*).
Пути и ферменты, связанные с соединениями, вызывающими кислый запах, в области шеи. a Количество ферментов (КО), кодируемых микробами, связанными с неприятным запахом, в области шеи для путей «биосинтеза / разложения валина, лейцина и изолейцина» и «метаболизма пирувата» KEGG.Цифры в столбиках указывают количество КО, относительное содержание которых в значительной степени коррелирует с интенсивностью запаха. b — d Соответствующие диаграммы путей KEGG, где розовые прямоугольники указывают на значимые положительно коррелированные KO у Staphylococcus видов среди детей, а серые прямоугольники указывают на ферменты, которые присутствуют, но не имеют значительной корреляции с интенсивностью запаха. Соединения, вызывающие запах, и их прекурсоры отмечены звездочкой (*)
3-метил-3-сульфанилгексанол (3M3SH), 3-метил-2-гексеновая кислота (3M2H) и 3-метил-3-гидроксигексановая кислота. (HMHA) — известные одоранты, ответственные за запах подмышек у взрослых [7].Для производства 3-метил-3-сульфанилгексанола (3M3SH), который связан с неприятным запахом с характеристиками серы, мы наблюдали положительную связь с обоими видами Staphylococcus ( S. hominis и S. epidermidis ; дополнительный файл 1: Рисунок S10). Предыдущие наблюдения in vitro продемонстрировали способность S. hominis , но не S. epidermidis , генерировать 3MS3H [5]. Наши метагеномные результаты указывают на присутствие цистатионин-бета-лиазы в S.epidermidis , что позволяет предположить, что кроме S. hominis , штаммы S. epidermidis , выделенные в азиатских популяциях, также могут генерировать 3M3SH. Для подтверждения этой возможности необходимы дальнейшие эксперименты in vitro. Для 3M2H и HMHA наш анализ GCMS обнаружил отсутствие или минимальное присутствие этих одорантов. Кроме того, наши метагеномные данные не выявили присутствия Corynebacterium striatum и фермента аминоацилазы (agaA; у детей и подростков), которые, как было показано, опосредуют продукцию HMHA [23].Эти данные показывают, что эти молекулы вряд ли будут основными причинами неприятного запаха в наших когортах по сравнению с их ключевой ролью у взрослых [14].
Чтобы проверить связь видов Staphylococcus с характеристиками кислого запаха, мы культивировали изоляты в стерилизованных пулах пота, полученных от субъектов, включенных в исследование, и измерили продукцию различных соединений с неприятным запахом с помощью анализа GCMS (см. Раздел «Материалы и методы» ). В то время как оба вида Staphylococcus были способны продуцировать значительные количества уксусной кислоты и изовалериановой кислоты, другие виды, обычно встречающиеся на коже, такие как C.acnes и M. luteus — нет (рис.). Эти результаты подчеркивают основную роль видов Staphylococcus в производстве уксусной кислоты, изовалериановой кислоты и 3M3SH из предшественников запаха в поте и в объяснении характеристик запаха кислого и серного, наблюдаемого у азиатских детей и подростков.
Способность превращать предшественники пота в соединения, вызывающие неприятный запах, у различных микробов кожи. GCMS — результат инокуляции одной бактерии в течение 24 часов в поте, собранном у субъектов.Обратите внимание, что только S. epidermidis и S. hominis продуцируют значительные количества уксусной кислоты и изовалериановой кислоты, что согласуется с ассоциациями, наблюдаемыми in vivo. Эксперименты с культивированием проводились в аэробных условиях.
Обсуждение
Неприятный запах — это фенотип, который, как хорошо известно, возникает в результате специфических взаимодействий между предшественниками запаха хозяина и поддерживаемым ими микробным метаболизмом [6]. В этом отношении данное исследование служит идеальной испытательной площадкой для изучения аналитических подходов к раскрытию метаболических взаимодействий между хозяином и микробиомом, которые определяют интересующий фенотип.В то время как неприятный запах у взрослых и европейцев широко изучался [5, 6, 9], неприятный запах у азиатов и особенно у детей и подростков не получил должного внимания. Наши исследования показывают, что это действительно проблема потребительского интереса, которая влияет на качество жизни пострадавших детей, предполагая, что ее влияние на психологическое благополучие детей заслуживает дальнейшего исследования.
При разработке исследования по выявлению видов и путей распространения микробов, связанных с неприятным запахом, необходимо учитывать несколько аспектов, включая возможность того, что могут быть таксоны, которые медленно растут, но сильно связаны с неприятным запахом, в то время как другие могут вызывать неприятный запах только тогда, когда они достаточно обильный.Таким образом, наш дизайн включал как продольные (использование упражнений для создания предшественников пота и запаха), так и поперечные аспекты в разных возрастных группах, чтобы в целом уловить различные сигналы ассоциации. Наши данные показывают, что в большинстве случаев имеются согласованные сигналы от продольного и поперечного анализов, за исключением видов Corynebacterium и M. globosa в подмышечных впадинах детей, чье явное снижение относительной численности при физических упражнениях (несмотря на положительную корреляцию с неприятным запахом) может быть связано с их более медленным ростом по сравнению с S.Эпидермодис . Кроме того, данные этого исследования подчеркивают различные микробные факторы, влияющие на запах тела в разных возрастных группах и участках тела, например, было обнаружено, что S. hominis имеет сильную связь с неприятным запахом в области шеи у детей, в то время как область подмышек показала значимая связь с S. epidermidis . И это несмотря на обилие S. hominis в подмышечной области, что позволяет предположить, что здесь играют роль различия в предшественниках пота из области шеи и подмышек и что S.epidermidis может иметь чрезмерный эффект в отношении образования неприятного запаха, когда присутствуют правильные предшественники.
Предыдущая работа по изучению микробного вклада в неприятный запах подмышек в первую очередь подчеркивала роль видов Corynebacterium [7] у взрослых. Используя секвенирование 16S рРНК, эти исследования показали, что виды Corynebacterium , Staphylococcus и Cutibacterium являются доминирующими бактериями в подмышечной области [9, 26–28]. Из них видов Corynebacterium оказались более многочисленными, чем видов Staphylococcus в группах лиц, не использующих антиперспиранты или дезодоранты [26].Также было обнаружено, что неприятный запах в подмышечной впадине взрослых обычно определяется характеристиками серы или прогорклого запаха от 3M3SH, 3M2H и HMHA, генерируемых в основном видами Corynebacterium [7, 9, 29]. Для сравнения, наше исследование показывает, что видов Corynebacterium менее многочисленны у детей и подростков, а видов Staphylococcus более многочисленны. Это различие может быть частично связано с тем, что микросреда подмышечной впадины у детей и подростков формируется эккринной секрецией.Хотя технические различия в профилировании метагенома также могут влиять на эти сравнения, мы отмечаем, что метагеномика дробовика и профилирование 16S рРНК показали хорошее соответствие в предыдущем исследовании [17]. Кроме того, в этом исследовании было обнаружено, что кислый запах чаще встречается у детей, и, соответственно, наш анализ подчеркнул центральную роль видов Staphylococcus в запахе тела у детей. Среди Staphylococcus видов, тогда как в большинстве более ранних исследований изучалась роль S.haemolyticus и S. hominis [5, 23], наша работа является первой, которая определяет роль S. epidermidis в возникновении неприятного запаха из подмышек у детей. Это имеет серьезные последствия с точки зрения мер по борьбе с неприятным запахом — в то время как основной подход для взрослых использует антиперспиранты для контроля образования неприятного запаха медленнорастущими видами Cornybacterium , противомикробные препараты могут быть более подходящими для быстрорастущих видов Staphylococcus у детей в качестве антиперспирантов. было замечено, что они относительно обогащают их [26].Кроме того, поскольку S. epidermidis является важным кожным комменсалом [30], могут потребоваться методы лечения следующего поколения, которые блокируют активность определенных ферментов, выявленных в этом исследовании.
Что касается влияния генетики хозяина на неприятный запах, несколько исследований описали ассоциацию аллелей ABCC11 с запахом тела у взрослых и показали, что люди, несущие аллели GG / GA, имеют усиленный запах из-за генерации 3M3SH, 3M2H, и HMHA из апокринового пота [15, 16, 31].Большинство населения Филиппин (от ~ 72 до 78%) имеет аллель GG / GA, и, следовательно, взрослые на Филиппинах более подвержены неприятному запаху с серными / прогорклыми характеристиками [15, 32]. У детей до полового созревания апокринные железы не полностью активированы [12], и, таким образом, прекурсоры эккринового происхождения могут играть более значительную роль в наблюдаемых характеристиках запаха. Апокринные железы сравнительно более активны у подростков, чей профиль неприятного запаха, как ожидается, будет более похож на профиль взрослых.Эти ожидания совпадают с нашими наблюдениями более высокой интенсивности запаха у подростков по сравнению с детьми и перехода к более серным характеристикам у подростков.
Наш биоинформатический анализ в этом исследовании еще раз высветил проблемы подхода «мешка генов» к изучению функции микробиома с метагеномными данными. Микробы обмениваются метаболитами контролируемым образом, и предположение, что несколько этапов метаболического процесса могут выполняться у разных видов в «метагеноме», не всегда может быть целесообразным [33, 34].Кроме того, ферменты разных видов, принадлежащие к одному и тому же классу ферментов, могут иметь очень разную эффективность и субстратную специфичность [35], например, объясняя, почему S. epidermidis ассоциировался с неприятным запахом из подмышек у детей, а S. hominis — нет. . Эта проблема проиллюстрирована недавним отчетом, показывающим, что метагеномные конвейеры могут выделять очень разные функциональные пути с использованием одного и того же набора данных [36]. Переход к анализу «мешка геномов» может обеспечить лучшую интерпретируемость наборов метагеномных данных, но существенным ограничением является возможность идентифицировать разные гены, принадлежащие одному и тому же геному.Усовершенствованные подходы к кластеризации и сборке, обеспеченные достижениями в технологии секвенирования, могут помочь устранить эти ограничения в будущем [37, 38].
Насколько нам известно, это первый отчет, в котором описаны таксоны, которые отрицательно коррелируют с неприятным запахом, но механизм их действия остается неясным. Эти ассоциации могут быть вызваны различными причинами, включая (а) производство соединений, которые маскируют неприятный запах или имеют более низкую интенсивность запаха (как предлагается здесь для P. avidum ), (б) микробная конкуренция или ингибирование, ведущее к уменьшению роста неприятного запаха; ассоциированные виды (как было описано между Malassezia и Staphylococcus видов [39]), и (c) метаболические процессы, которые приводят к тому, что ключевые предшественники запаха становятся недоступными для образования соединений неприятного запаха.Проведенные здесь культуральные эксперименты с человеческим потом предоставили уникальную основу для реалистичного моделирования доступности прекурсоров и подчеркнули вклад видов Staphylococcus в образование запаха. Дальнейшие эксперименты с консорциумами бактерий могут помочь изучить взаимодействия между ними и, таким образом, определить механизмы уменьшения неприятного запаха.
Материалы и методы
Дизайн клинического исследования
Для этого исследования были набраны две группы субъектов: (1) 15 детей, состоящих из 8 женщин и 7 мужчин, в возрасте от 5 до 9 лет и (2) 15 подростков, состоящих из 8 женщин. и 7 мужчин от 15 до 18 лет.В начале исследования (0 ч) испытуемым давали для душа стандартное кусковое мыло (без антимикробных активных веществ и отдушек). Через час после душа назначенный профессиональный парфюмер оценил интенсивность запаха (диапазон от 0 до 100) и характер в области подмышек, задней части шеи и кожи головы. Образцы микробиома были собраны сразу после этого для каждого участка путем снятия ленты (D100 D-squame, CuDerm). Каждую полоску ленты прикладывали десять раз к коже со стандартизованным давлением в течение 1 с и помещали в 1.Пробирка Эппендорфа 5 мл на льду. Затем испытуемые выполняли 4–5 часов интенсивных упражнений в среде с температурой 32 ° C и относительной влажностью 66%. Вкратце, испытуемые были разделены на группы, чтобы выполнять комбинацию физических нагрузок (беговая дорожка, езда на велосипеде в помещении, аэробика и баскетбол) поочередно под руководством профессионального инструктора. Физические нагрузки выполнялись с интервалом 10–15 мин с перерывом 10–15 мин. Во время перерыва были собраны образцы пота, и участники поддерживали водный баланс.В 8-часовой временной точке, интенсивность запаха, характер запаха и образцы микробиома были собраны снова, как описано выше (левая или правая подмышка выбирались случайным образом, но оставались неизменными по временным точкам). Испытуемые находились в среде без кондиционирования воздуха в течение 8 часов.
Обработка образцов и экстракция ДНК
Ленточные полоски переносили в пробирки Lysing Matrix E (MP Biomedicals) и добавляли 500 мкл буфера ATL (Qiagen). Образцы подвергали взбиванию шариками с помощью прибора FastPrep-24 (MP Biomedicals) на скорости 6.0 м / с в течение 40 с. Затем образцы центрифугировали при 16000 г в течение 5 минут, 200 мкл супернатанта обрабатывали 10 мкл протеиназы K (Qiagen) и инкубировали при 56 ° C в течение 15 минут. ДНК экстрагировали с помощью EZ1 Advanced XL Instrument (Qiagen) с набором EZ1 DNA Tissue Kit (Qiagen) с объемом элюции 100 мкл и количественно определяли с помощью набора Qubit dsDNA HS Assay Kit (Life Technologies), а затем хранили в морозильной камере — 20 ° C. .
Подготовка библиотеки, комбинаторное объединение и секвенирование
Стандартный объем экстрагированной ДНК в 50 мкл подвергали сдвигу с использованием Adaptive Focused Acoustics ™ (Covaris).Библиотеки ДНК получали с использованием основного набора Gene Read DNA Library I (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя, за исключением использования пользовательских адаптеров вместо набора адаптеров GeneRead I. Пользовательские индексные праймеры использовали для обогащения библиотек ДНК, которое выполняли в соответствии с протоколом обогащения, адаптированным из набора олигонуклеотидов для подготовки мультиплексных образцов (Illumina). Количественную оценку библиотек проводили с использованием Agilent Bioanalyzer, подготовленного с помощью набора Agilent High Sensitivity DNA Kit или Agilent DNA1000 Kit (Agilent Technologies).
Чтобы избежать пакетных эффектов, объединение библиотеки всего метагенома было выполнено комбинаторным способом (дополнительный файл 2: таблица S8). Что касается подмышек, образцы от детей и подростков были равномерно разделены на две партии подготовки библиотеки, причем каждая партия содержала равное количество детей, подростков, образцов с более сильным неприятным запахом и более слабым неприятным запахом. Библиотеки образцов от детей были затем объединены в эквимолярных количествах на одной полосе, а библиотеки образцов от подростков на другой дорожке.Для областей шеи и головы библиотеки были построены путем подготовки образцов от одного и того же объекта (1 час и 8 часов) один за другим, чередуя детей и подростков, а также образцов с более сильным неприятным запахом и более слабым неприятным запахом. Образцы с каждого сайта сбора были объединены в один пул. Парное секвенирование (считывание 2 × 101 п.н.) было выполнено на успешных библиотеках ДНК с использованием платформы Illumina HiSeq 2000.
Предварительная обработка чтения
После демультиплексирования чтения были отфильтрованы с помощью программного обеспечения Bcl2fastq (CASAVA version 1.8.4) от Illumina, и FastQC был выполнен для оставшихся чтений (Pass Filter Reads). Основания секвенирования с показателями качества ниже 30 были обрезаны с 5′- и 3′-концов каждого считывания, а считывания с длиной менее 30 нуклеотидов были удалены. Человеческие чтения были отфильтрованы путем сопоставления с человеческим геномом (GRCh48) с использованием BWA-MEM [40] (версия 0.7.13-r1126; параметры по умолчанию), оставив после себя 4,71 миллиарда нечеловеческих парных и одноэлементных считываний.
Таксономическая классификация
Таксономическое профилирование образцов было выполнено по всем таксономическим рангам с использованием MetaPhlAn2 [41] (версия 2.5.0; параметры по умолчанию). MetaPhlAn2 использует гены-маркеры клады, охватывающие бактериальные, архейные, вирусные и эукариотические микробы, для выполнения однозначных таксономических задач. Метагеном каждого образца анализировали независимо для вычисления относительной численности. Затем выходные файлы были объединены в единую таблицу с указанием относительной численности на образец (столбцы) и на микроб (строка). Таксоны со средней относительной численностью> 1% у детей или подростков были консервативно определены для каждого участка тела для дальнейшего статистического анализа.
Функциональное профилирование
HUMAnN2 [33] (v0.7.1; параметры по умолчанию) было запущено с базой данных белков UniRef90 для получения функциональных профилей для каждого метагенома. HUMAnN2 обеспечивает (i) численность каждого семейства ортологичных генов UnifRef, указанную в виде числа чтений на килобазу (RPK), (ii) численность путей MetaCyc в RPK и (iii) охват каждого пути MetaCyc, масштабируемое от 0 до 1. Ген Семьи и пути со средними значениями RPK> 10 по выборкам от детей или подростков были сохранены и были повторно нормализованы до относительной численности для последующего анализа ассоциации, в то время как путь MetaCyc рассматривался для дальнейшего статистического анализа только в том случае, если средний охват путей по всем образцам было> 0.3. В целом, мы идентифицировали 69 792, 65 939 и 45 684 уникальных семейства генов из метагеномов подмышек, шеи и головы, соответственно. Для путей MetaCyc существует 89 (подмышками), 103 (шея) и 83 (голова) путей, которые соответствуют указанным выше критериям. Процент считываний, назначенных семействам и путям генов, а также считываний без назначения можно найти в Дополнительном файле 2: Таблица S9. Вклад каждого таксона в семейство генов и путь также определяли на основе таксономического назначения каждого считывания из выходов HUMAnN2.Вклад в семейство генов был визуализирован путем сопоставления идентификаторов UniRef90 с идентификаторами ортологической группы KEGG в путях KEGG [42] (версия обновлена в феврале 2016 г.).
Статистический анализ
Многомерный анализ для оценки ассоциаций между интенсивностью запаха, возрастом и микробными сообществами до и после тренировки был выполнен с использованием подхода канонического анализа основных координат (с несходством Брея-Кертиса), реализованного в веганском R-пакете ( версия 2.4-3).Существенные связи между таксонами / функциями микробов и неприятным запахом были выявлены с помощью комбинации статистических тестов, в которых (i) коэффициент корреляции Спирмена между интенсивностью запаха и таксонами / функциями микробов использовался для поперечного анализа и (ii) ранговый критерий Вилкоксона для анализа численность до и после тренировки использовалась для продольного анализа. Значения p были скорректированы с использованием подхода Бенджамини-Хохберга, и все статистические анализы были выполнены в R.Для путей, которые считались обнаруженными, было проведено ассоциативное тестирование для молодежи, детей и подростков, чтобы выявить те, у которых скорректированные по FDR значения p <0,1, по крайней мере, в двух из шести сравнений в качестве возможных путей для дальнейшего анализа на уровне генов.
Выделение микробов из подмышечной области у субъектов
В этом исследовании микробы были собраны в асептических условиях путем мазка подмышечной области с использованием предварительно увлажненного (стерильного 0,15 M NaCl + 0.1% раствор Твин 20) тампоны из хлопка (Puritan Med). Образец мазка от субъекта с наивысшей интенсивностью запаха помещали на кровяной агар TSA (Thermo Fisher Scientific) и инкубировали при 37 ° C в течение ночи. Репрезентативные одиночные колонии на основе морфологии были отобраны и недавно субкультивированы для масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF (Bruker) для идентификации видов. Идентификация видов была дополнительно подтверждена секвенированием 16S рРНК (Charles River). Выбранные представляющие интерес бактерии ( Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus hominis, Cutibacterium acnes и Micrococcus luteus ) затем суспендировали в криогенных гранулах (Thermo Fisher Scientific) и хранили в морозильной камере — 80 ° C.
Сбор пота и эксперименты по культивированию
Человеческий пот собирали из области подмышек и шеи у нескольких человек в этом исследовании, используя 1,5 мл пробирки Эппендорфа, объединяли в стерильные 50 мл пробирки и хранили при 4 ° C. Затем смесь секрета пота стерилизовали центрифугированием 3000, г, × 10 мин и стерильными шприцевыми фильтрами с размером пор 0,2 мкм (Millipore). Бактериальные изоляты были свежеприготовлены в течение ночи и собраны на следующий день, когда OD 600 достигнет 1.0. После этого следовало центрифугирование при 3000 g в течение 10 мин, полученный осадок промывали стерильным 0,01 М фосфатным буфером (pH 6,0) и повторно суспендировали в 10 мл свободного от бактерий пула пота. Эти свежеприготовленные образцы пула бактерий и пота инкубировали в орбитальном шейкере в аэробных условиях при 120 об / мин, 37 ° C в течение 24 часов. Каждый эксперимент включал отрицательные контроли (10 мл стерилизованного фильтром пула пота без бактериальной инокуляции) в тех же условиях, что и выше. Все эксперименты проводились в аэробных условиях.
Аналитическое определение кислых предшественников и отдушек
Лейцин и изолейцин измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Вкратце, 0,2 мл образца вносили пипеткой в центрифужную пробирку на 15 мл. После этого добавляли 4,8 мл 0,05 н. Соляной кислоты и диспергировали образец с помощью вихревой мешалки. Полученный раствор фильтровали через шприц из ПВДФ 0,45 мкм и смешивали с 0,1 мл натрий-боратного буфера (pH 10,2) и 0,2 мл раствора NBD-F в 2-миллилитровом желтом флаконе для ВЭЖХ.После плотного закрытия крышки флакон нагревали в печи при 60 ° C в течение 5 минут, затем охлаждали перед добавлением 0,4 мл 0,05 н. Соляной кислоты и вводом в ВЭЖХ для анализа. Измерение глицерина проводилось с помощью GC-FID. Пять миллилитров пота лиофилизировали в течение ночи с последующим добавлением в пробирку 0,2 мл воды и 1,8 мл экстракционного растворителя. Затем образец фильтровали через шприц из ПВДФ 0,45 мкм в пробирку для ГХ для анализа.
Чтобы измерить уровень молочной кислоты в поту, сначала создайте калибровочную кривую, используя 0.0, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0 и 5,0 частей на миллион стандарта молочной кислоты были установлены путем мониторинга массы иона m / z89 в выбранном ионном режиме (SIM) в анализе ЖХ / МС (ABSciex 4000 QTRAP). Затем образцы пота разбавляли в 500 раз с использованием метанола / воды (1: 1) и вводили в систему ЖХ / МС для анализа, и из образцов получали площади пиков массового числа молочной кислоты (m / z89). . Уровни молочной кислоты определяли путем сравнения площадей пиков образцов и откликов калибровочной кривой.
pH собранной пробы пота (10 мл) доводили до 12,0 добавлением NaOH (Wako), и лиофилизацию проводили в течение 2 дней. После лиофилизации в каждую пробирку с остатками добавляли 1 мл HCl (50% разбавление 37% HCl) (Sigma) с последующим встряхиванием и центрифугированием при 4000 об / мин и 20 ° C в течение 20 минут. Полученный супернатант переносили в пробирку Эппендорфа, добавляли 150 мкл хлороформа (Sigma) с последующим встряхиванием и центрифугированием при 14800 об / мин и 4 ° C в течение 20 мин.Затем фракции хлороформа объединяли и 10 мкл объединенной среды вводили в прибор GCMS для анализа. Agilent GC 7890B / MSD 5977A (Agilent, Wilmington, DE, USA) с автосамплером Gerstel MPS2 -TDU-CIS4 (Gerstel, Германия) использовали для разделения и анализа соединений запаха тела. ГХ-МС был оснащен колонкой DB-Wax, 60 мм × 0,25 мм с толщиной пленки 0,25 мкм (Agilent, Делавэр, США). Использовался режим впрыска жидкости большого объема — начальная температура инжектора была на уровне 10 ° C, уравновешенная на 0.В течение 5 минут использовали линейное изменение скорости 12 ° C / мин до конечной температуры 220 ° C, затем выдерживали в течение 5 минут. Объем инъекции составлял 10 мкл. Температуру печи поддерживали на уровне 40 ° C в течение 2 минут, повышали до 220 ° C со скоростью 3 ° C / мин и выдерживали в течение 4 минут. Расход газа-носителя гелия был постоянным и составлял 1,2 мл / мин. Масс-спектрометр работал при энергии ионизации 70 эВ со скоростью четыре сканирования / с в диапазоне м / z 29–450 и температуре источника ионов 230 ° C. Идентификацию структур / соединений проводили с использованием библиотеки Национального института стандартов и технологий (NIST’11) и внутренней библиотеки P&G MS с коммерчески доступными стандартами.ГХ-ольфактометрия выполнялась при первом запуске. Обонятельные измерения проводились тем же профессиональным парфюмером, который оценивал характеристики и интенсивность запаха у участников этого исследования.
Дополнительные файлы
Дополнительные файлы 2: (92K, zip)Таблица S2. Оценка запаха и данные метагеномного секвенирования для всех образцов в этом исследовании. Таблица S5. GC-ольфактометрия пота, взятого у детей и подростков. Таблица S6. Обнаруженные пути MetaCyc, которые, как было установлено, связаны с неприятным запахом, на основании значений обилия путей из HUMAnN2.Для области головы значимой ассоциации не обнаружено. Таблица S7. Ключевые пути, связанные с производством неприятного запаха, и их таксономические факторы. Таблица S8. Информация о том, как образцы были распределены в партиях для подготовки библиотеки и секвенирования, чтобы избежать эффекта партии. Таблица S9. Считывает сопоставленные (%) семейств генов UniRef90 и пути MetaCyc. (ZIP 92 кб)
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Серену Хейз и Сару Аршад за помощь в проверке содержания рукописи.
Финансирование
Эта работа финансировалась грантом SPF для сотрудничества A * STAR-P&G (APG2013 / 032). Финансовая поддержка компании Procter & Gamble, Цинциннати, Огайо, была использована для разработки и проведения части исследования.
Сокращения
3M2H | 3-метил-2-гексеновая кислота |
3M3SH | 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-гексанол 3-метил-4-гексановая кислота |
HPLC | Высокоэффективная жидкостная хроматография |
LC / GCMS | Жидкостная хроматография и газовая хроматография-масс-спектрометрия |
Вклад авторов
YL, DS, PLN, JL, DS, PLN и задумал это исследование.PB, AHQN и DS участвовали в метагеномном секвенировании. PH, JT, RK, TMUT, JL и MO участвовали в культивировании и масс-спектрометрическом анализе. THL и DV проанализировали метагеномные данные под наблюдением PL и NN. THL и NN написали рукопись при участии всех авторов. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.
Примечания
Утверждение этических норм и согласие на участие
Исследование было проведено, и все образцы были собраны PRICEPTS Inc. (PRICE Product Testing Services Incorporated) в Маниле с одобрения Институционального обзора Сингапурского инновационного центра Procter & Gamble (Сингапур) Правления и в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (поправка 1996 г.).Руководства ICH по надлежащей клинической практике (GCP) были соблюдены, и добровольное информированное согласие было предоставлено с одобрения Совета по этике исследований P&G. Это клиническое исследование соответствовало руководящим принципам STROBE для наблюдательных исследований на людях. Матери, которые согласились принять участие в исследовании своих детей, подписали форму информированного согласия, а подростки, которые согласились участвовать, подписали форму согласия.
Согласие на публикацию
Не применимо.
Конкурирующие интересы
Несколько соавторов (Л.Y. D.S. P.L. J.L. P.B. P.H. J.T. R.K. T.T. M.O.) участвовал и / или проводил это исследование, будучи сотрудником компании Procter & Gamble. Эти соавторы могут владеть акциями компании, но прямой финансовой выгоды или убытков от публикации этой рукописи не ожидается. Согласно требованиям трудовых обязательств компании Procter & Gamble по соблюдению конфиденциальности, эти соавторы не могут заявлять о патентной деятельности.
Примечание издателя
Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и принадлежностей организаций.
Информация для авторов
Цзе Хау Лам, электронная почта: [email protected].
Давиде Верзотто, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@dottozrev.
Пурбита Брахма, электронная почта: [email protected].
Аманда Хуэй Ци Нг, электронная почта: [email protected].
Пин Ху, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@aqhgn.
Дэн Шнелл, электронная почта: [email protected].
Джей Тисман, электронная почта: [email protected].
Ронг Конг, электронная почта: [email protected].
Thi My Uyen Ton, электронная почта: [email protected].
Цзяньцзюнь Ли, электронная почта: [email protected].
May Ong, электронная почта: [email protected].
Ян Лу, электронная почта: [email protected].
Дэвид Суэйл, электронная почта: [email protected].
Пинг Лю, электронная почта: [email protected].
Цзицюань Лю, электронная почта: [email protected].
Ниранджан Нагараджан, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@nnajaragan.
Ссылки
1. Такахаши Л.К., Накашима Б.Р., Хонг Х., Ватанабэ К. Запах опасности: поведенческий и нейронный анализ страха, вызванного запахом хищника.Neurosci Biobehav Rev.2005; 29: 1157–1167. DOI: 10.1016 / j.neubiorev.2005.04.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Стокли П., Боттелл Л., Херст Дж. Л. Проснитесь и почувствуйте конфликт: запаховые сигналы в соревнованиях женщин. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2013; 368: 20130082. DOI: 10.1098 / rstb.2013.0082. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Киёкава Ю. Социальные запахи: феромоны тревоги и социальная буферизация. Curr Top Behav Neurosci. 2017; 30: 47–65. DOI: 10.1007 / 7854_2015_406. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4.Портер Р. Х., Чернох Дж. М., Балог Р. Д.. Сигнатуры запаха и распознавание родства. Physiol Behav. 1985; 34: 445–448. DOI: 10.1016 / 0031-9384 (85)-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Боудон Дэниел, Кокс Диана С., Эшфорд Дэвид, Джеймс А. Гордон, Томас Гэвин Х. Идентификация подмышечного стафилококка. участвует в производстве зловонного тиоспирта 3-метил-3-суфанилгексан-1-ола. Письма о микробиологии FEMS. 2015; 362 (16): fnv111. DOI: 10.1093 / femsle / fnv111. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Джеймс А.Г., Остин С.Дж., Кокс Д.С., Тейлор Д., Калверт Р.Микробиологическое и биохимическое происхождение запаха из подмышек человека. FEMS Microbiol Ecol. 2013; 83: 527–540. DOI: 10.1111 / 1574-6941.12054. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Fredrich E, Barzantny H, Brune I, Tauch A. Ежедневная борьба с запахом тела: в сторону активности подмышечной микробиоты. Trends Microbiol. 2013; 21: 305–312. DOI: 10.1016 / j.tim.2013.03.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Бек ХК, Хансен AM, Лауритсен FR. Катаболизм лейцина в жирные кислоты с разветвленной цепью у Staphylococcus xylosus.J Appl Microbiol. 2004. 96: 1185–1193. DOI: 10.1111 / j.1365-2672.2004.02253.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Troccaz M, et al. Картирование подмышечной микробиоты, ответственной за запах тела, с использованием независимого от культуры подхода. Микробиом. 2015; 3: 3. DOI: 10.1186 / s40168-014-0064-3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Джеймс А.Г., Хилиандс Д., Джонстон Х. Генерация летучих жирных кислот подмышечными бактериями. Int J Cosmet Sci. 2004. 26: 149–156. DOI: 10.1111 / j.1467-2494.2004.00214.Икс. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Лу К., Фукс Э. Предшественники потовых желез в развитии, гомеостазе и заживлении ран. Перспективы Колд-Спринг-Харбор в медицине. 2014; 4 (2): a015222 – a015222. DOI: 10.1101 / cshperspect.a015222. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Вилке К., Мартин А., Терстеген Л., Биль СС. Краткая история биологии потовых желез. Int J Cosmet Sci. 2007. 29: 169–179. DOI: 10.1111 / j.1467-2494.2007.00387.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Тибуто Д.Регулирование работы сальных желез человека. J Invest Dermatol. 2004; 123: 1–12. DOI: 10.1111 / j.1523-1747.2004.t01-2-.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Harker M, et al. Функциональная характеристика SNP в аллеле ABCC11 — влияние на метаболизм кожи в подмышечных впадинах, формирование запаха и связанное с ним поведение. J Dermatol Sci. 2014; 73: 23–30. DOI: 10.1016 / j.jdermsci.2013.08.016. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Мартин А. и др. Функциональный аллель ABCC11 играет важную роль в биохимическом формировании запаха из подмышечных впадин человека.J Invest Dermatol. 2010; 130: 529–540. DOI: 10.1038 / jid.2009.254. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Chng KR, et al. Профилирование всего метагенома выявляет зависимую от микробиома кожи восприимчивость к обострению атопического дерматита. Nat Microbiol. 2016; 1: 16106. DOI: 10.1038 / nmicrobiol.2016.106. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Чибани-Ченнуфи С., Бруттин А., Диллманн М.Л., Брюссоу Х. Взаимодействие фага-хозяина: экологическая перспектива. J Bacteriol. 2004. 186: 3677–3686. DOI: 10.1128 / JB.186.12.3677-3686.2004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Шу М. и др. Ферментация Propionibacterium acnes, комменсальной бактерии в микробиоме кожи человека, в качестве кожных пробиотиков против метициллин-резистентных
Staphylococcus aureus . ПлоС один. 2013; 8: e55380. DOI: 10.1371 / journal.pone.0055380. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Christensen GJ, et al. Антагонизм между Staphylococcus epidermidis и Propionibacterium acnes и его геномная основа.BMC genomics. 2016; 17: 152. DOI: 10.1186 / s12864-016-2489-5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Natsch A, Gfeller H, Gygax P, Schmid J, Acuna G. Специфическая бактериальная аминоацилаза расщепляет предшественники одоранта, секретируемые в подмышечной впадине человека. J Biol Chem. 2003; 278: 5718–5727. DOI: 10.1074 / jbc.M210142200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Эмтер Р., Натч А. Последовательное действие дипептидазы и бета-лиазы требуется для высвобождения одоранта человеческого тела 3-метил-3-сульфанилгексан-1-ола из секретируемого конъюгата Cys-Gly- (S) посредством Коринебактерии.J Biol Chem. 2008; 283: 20645–20652. DOI: 10.1074 / jbc.M800730200. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Ионеску Г., Константиниу С. Биология рода Acinetobacter. Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol. 2004. 49: 157–174. [PubMed] [Google Scholar] 26. Урбан Дж. И др. Влияние привычного и экспериментального использования антиперспирантов и дезодорантов на микробиом подмышек. PeerJ. 2016; 4: e1605. DOI: 10.7717 / peerj.1605. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Callewaert C, et al.Характеристика скоплений стафилококков и коринебактерий в подмышечной области человека. ПлоС один. 2013; 8: e70538. DOI: 10.1371 / journal.pone.0070538. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 28. Совет Сара Э., Сэвидж Эми М., Урбан Джули М., Элерс Меган Э., Скин Дж. Х. Пейт, Платт Майкл Л., Данн Роберт Р., Хорват Джули Э. Разнообразие и эволюция микробиома кожи приматов. Труды Королевского общества B: биологические науки. 2016; 283 (1822): 20152586. DOI: 10.1098 / РСПБ.2015.2586. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Troccaz M, et al. Гендерные различия между концентрациями нелетучих (R) / (S) -3-метил-3-сульфанилгексан-1-Ol и (R) / (S) -3-гидрокси-3-метил-гексановой кислоты предшественников запаха в подмышечные выделения. Chem Senses. 2009; 34: 203–210. DOI: 10.1093 / chemse / bjn076. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Прокоп-Пригге К.А., Грин К., Варалло Л., Высоцкий К.Дж., Прети Г. Влияние этнической принадлежности на производство одоранта в подмышечных впадинах человека.J Chem Ecol. 2016; 42: 33–39. DOI: 10.1007 / s10886-015-0657-8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 32. Йошиура К. и др. SNP в гене ABCC11 является детерминантом типа ушной серы человека. Нат Жене. 2006. 38: 324–330. DOI: 10,1038 / нг1733. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33. Abubucker S, et al. Метаболическая реконструкция метагеномных данных и ее применение к микробиому человека. PLoS Comput Biol. 2012; 8: e1002358. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1002358. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34.van der Ark KCH, van Heck RGA, Martins Dos Santos VAP, Belzer C, de Vos WM. Больше, чем просто интуиция: основанные на ограничениях метаболические модели в масштабе генома для прогнозирования функций кишечных микробов человека. Микробиом. 2017; 5: 78. DOI: 10.1186 / s40168-017-0299-х. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Тилинг Х, Глокнер Ф. Текущие возможности и проблемы в анализе микробного метагенома — биоинформатическая перспектива. Краткий биоинформ. 2012; 13: 728–742. DOI: 10,1093 / bib / bbs039.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Франк Дж. А. и др. Улучшенные сборки метагеномов и таксономическое объединение с использованием данных длинных циклических согласованных последовательностей. Научный доклад 2016; 6: 25373. DOI: 10,1038 / srep25373. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 40. Ли Х, Дурбин Р. Быстрое и точное согласование короткого чтения с преобразованием Барроуза-Уиллера. Биоинформатика. 2009; 25: 1754–1760. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btp324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 42.Kanehisa M, Sato Y, Kawashima M, Furumichi M, Tanabe M. KEGG как справочный ресурс для аннотации генов и белков. Nucleic Acids Res. 2016; 44: D457 – D462. DOI: 10.1093 / нар / gkv1070. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]Понимание микробной основы запаха тела у детей и подростков до полового созревания
Microbiome. 2018; 6: 213.
, 1 , 2 , 1 , 2 , 3 , 3 , 3 , 1 , 1 , 4 , 1 , 1 , 4 , 1 , 1 и 2, 5Tze Hau Lam
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Сингапур, 13854741 Давид Верзот
2 Вычислительная и системная биология, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
Purbita Brahma
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Amanda Hui Qi Ngutational
2 Computing и системной биологии, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
Ping Hu
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Dan Schnell 9 0041
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Jay Tiesman
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Rong Kong
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Singapore, 138547 Singapore
Thi My Uyen Ton
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Singapore, 138547 Singapore
Jianjun Li
4 Procter & Gamble Sharon Woods Innovation Center, Sharonville, OH 45241 США
May Ong
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Ян Лу
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Дэвид Свайл
4 0002 9000 Procter & Gamble Центр инноваций Шэрон Вудс, Шаронвилл, Огайо 45241 СШАПинг Лю
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Цзицюань Лю
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Ниранджан Нагараджан
2 Институт вычислительной и системной биологии of Singapore, Singapore, 138672 Singapore
5 Медицинская школа Yong Loo Lin, Национальный университет Сингапура, Сингапур, 119228 Сингапур
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
2 Вычислительный и системной биологии, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
4 Procter & Gamble Sharon Woods Innovation Center, Sharonville, OH 45241 USA
5 Медицинский факультет Юн Лу Линя, Национальный университет Сингапур, Сингапур, 119228 Сингапур
Автор, ответственный за переписку.Поступило 28.05.2018 г .; Принято 2 ноября 2018 г.
Открытый доступ Эта статья распространяется в соответствии с условиями Международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы должным образом укажете автора (авторов) и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения. Отказ от лицензии Creative Commons Public Domain Dedication (http: // creativecommons.org / publicdomain / zero / 1.0 /) применяется к данным, представленным в этой статье, если не указано иное. Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.- Дополнительные материалы
Дополнительный файл 1: Рисунки S1-S10 , Таблицы S1, S3 и S4 . (PDF 3276 кб)
GUID: 4D6F7D72-9FB1-448F-A881-A5C17FD171DD
Дополнительный файл 2: Таблица S2. Оценка запаха и данные метагеномного секвенирования для всех образцов в этом исследовании. Таблица S5. GC-ольфактометрия пота, взятого у детей и подростков. Таблица S6. Обнаруженные пути MetaCyc, которые, как было установлено, связаны с неприятным запахом, на основании значений обилия путей из HUMAnN2. Для области головы значимой ассоциации не обнаружено. Таблица S7. Ключевые пути, связанные с производством неприятного запаха, и их таксономические факторы. Таблица S8. Информация о том, как образцы были распределены в партиях для подготовки библиотеки и секвенирования, чтобы избежать эффекта партии. Таблица S9. Считывает сопоставленные (%) семейств генов UniRef90 и пути MetaCyc. (ZIP, 92 кб)
GUID: 36CA9ED0-CC48-4DB0-8510-8A2BEB1497C8
- Заявление о доступности данных
Наборы данных, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны в Европейском архиве нуклеотидов в рамках проекта id ERP1084 https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB26427).
Аннотация
Предпосылки
Несмотря на то, что человеческий пот не имеет запаха, считается, что рост бактерий и разложение определенных предшественников запаха в нем вызывает запах тела у людей.Хотя механизмы образования запаха широко изучены у взрослых, мало что известно о подростках и детях, не достигших полового созревания, у которых состав пота отличается от незрелых апокринных и сальных желез, но, возможно, они более восприимчивы к социальному и психологическому воздействию неприятного запаха.
Результаты
Мы интегрировали информацию из анализа всего микробиома нескольких участков кожи (подмышки, шея и голова) и нескольких временных точек (1 час и 8 часов после ванны), проанализировав в общей сложности 180 образцов для проведения самого большого метагенома. проведенное ассоциацией исследование неприятного запаха.Значительные положительные корреляции наблюдались между интенсивностью запаха и относительной численностью Staphylococcus hominis , Staphylococcus epidermidis и Cutibacterium avidum , а также отрицательная корреляция с видами Acinetobacter schindleri и Cutibacterium. Анализ метаболических путей выявил связь продукции изовалериановой и уксусной кислот (кислый запах) из обогащенных S. epidermidis (подростковая подмышечная область) и S.hominis (детская шея) и продукция серы из Staphylococcus видов (подмышечная впадина подростка) с интенсивностью запаха, что хорошо согласуется с наблюдаемыми характеристиками запаха у детей и подростков в предпубертатном возрасте. Эксперименты с культурами человеческого и искусственного пота подтвердили способность S. hominis и S. epidermidis независимо производить неприятный запах с отчетливыми характеристиками запаха.
Выводы
Эти результаты демонстрируют возможности метагеномики кожи для изучения ко-метаболических взаимодействий между хозяином и микробами, выявления различных путей образования запаха от пота у детей и подростков в предполовозрелом возрасте и выделения ключевых ферментативных мишеней для вмешательства.
Электронные дополнительные материалы
Онлайн-версия этой статьи (10.1186 / s40168-018-0588-z) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.
Введение
Запах тела в животном мире часто играет важную роль в защите от хищников и выживании [1–3]. Считается, что у людей обонятельные сигналы играют роль в обнаружении родства и выборе партнера [4]. Несмотря на эти функции, запах тела, как правило, вызывает сильную социальную стигматизацию, а его социальное и психологическое воздействие на затронутых субъектов до конца не изучено.
Считается, что запах тела у людей в первую очередь опосредован бактериальным разложением естественно секретируемых, не пахнущих компонентов пота, особенно жирных кислот, алифатических аминокислот с разветвленной цепью, глицерина и молочной кислоты, происходящих из эккринных, апокринных и сальных желез. железы [5–8]. В исследованиях у взрослых с использованием секвенирования маркерных генов (16S рРНК) и других подходов, ряд бактерий, но в первую очередь видов Corynebacterium , были связаны с неприятным запахом [6, 9, 10].Кроме того, определенные бактериальные ферменты и пути, которые воздействуют на непахучие белковые предшественники или продуцируют молекулы запаха, такие как уксусная кислота, летучие жирные кислоты, сульфанилы и тиоспирты, также были идентифицированы с использованием подходов, основанных на культуре [5-7, 10, 11] . Однако существуют значительные различия между физиологией, связанной с запахом, и микробиотой кожи взрослых и не взрослых. Например, апокриновые железы (в основном находящиеся в местах тела с волосяными фолликулами, например, в подмышечной впадине) неактивны до тех пор, пока не будут стимулированы гормональными изменениями в период полового созревания, и в отличие от эккринных желез, которые секретируют непрерывно, апокриновые железы секретируют периодически [12].Эккриновый пот (прозрачный, без запаха, pH 4,0–6,8, на 98–99% состоит из воды, но также содержащий хлорид натрия, жирные кислоты, молочную кислоту, лимонную кислоту, аскорбиновую кислоту, мочевину и мочевую кислоту) и апокриновый пот (без запаха, pH 6,0–7,5, содержащие воду, белки, углеводы, липиды и стероиды) имеют различный состав и распределение (все участки тела против внутренних волосяных фолликулов) [13]. Кроме того, сальные железы, которые выделяют маслянистое вещество без запаха, называемое кожным салом, в волосяные фолликулы (pH 4,5–5,5), имеют повышенную активность в период полового созревания [14].Таким образом, запах тела обычно считается значимым только у лиц, достигших полового созревания, и у взрослых, и в основном он изучался в области подмышечной впадины, где количество апокринных желез превышает количество эккринных желез в 10 раз.
Большинство исследований неприятного запаха проводилось в умеренном климате и на субъектах из Европы и Северной Америки. Считается, что азиаты, особенно выходцы из Восточной Азии, генетически предрасположены к уменьшению неприятного запаха [15, 16]. Однако жаркая и влажная тропическая среда может увеличить выделение потоотделения и связанное с этим возникновение неприятного запаха.Основываясь на обширных исследованиях в контексте Юго-Восточной Азии, мы определили, что запах тела действительно является серьезной проблемой для детей и подростков, не достигших полового созревания, как с точки зрения оценок родителей, так и с точки зрения экспертных оценок (дополнительный файл 1: таблица S1). Влияние неприятного запаха в детстве на эмоциональное, социальное и психологическое благополучие субъектов является неизведанной областью, но, вероятно, вызывает большее беспокойство, чем неприятный запах взрослых. Более того, поскольку секреция апокринных желез у детей неактивна, метаболические взаимодействия между хозяином и микробами, которые приводят к неприятному запаху, остаются невыясненными.
Для решения этой темы мы набрали когорту детей и подростков до полового созревания на Филиппинах, которые были оценены профессиональным парфюмером на предмет определения интенсивности запаха (диапазон 0–100) и характера (например, сладкого, жирного, прогорклого, кислого и т. hircine, сера), в дополнение к оценке их родителей (дополнительный файл 2: таблица S2). В план исследования входили отбор образцов из нескольких участков тела (шея, подмышки, голова), связанных с запахом тела, а также из нескольких временных точек после ванны и активного отдыха, чтобы систематически понять микробную основу запаха тела у этих людей.В общей сложности 180 образцов были подвергнуты глубокому анализу секвенирования всего метагенома, что позволило нам изучить членов бактериального, вирусного и эукариотического сообществ и их функциональную связь с неприятным запахом. Мультимодальный анализ, сочетающий регрессию к интенсивности запаха и дифференциальные сигнатуры до и после активного отдыха, использовался для выявления таксонов и функций микробов, связанных с неприятным запахом у детей (5–9 лет) и подростков (15–18 лет). Эти подписи частично перекрываются (например, S.hominis ), но также отличные от того, что было зарегистрировано во взрослых когортах. В целом, наше исследование подчеркивает важность перехода от «мешка генов» к анализу метагеномов «мешка геномов» для всестороннего изучения метаболических взаимодействий между хозяином и микробами.
Результаты
Отчетливая интенсивность запаха и характеристики, связанные с различными частями тела у детей и подростков
Наше исследование было основано на двух разных возрастных группах лиц: дети предпубертатного возраста (5–9 лет) и подростки (15–18 лет). лет), что позволяет более детально изучить микробную основу неприятного запаха на ранних этапах жизни (см. раздел «Материалы и методы», рис.a, Дополнительный файл 2: Таблица S2). В то время как подмышечная впадина (подмышечная впадина) была основным местом исследования неприятного запаха, исследования потребителей показали, что неприятный запах из области шеи (затылка) и головы (средняя часть волосистой части головы) также является областью, вызывающей беспокойство у семей, и поэтому были включены в это исследование ( Дополнительный файл 1: Таблица S1). Субъекты оценивались в двух временных точках, разделенных 7 часами отдыха и упражнений для образования потоотделения, что обеспечивало хорошо подходящую экспериментальную установку для учета вариабельности между хозяевами и исследования того, как микробы превращают предшественники пота в неприятный запах (рис.а). Кроме того, первая временная точка была сделана через 1 час после душа, что обеспечило стандартизованный исходный уровень для всех людей. Образцы были взяты в тот же день и в тот же день на Филиппинах (Манила) при относительно постоянной температуре окружающей среды 32 ° C и влажности 66%.
Дизайн исследования и взаимосвязь между интенсивностью запаха, характеристиками запаха, возрастом и участками тела. a Схема с подробным описанием целевых групп исследования, номеров образцов и точек времени сбора. b Распределение интенсивности запаха по участкам тела до (1 ч) и после (8 ч) упражнений и по возрастным группам (дети и подростки; ** p -значение <0.05, * p -значение <0,1). c Линии тренда, показывающие взаимосвязь между различными характеристиками запаха и интенсивностью запаха на разных участках тела (1 = присутствует, 0 = отсутствует). d Относительное распределение кислого запаха и запаха серы у субъектов до (1 ч) и после (8 ч) упражнений по возрастным группам и участкам тела. Точками отмечена интенсивность запаха, как показано на левой оси, в то время как гистограммы показывают количество субъектов, как показано на правой оси
В дополнение к группам запахов, оцененным родителями (дополнительный файл 2: таблица S2), запах оценивался одним профессиональным парфюмером. интенсивность и характер во всех предметах, местах и во все моменты времени.Как и ожидалось, интенсивность запаха, измеренная профессиональным парфюмером, была значительно выше в подмышках у детей и подростков после физических упражнений (тест Вилкоксона p — значение <0,05) (рис. B). Незначительное увеличение интенсивности запаха было также обнаружено в области шеи и головы у подростков и детей, соответственно (критерий Вилкоксона p — значение <0,1). У подростков раньше была более высокая интенсивность запаха, чем у детей в подмышечной области (тест Вилкоксона , p -значение = 2.4 × 10 — 4 ) и после (тест Вилкоксона p -значение = 2,6 × 10 — 4 ) упражнений, и в целом интенсивность запаха была ниже в области шеи и головы по сравнению с областью подмышек. Что касается характеристик запаха, то в области подмышек и шеи наблюдались кислые запахи и запахи серы со средней и высокой интенсивностью запаха, соответственно (рис. C). Напротив, область головы в первую очередь характеризовалась жирным запахом, подчеркивая, что разные области тела, вероятно, имеют разный микробный метаболизм, способствующий возникновению неприятного запаха.Анализ характеристик запаха по возрастным группам и временным точкам показал, что, в то время как дети в первую очередь определяются характеристиками запаха кислого или кислого + серы, подростки с большей вероятностью будут иметь характеристику кислый + сера, которая смещается к доминирующей характеристике серы после упражнений (рис. D). . Однако это свойство, по-видимому, характерно для подмышек, а в области шеи и головы как у детей, так и у подростков преобладает кислый запах (рис. D). Эти наблюдения обеспечивают важный фон для нашего анализа микробного вклада в неприятный запах в следующих разделах.
Особенности микробиома кожи в разных возрастных группах и в связи с неприятным запахом
Для изучения таксономического и функционального состава микробиома кожи в нашей когорте образцы были собраны с использованием недавно установленного протокола снятия ленты [17], обеспечивающего достаточное количество ДНК для построения метагеномные библиотеки дробовика для 100% наших образцов и ни одного из контрольных образцов (коллекционные и лабораторные контроли). Глубокое секвенирование на платформе Illumina было использовано для характеристики образцов микробиома кожи для всех людей, участков и временных точек (180 образцов, ~ 69 миллионов считываний в среднем; дополнительный файл 2: таблица S2).В среднем чтения были высокого качества (> Q30), при этом более 98% чтений можно было использовать после качественной фильтрации (дополнительный файл 2: таблица S2). Используя метагеномные данные для перекрестного анализа царств, мы отметили, что разные участки тела демонстрировали различное распределение уровней царства (дополнительный файл 1: рисунок S1). Бактерии в большей степени присутствовали в образцах подмышек (тест Вилкоксона p — значение <3 × 10 — 4 ), в то время как эукариоты были сравнительно более многочисленными на детских головах (тест Вилкоксона p — значение <2 × 10 — 9 ), а образцы шеи имели уникально более высокую относительную долю вирусов (тест Вилкоксона p — значение <7 × 10 — 3 ).Повышенное количество вирусов и эукариот в областях головы и шеи аналогично тому, что наблюдалось в близлежащих участках (ретроаурикулярная складка, затылок) у взрослых, что свидетельствует об уникальных нишах, которые они предлагают [18].
Определенные сигнатуры микробиома появились для каждого участка тела на уровне видов и рода бактерий (дополнительный файл 1: рисунки S2, S3), несмотря на наличие явных различий между микробиомами подростков и детей (рисунок а, дополнительный файл 1: Рисунок S4).Например, Staphylococcus hominis является наиболее распространенным видом бактерий в подмышечной области, несмотря на заметные различия между детьми и подростками (70% против 37%; тест Вилкоксона p -значение <5 × 10 — 4 ). Точно так же, хотя повышенное присутствие M. globosa и C. acnes отличает шею и голову от подмышек, у детей на голове относительно больше M. globosa , тогда как у подростков преобладают C.acnes (рис. а, дополнительный файл 1: рис. S3, S4). Эти различия коррелируют с изменениями активности апокринных желез в период полового созревания и могут служить основой для различий в характеристиках неприятного запаха между детьми и подростками. Кроме того, у всех субъектов было гораздо меньшее количество видов Corynebacterium в подмышечных впадинах, чем то, что наблюдалось у взрослых [9], что позволяет предположить, что отдельные виды могут играть роль в неприятном запахе в этих возрастных группах.
Связь между микробиомом кожи, интенсивностью запаха, возрастом и временем отбора проб. a Относительная численность кожных микробов (> 0,1%) на разных участках на уровне родов и видов. Данные представлены как средняя относительная численность внутри группы. b Диаграммы распределения для канонического анализа основных координат (CAP), иллюстрирующие силу связи между интенсивностью запаха, возрастом, временем отбора проб и микробиомом кожи. Анализ CAP основан на несходстве Брея-Кертиса. Размер каждой точки представляет собой оценку относительной интенсивности запаха в каждом образце, а число, перекрывающее каждую точку, указывает образцы, собранные до (1) или после (8) упражнения
Канонический анализ основных координат изменения микробиома кожи на разных участках тела в отношение к возрастной группе, полу и временным точкам (1 час или 8 часов) дополнительно иллюстрирует силу связи между интенсивностью запаха, возрастом, временем отбора проб и микробиомом кожи (рис.б). В подмышечной области конкретные возрастные группы и время отбора образцов хорошо коррелируют с интенсивностью запаха (значение p <0,001) и в меньшей степени с полом (значение p <0,05) в зависимости от состава микробиома кожи. Этот образец также наблюдается на шее, но не имеет значения на голове, где существует более сильная связь с полом (дополнительный файл 1: рисунок S5). Состав микробиома в области головы также уникален тем, что не кажется, что он заметно меняется после тренировки.Одна из возможностей для этого - ограниченное воздействие душа на микробиом кожи головы по сравнению с другими участками, поскольку микробы, находящиеся в волосяном фолликуле, делают микробиом кожи головы более стабильным и эластичным.
Виды Staphylococcus сильно коррелируют с интенсивностью запаха у детей и подростковМы отметили, что дети, принадлежащие к определенным родителями категориям («неприятный запах» и «без неприятного запаха»), не демонстрировали существенно различающуюся интенсивность запаха, как это определено профессиональным парфюмером. , по возрастным группам и временным точкам (Дополнительный файл 1: Рисунок S6), потенциально подчеркивая проблемы, связанные с тем, чтобы при таком анализе полагаться исключительно на восприятие потребителей.Однако группы «неприятного запаха» действительно показали тенденцию к более высокой интенсивности запаха, и эта разница может достигать статистической значимости при больших размерах выборки. Вместо проведения категориального анализа в этом исследовании мы искали таксоны и функции микробов, которые напрямую связаны с определяемой парфюмером интенсивностью запаха (см. Раздел «Материалы и методы»). Кроме того, доступность данных из двух временных точек, до и после тренировки, в дальнейшем использовалась для определения таксонов и функций микробов, которые изменяются в долгосрочном плане в связи с повышенным выделением пота и запаха (см. Раздел «Материалы и методы», Дополнительный файл 1: Рисунок S7, таблица).
Таблица 1
Список микробов на уровне видов, которые показывают значительную корреляцию с интенсивностью запаха, по крайней мере, в одной возрастной группе
Виды | Молодежь | Дети | Подростки | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Спирмена 18 4 902 Wilcoxon | Spearman’s ρ | Wilcoxon | Spearman’s ρ | Wilcoxon | | |||||||
ρ | p -значение | p -значение | ρ | p -значение | p -значение | ρ | p -значение | p -значение | ||||
Подмышки | ||||||||||||
Staphylococcus epidermidis | 0.67 | 5 × 10 −7 | ↑ | 0,04 | 0,44 | н.у. | ↑ | н.у. | 0,40 | н.у. | ↑ | н.у. |
Cutibacterium avidum | 0,63 | 5 × 10 −6 | ↑ | н.у. | 0,52 | н.у. | ↑ | н.у. | 0,31 | н.у. | ↑ | н.у. |
Corynebacterium pseudogenitalium | 0.44 | 10 −2 | ↓ | н.у. | 0,42 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,13 | н.у. | ↑ | н.у. |
Corynebacterium tuberculostearicum | 0,38 | 0,06 | ↓ | н.у. | 0,35 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,18 | н.у. | ↑ | н.у. |
Malassezia globosa | 0.53 | 7 × 10 −4 | ↓ | н.у. | 0,37 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,33 | н.у. | ↑ | н.у. |
Шея | ||||||||||||
Staphylococcus hominis | 0,32 | n.s. | ↑ | н.у. | 0,65 | 10 −2 | ↑ | н.у. | 0,09 | н.у. | ↑ | н.с. |
Staphylococcus phage StB27 | 0,49 | 0,02 | ↑ | n.s. | 0,77 | 10 −4 | ↑ | н.у. | 0,19 | н.у. | ↑ | н.у. |
Cutibacterium granulosum | — 0,45 | 0,03 | ↓ | 0,06 | — 0,48 | н.у. | ↓ | н.у. | — 0,38 | н.у. | ↓ | н.у. |
Acinetobacter schindleri | — 0,43 | 0,03 | ↓ | 0,07 | — 0,47 | н.у. | ↓ | н.у. | — 0,30 | н.у. | ↓ | н.у. |
Cutibacterium acnes | — 0,28 | n.s. | ↓ | н.у. | — 0.54 | 0,08 | ↓ | н.у. | — 0,21 | н.у. | ↓ | н.у. |
В целом, между поперечным и продольным анализом наблюдались устойчивые тенденции, где таксоны, которые были положительно коррелированы с неприятным запахом, также увеличивались в изобилии после упражнений (таблица). Анализ по возрастным группам выявил ключевые различия между группами; хотя в некоторых случаях тонкие, но устойчивые тенденции усиливались путем объединения данных по возрастным группам (обозначенным как «Молодежь»).Например, в подмышечной области Staphylococcus epidermidis продемонстрировал наиболее сильную связь с неприятным запахом, когда обе возрастные группы были проанализированы совместно (дополнительный файл 1: рисунок S7, таблица), хотя тенденция постоянно наблюдалась в каждой возрастной группе и во временные точки до и. после тренировки. Напротив, на шее Staphylococcus hominis было связано с интенсивностью неприятного запаха, но только у детей ( ρ = 0,65) и с низкой корреляцией, наблюдаемой у подростков ( ρ = 0.09; Дополнительный файл 1: рисунок S7, таблица). Интересно, что фаг Staphylococcus также обнаружил положительную корреляцию с неприятным запахом, что потенциально обусловлено ассоциацией его видов-хозяев и подчеркивает важность взаимодействия фага-бактерии на коже [19, 20]. Этот анализ дополнительно подчеркивает важную роль, которую виды Staphylococcus играют в неприятном запахе у детей, и определяет их конкретный вклад в различных участках тела и возрастных группах [5, 8].
A Cutibacterium видов ( C. avidum ) был единственным другим организмом с устойчивой ассоциацией с более сильным неприятным запахом, особенно в подмышечной области, хотя его значение остается неясным. Другие виды Cutibacterium ( C. granulosum , C. acnes ) были отрицательно связаны с неприятным запахом в области шеи (таблица), возможно, из-за межбактериальной конкуренции с видами Staphylococcus [21, 22]. Corynebacterium видов ( C.pseudogenitalium и C. tuberculostearicum ) положительно коррелировали с интенсивностью запаха в подмышечной области, но с постоянным увеличением относительной численности после упражнений, наблюдаемым только у подростков (таблица). Поскольку известно, что виды Corynebacterium продуцируют запахи серы [23, 24], это наблюдение может быть отражением того факта, что в микробиоме кожи подмышек до полового созревания отсутствуют предшественники из апокринной секреции, чтобы поддерживать их метаболизм в сернистый неприятный запах.
Интересно, что видов Acinetobacter (в частности, A. schindleri ) были обогащены в области шеи детей с более низкой интенсивностью неприятного запаха, а также в 1-часовой временной точке. Пути, задействованные у этих видов в ослаблении восприятия неприятного запаха, неясны, но один из возможных механизмов — это конкуренция с другими микробами через разложение предшественников неприятного запаха на алифатические молекулы [25]. В соответствии с нашим более ранним анализом (дополнительный файл 1: рис. S5), не было обнаружено, что микробы связаны с неприятным запахом в области головы.
В целом, эти анализы подчеркивают различные микробные ассоциации с запахом тела и то, что различное распределение ключевых микробных факторов и компонентов запаха по людям, участкам тела, возрастным группам и временным точкам может играть роль в образовании запаха. Примечательно, что анализ микробиома на уровне родов не смог выявить ключевые ассоциации в подмышечной области (дополнительный файл 1: таблица S3), что подчеркивает важность видовых различий и сильные стороны метагеномного анализа дробовика для изучения микробов, связанных с неприятным запахом.В частности, наши результаты подчеркивают доминирующую роль, которую S. epidermidis может играть в неприятном запахе подмышек с кислыми характеристиками, который мы часто отмечали у детей и, в некоторой степени, у подростков (рис. D). Переходный период полового созревания приводит к усилению преобладания серы в запахе, и сдвиги в активности Staphylococcus и Corynebacterium могут способствовать этому [5] . Мы дополнительно исследуем эти отношения в следующем разделе с помощью анализа путей, связанных с неприятным запахом, в микробиоме кожи.
Идентификация продукции изовалериановой и уксусной кислоты как ключевого пути, связанного с неприятным запахом, у детей и подростков
В рамках плана исследования пот тела был собран у субъектов, объединен и использован для различных анализов (высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), жидкостная хроматография и газовая хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ / ГХМС)) для выявления предшественников запаха, которые могут по-разному присутствовать у детей и подростков (см. Раздел «Материалы и методы»).Этот анализ показал, что молочная кислота была самым распространенным предшественником у детей и подростков, за ней следовали глицерин (больше у подростков), изолейцин и лейцин (дополнительный файл 1: таблица S4). Затем объединенный пот инкубировали в течение 24 часов для измерения продукции молекул, связанных с неприятным запахом, с использованием GC-ольфактометрии (GC-O) и анализа GCMS (дополнительный файл 1: рисунок S8 и дополнительный файл 2: таблица S5). В целом, дети и подростки выявили схожие профили GCMS и GC-O, причем подростки были более богаты доминирующими соединениями — уксусной кислотой и изовалериановой кислотой.Эти два сильнодействующих одоранта имеют характер кислого / кислого запаха, что позволяет предположить, что наблюдаемый «букет кислинки» у наших испытуемых в значительной степени обусловлен этими двумя одорантами.
На основе этой информации мы затем перешли к функциональному анализу, чтобы обнаружить гены и пути, связанные с неприятным запахом, in vivo и на основе данных. Мы использовали подход, аналогичный тому, который использовался для таксономического анализа, чтобы идентифицировать гены и начальный набор путей, коррелирующих с интенсивностью неприятного запаха, и тех, которые чрезмерно представлены после физических упражнений и образования потоотделения (см. Раздел «Материалы и методы»; Дополнительный файл 2: Таблица S6 ).Затем значительно ассоциированные гены были агрегированы в путях, чтобы понять их вклад в производство соединений, вызывающих неприятный запах. Сначала мы использовали подход «мешка генов», который обычно используется в метагеномике, агрегируя изобилие генов без учета таксономического происхождения считываний, чтобы найти ассоциации с неприятным запахом. Однако сопоставление идентифицированных генов с путями не выявило устойчивых ассоциаций внутри пути (например, Дополнительный файл 1: Рисунок S9), вероятно, из-за присутствия нескольких родственных видов (например.g., S. epidermidis и S. hominis ) с явным вкладом в неприятный запах. Напротив, анализ «мешка геномов», который включал видовую идентичность генов, выдвинул на первый план несколько значимых и последовательных ассоциаций путей и соответствующий вклад видов (дополнительный файл 2: таблица S7).
В частности, в подмышечной области метаболизм пирувата и метаболизм аминокислот с разветвленной цепью были обогащены генами S. epidermidis , которые значительно положительно коррелировали с неприятным запахом, что согласуется с нашим таксономическим анализом (рис.а) . Ферменты, полученные из S. epidermidis , участвуют в каскаде множества метаболических путей, ведущих к выработке как уксусной кислоты, связанной с кислым запахом, так и изовалериановой кислоты. Молочная кислота и глицерин превращаются в пируват в процессе гликолиза. В присутствии пирувата ферменты, ответственные за биосинтез и последующее разложение лейцина, валина и изолейцина с образованием изовалериановой кислоты жирной кислоты с разветвленной цепью (например, ключевые ферменты ацетолактатсинтазы (EC: 2.2.1.6) и трансаминазы аминокислот с разветвленной цепью (EC: 2.6.1.42)), как было обнаружено, в значительной степени связаны с неприятным запахом (рис. B, c). Независимым путем было обнаружено, что ферменты, участвующие в окислительной деградации алифатических карбоксилатов пирувата до ацетил-КоА (конверсия Свансона) в процессе, который является ключевым для производства уксусной кислоты и кислого запаха, связаны с неприятным запахом у S. epidermidis (Рис. D; например, пируватдегидрогеназа (EC: 1.2.4.1)). Эти результаты согласуются с ранее опубликованными исследованиями in vitro [10].Подобные пути были также связаны с неприятным запахом в шее, но на этот раз ассоциации были замечены в первую очередь с генами S. hominis и, что более важно, у детей (рис.).
Пути и ферменты, связанные с производящими кислый запах соединениями в подмышечной области. a Количество ферментов (КО), кодируемых микробами, связанными с неприятным запахом, в подмышечной области для путей «биосинтеза / разложения валина, лейцина и изолейцина» и «метаболизма пирувата» KEGG. Цифры в столбиках указывают количество КО, относительное содержание которых в значительной степени коррелирует с интенсивностью запаха. b — d Соответствующие диаграммы путей KEGG, где розовые прямоугольники указывают на значимые положительно коррелированные КО в S. epidermidis среди подростков, а серые прямоугольники указывают на ферменты, которые присутствуют, но не имеют значительной корреляции с интенсивностью запаха. Соединения, вызывающие запах, и их прекурсоры отмечены звездочкой (*).
Пути и ферменты, связанные с соединениями, вызывающими кислый запах, в области шеи. a Количество ферментов (КО), кодируемых микробами, связанными с неприятным запахом, в области шеи для путей «биосинтеза / разложения валина, лейцина и изолейцина» и «метаболизма пирувата» KEGG.Цифры в столбиках указывают количество КО, относительное содержание которых в значительной степени коррелирует с интенсивностью запаха. b — d Соответствующие диаграммы путей KEGG, где розовые прямоугольники указывают на значимые положительно коррелированные KO у Staphylococcus видов среди детей, а серые прямоугольники указывают на ферменты, которые присутствуют, но не имеют значительной корреляции с интенсивностью запаха. Соединения, вызывающие запах, и их прекурсоры отмечены звездочкой (*)
3-метил-3-сульфанилгексанол (3M3SH), 3-метил-2-гексеновая кислота (3M2H) и 3-метил-3-гидроксигексановая кислота. (HMHA) — известные одоранты, ответственные за запах подмышек у взрослых [7].Для производства 3-метил-3-сульфанилгексанола (3M3SH), который связан с неприятным запахом с характеристиками серы, мы наблюдали положительную связь с обоими видами Staphylococcus ( S. hominis и S. epidermidis ; дополнительный файл 1: Рисунок S10). Предыдущие наблюдения in vitro продемонстрировали способность S. hominis , но не S. epidermidis , генерировать 3MS3H [5]. Наши метагеномные результаты указывают на присутствие цистатионин-бета-лиазы в S.epidermidis , что позволяет предположить, что кроме S. hominis , штаммы S. epidermidis , выделенные в азиатских популяциях, также могут генерировать 3M3SH. Для подтверждения этой возможности необходимы дальнейшие эксперименты in vitro. Для 3M2H и HMHA наш анализ GCMS обнаружил отсутствие или минимальное присутствие этих одорантов. Кроме того, наши метагеномные данные не выявили присутствия Corynebacterium striatum и фермента аминоацилазы (agaA; у детей и подростков), которые, как было показано, опосредуют продукцию HMHA [23].Эти данные показывают, что эти молекулы вряд ли будут основными причинами неприятного запаха в наших когортах по сравнению с их ключевой ролью у взрослых [14].
Чтобы проверить связь видов Staphylococcus с характеристиками кислого запаха, мы культивировали изоляты в стерилизованных пулах пота, полученных от субъектов, включенных в исследование, и измерили продукцию различных соединений с неприятным запахом с помощью анализа GCMS (см. Раздел «Материалы и методы» ). В то время как оба вида Staphylococcus были способны продуцировать значительные количества уксусной кислоты и изовалериановой кислоты, другие виды, обычно встречающиеся на коже, такие как C.acnes и M. luteus — нет (рис.). Эти результаты подчеркивают основную роль видов Staphylococcus в производстве уксусной кислоты, изовалериановой кислоты и 3M3SH из предшественников запаха в поте и в объяснении характеристик запаха кислого и серного, наблюдаемого у азиатских детей и подростков.
Способность превращать предшественники пота в соединения, вызывающие неприятный запах, у различных микробов кожи. GCMS — результат инокуляции одной бактерии в течение 24 часов в поте, собранном у субъектов.Обратите внимание, что только S. epidermidis и S. hominis продуцируют значительные количества уксусной кислоты и изовалериановой кислоты, что согласуется с ассоциациями, наблюдаемыми in vivo. Эксперименты с культивированием проводились в аэробных условиях.
Обсуждение
Неприятный запах — это фенотип, который, как хорошо известно, возникает в результате специфических взаимодействий между предшественниками запаха хозяина и поддерживаемым ими микробным метаболизмом [6]. В этом отношении данное исследование служит идеальной испытательной площадкой для изучения аналитических подходов к раскрытию метаболических взаимодействий между хозяином и микробиомом, которые определяют интересующий фенотип.В то время как неприятный запах у взрослых и европейцев широко изучался [5, 6, 9], неприятный запах у азиатов и особенно у детей и подростков не получил должного внимания. Наши исследования показывают, что это действительно проблема потребительского интереса, которая влияет на качество жизни пострадавших детей, предполагая, что ее влияние на психологическое благополучие детей заслуживает дальнейшего исследования.
При разработке исследования по выявлению видов и путей распространения микробов, связанных с неприятным запахом, необходимо учитывать несколько аспектов, включая возможность того, что могут быть таксоны, которые медленно растут, но сильно связаны с неприятным запахом, в то время как другие могут вызывать неприятный запах только тогда, когда они достаточно обильный.Таким образом, наш дизайн включал как продольные (использование упражнений для создания предшественников пота и запаха), так и поперечные аспекты в разных возрастных группах, чтобы в целом уловить различные сигналы ассоциации. Наши данные показывают, что в большинстве случаев имеются согласованные сигналы от продольного и поперечного анализов, за исключением видов Corynebacterium и M. globosa в подмышечных впадинах детей, чье явное снижение относительной численности при физических упражнениях (несмотря на положительную корреляцию с неприятным запахом) может быть связано с их более медленным ростом по сравнению с S.Эпидермодис . Кроме того, данные этого исследования подчеркивают различные микробные факторы, влияющие на запах тела в разных возрастных группах и участках тела, например, было обнаружено, что S. hominis имеет сильную связь с неприятным запахом в области шеи у детей, в то время как область подмышек показала значимая связь с S. epidermidis . И это несмотря на обилие S. hominis в подмышечной области, что позволяет предположить, что здесь играют роль различия в предшественниках пота из области шеи и подмышек и что S.epidermidis может иметь чрезмерный эффект в отношении образования неприятного запаха, когда присутствуют правильные предшественники.
Предыдущая работа по изучению микробного вклада в неприятный запах подмышек в первую очередь подчеркивала роль видов Corynebacterium [7] у взрослых. Используя секвенирование 16S рРНК, эти исследования показали, что виды Corynebacterium , Staphylococcus и Cutibacterium являются доминирующими бактериями в подмышечной области [9, 26–28]. Из них видов Corynebacterium оказались более многочисленными, чем видов Staphylococcus в группах лиц, не использующих антиперспиранты или дезодоранты [26].Также было обнаружено, что неприятный запах в подмышечной впадине взрослых обычно определяется характеристиками серы или прогорклого запаха от 3M3SH, 3M2H и HMHA, генерируемых в основном видами Corynebacterium [7, 9, 29]. Для сравнения, наше исследование показывает, что видов Corynebacterium менее многочисленны у детей и подростков, а видов Staphylococcus более многочисленны. Это различие может быть частично связано с тем, что микросреда подмышечной впадины у детей и подростков формируется эккринной секрецией.Хотя технические различия в профилировании метагенома также могут влиять на эти сравнения, мы отмечаем, что метагеномика дробовика и профилирование 16S рРНК показали хорошее соответствие в предыдущем исследовании [17]. Кроме того, в этом исследовании было обнаружено, что кислый запах чаще встречается у детей, и, соответственно, наш анализ подчеркнул центральную роль видов Staphylococcus в запахе тела у детей. Среди Staphylococcus видов, тогда как в большинстве более ранних исследований изучалась роль S.haemolyticus и S. hominis [5, 23], наша работа является первой, которая определяет роль S. epidermidis в возникновении неприятного запаха из подмышек у детей. Это имеет серьезные последствия с точки зрения мер по борьбе с неприятным запахом — в то время как основной подход для взрослых использует антиперспиранты для контроля образования неприятного запаха медленнорастущими видами Cornybacterium , противомикробные препараты могут быть более подходящими для быстрорастущих видов Staphylococcus у детей в качестве антиперспирантов. было замечено, что они относительно обогащают их [26].Кроме того, поскольку S. epidermidis является важным кожным комменсалом [30], могут потребоваться методы лечения следующего поколения, которые блокируют активность определенных ферментов, выявленных в этом исследовании.
Что касается влияния генетики хозяина на неприятный запах, несколько исследований описали ассоциацию аллелей ABCC11 с запахом тела у взрослых и показали, что люди, несущие аллели GG / GA, имеют усиленный запах из-за генерации 3M3SH, 3M2H, и HMHA из апокринового пота [15, 16, 31].Большинство населения Филиппин (от ~ 72 до 78%) имеет аллель GG / GA, и, следовательно, взрослые на Филиппинах более подвержены неприятному запаху с серными / прогорклыми характеристиками [15, 32]. У детей до полового созревания апокринные железы не полностью активированы [12], и, таким образом, прекурсоры эккринового происхождения могут играть более значительную роль в наблюдаемых характеристиках запаха. Апокринные железы сравнительно более активны у подростков, чей профиль неприятного запаха, как ожидается, будет более похож на профиль взрослых.Эти ожидания совпадают с нашими наблюдениями более высокой интенсивности запаха у подростков по сравнению с детьми и перехода к более серным характеристикам у подростков.
Наш биоинформатический анализ в этом исследовании еще раз высветил проблемы подхода «мешка генов» к изучению функции микробиома с метагеномными данными. Микробы обмениваются метаболитами контролируемым образом, и предположение, что несколько этапов метаболического процесса могут выполняться у разных видов в «метагеноме», не всегда может быть целесообразным [33, 34].Кроме того, ферменты разных видов, принадлежащие к одному и тому же классу ферментов, могут иметь очень разную эффективность и субстратную специфичность [35], например, объясняя, почему S. epidermidis ассоциировался с неприятным запахом из подмышек у детей, а S. hominis — нет. . Эта проблема проиллюстрирована недавним отчетом, показывающим, что метагеномные конвейеры могут выделять очень разные функциональные пути с использованием одного и того же набора данных [36]. Переход к анализу «мешка геномов» может обеспечить лучшую интерпретируемость наборов метагеномных данных, но существенным ограничением является возможность идентифицировать разные гены, принадлежащие одному и тому же геному.Усовершенствованные подходы к кластеризации и сборке, обеспеченные достижениями в технологии секвенирования, могут помочь устранить эти ограничения в будущем [37, 38].
Насколько нам известно, это первый отчет, в котором описаны таксоны, которые отрицательно коррелируют с неприятным запахом, но механизм их действия остается неясным. Эти ассоциации могут быть вызваны различными причинами, включая (а) производство соединений, которые маскируют неприятный запах или имеют более низкую интенсивность запаха (как предлагается здесь для P. avidum ), (б) микробная конкуренция или ингибирование, ведущее к уменьшению роста неприятного запаха; ассоциированные виды (как было описано между Malassezia и Staphylococcus видов [39]), и (c) метаболические процессы, которые приводят к тому, что ключевые предшественники запаха становятся недоступными для образования соединений неприятного запаха.Проведенные здесь культуральные эксперименты с человеческим потом предоставили уникальную основу для реалистичного моделирования доступности прекурсоров и подчеркнули вклад видов Staphylococcus в образование запаха. Дальнейшие эксперименты с консорциумами бактерий могут помочь изучить взаимодействия между ними и, таким образом, определить механизмы уменьшения неприятного запаха.
Материалы и методы
Дизайн клинического исследования
Для этого исследования были набраны две группы субъектов: (1) 15 детей, состоящих из 8 женщин и 7 мужчин, в возрасте от 5 до 9 лет и (2) 15 подростков, состоящих из 8 женщин. и 7 мужчин от 15 до 18 лет.В начале исследования (0 ч) испытуемым давали для душа стандартное кусковое мыло (без антимикробных активных веществ и отдушек). Через час после душа назначенный профессиональный парфюмер оценил интенсивность запаха (диапазон от 0 до 100) и характер в области подмышек, задней части шеи и кожи головы. Образцы микробиома были собраны сразу после этого для каждого участка путем снятия ленты (D100 D-squame, CuDerm). Каждую полоску ленты прикладывали десять раз к коже со стандартизованным давлением в течение 1 с и помещали в 1.Пробирка Эппендорфа 5 мл на льду. Затем испытуемые выполняли 4–5 часов интенсивных упражнений в среде с температурой 32 ° C и относительной влажностью 66%. Вкратце, испытуемые были разделены на группы, чтобы выполнять комбинацию физических нагрузок (беговая дорожка, езда на велосипеде в помещении, аэробика и баскетбол) поочередно под руководством профессионального инструктора. Физические нагрузки выполнялись с интервалом 10–15 мин с перерывом 10–15 мин. Во время перерыва были собраны образцы пота, и участники поддерживали водный баланс.В 8-часовой временной точке, интенсивность запаха, характер запаха и образцы микробиома были собраны снова, как описано выше (левая или правая подмышка выбирались случайным образом, но оставались неизменными по временным точкам). Испытуемые находились в среде без кондиционирования воздуха в течение 8 часов.
Обработка образцов и экстракция ДНК
Ленточные полоски переносили в пробирки Lysing Matrix E (MP Biomedicals) и добавляли 500 мкл буфера ATL (Qiagen). Образцы подвергали взбиванию шариками с помощью прибора FastPrep-24 (MP Biomedicals) на скорости 6.0 м / с в течение 40 с. Затем образцы центрифугировали при 16000 г в течение 5 минут, 200 мкл супернатанта обрабатывали 10 мкл протеиназы K (Qiagen) и инкубировали при 56 ° C в течение 15 минут. ДНК экстрагировали с помощью EZ1 Advanced XL Instrument (Qiagen) с набором EZ1 DNA Tissue Kit (Qiagen) с объемом элюции 100 мкл и количественно определяли с помощью набора Qubit dsDNA HS Assay Kit (Life Technologies), а затем хранили в морозильной камере — 20 ° C. .
Подготовка библиотеки, комбинаторное объединение и секвенирование
Стандартный объем экстрагированной ДНК в 50 мкл подвергали сдвигу с использованием Adaptive Focused Acoustics ™ (Covaris).Библиотеки ДНК получали с использованием основного набора Gene Read DNA Library I (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя, за исключением использования пользовательских адаптеров вместо набора адаптеров GeneRead I. Пользовательские индексные праймеры использовали для обогащения библиотек ДНК, которое выполняли в соответствии с протоколом обогащения, адаптированным из набора олигонуклеотидов для подготовки мультиплексных образцов (Illumina). Количественную оценку библиотек проводили с использованием Agilent Bioanalyzer, подготовленного с помощью набора Agilent High Sensitivity DNA Kit или Agilent DNA1000 Kit (Agilent Technologies).
Чтобы избежать пакетных эффектов, объединение библиотеки всего метагенома было выполнено комбинаторным способом (дополнительный файл 2: таблица S8). Что касается подмышек, образцы от детей и подростков были равномерно разделены на две партии подготовки библиотеки, причем каждая партия содержала равное количество детей, подростков, образцов с более сильным неприятным запахом и более слабым неприятным запахом. Библиотеки образцов от детей были затем объединены в эквимолярных количествах на одной полосе, а библиотеки образцов от подростков на другой дорожке.Для областей шеи и головы библиотеки были построены путем подготовки образцов от одного и того же объекта (1 час и 8 часов) один за другим, чередуя детей и подростков, а также образцов с более сильным неприятным запахом и более слабым неприятным запахом. Образцы с каждого сайта сбора были объединены в один пул. Парное секвенирование (считывание 2 × 101 п.н.) было выполнено на успешных библиотеках ДНК с использованием платформы Illumina HiSeq 2000.
Предварительная обработка чтения
После демультиплексирования чтения были отфильтрованы с помощью программного обеспечения Bcl2fastq (CASAVA version 1.8.4) от Illumina, и FastQC был выполнен для оставшихся чтений (Pass Filter Reads). Основания секвенирования с показателями качества ниже 30 были обрезаны с 5′- и 3′-концов каждого считывания, а считывания с длиной менее 30 нуклеотидов были удалены. Человеческие чтения были отфильтрованы путем сопоставления с человеческим геномом (GRCh48) с использованием BWA-MEM [40] (версия 0.7.13-r1126; параметры по умолчанию), оставив после себя 4,71 миллиарда нечеловеческих парных и одноэлементных считываний.
Таксономическая классификация
Таксономическое профилирование образцов было выполнено по всем таксономическим рангам с использованием MetaPhlAn2 [41] (версия 2.5.0; параметры по умолчанию). MetaPhlAn2 использует гены-маркеры клады, охватывающие бактериальные, архейные, вирусные и эукариотические микробы, для выполнения однозначных таксономических задач. Метагеном каждого образца анализировали независимо для вычисления относительной численности. Затем выходные файлы были объединены в единую таблицу с указанием относительной численности на образец (столбцы) и на микроб (строка). Таксоны со средней относительной численностью> 1% у детей или подростков были консервативно определены для каждого участка тела для дальнейшего статистического анализа.
Функциональное профилирование
HUMAnN2 [33] (v0.7.1; параметры по умолчанию) было запущено с базой данных белков UniRef90 для получения функциональных профилей для каждого метагенома. HUMAnN2 обеспечивает (i) численность каждого семейства ортологичных генов UnifRef, указанную в виде числа чтений на килобазу (RPK), (ii) численность путей MetaCyc в RPK и (iii) охват каждого пути MetaCyc, масштабируемое от 0 до 1. Ген Семьи и пути со средними значениями RPK> 10 по выборкам от детей или подростков были сохранены и были повторно нормализованы до относительной численности для последующего анализа ассоциации, в то время как путь MetaCyc рассматривался для дальнейшего статистического анализа только в том случае, если средний охват путей по всем образцам было> 0.3. В целом, мы идентифицировали 69 792, 65 939 и 45 684 уникальных семейства генов из метагеномов подмышек, шеи и головы, соответственно. Для путей MetaCyc существует 89 (подмышками), 103 (шея) и 83 (голова) путей, которые соответствуют указанным выше критериям. Процент считываний, назначенных семействам и путям генов, а также считываний без назначения можно найти в Дополнительном файле 2: Таблица S9. Вклад каждого таксона в семейство генов и путь также определяли на основе таксономического назначения каждого считывания из выходов HUMAnN2.Вклад в семейство генов был визуализирован путем сопоставления идентификаторов UniRef90 с идентификаторами ортологической группы KEGG в путях KEGG [42] (версия обновлена в феврале 2016 г.).
Статистический анализ
Многомерный анализ для оценки ассоциаций между интенсивностью запаха, возрастом и микробными сообществами до и после тренировки был выполнен с использованием подхода канонического анализа основных координат (с несходством Брея-Кертиса), реализованного в веганском R-пакете ( версия 2.4-3).Существенные связи между таксонами / функциями микробов и неприятным запахом были выявлены с помощью комбинации статистических тестов, в которых (i) коэффициент корреляции Спирмена между интенсивностью запаха и таксонами / функциями микробов использовался для поперечного анализа и (ii) ранговый критерий Вилкоксона для анализа численность до и после тренировки использовалась для продольного анализа. Значения p были скорректированы с использованием подхода Бенджамини-Хохберга, и все статистические анализы были выполнены в R.Для путей, которые считались обнаруженными, было проведено ассоциативное тестирование для молодежи, детей и подростков, чтобы выявить те, у которых скорректированные по FDR значения p <0,1, по крайней мере, в двух из шести сравнений в качестве возможных путей для дальнейшего анализа на уровне генов.
Выделение микробов из подмышечной области у субъектов
В этом исследовании микробы были собраны в асептических условиях путем мазка подмышечной области с использованием предварительно увлажненного (стерильного 0,15 M NaCl + 0.1% раствор Твин 20) тампоны из хлопка (Puritan Med). Образец мазка от субъекта с наивысшей интенсивностью запаха помещали на кровяной агар TSA (Thermo Fisher Scientific) и инкубировали при 37 ° C в течение ночи. Репрезентативные одиночные колонии на основе морфологии были отобраны и недавно субкультивированы для масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF (Bruker) для идентификации видов. Идентификация видов была дополнительно подтверждена секвенированием 16S рРНК (Charles River). Выбранные представляющие интерес бактерии ( Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus hominis, Cutibacterium acnes и Micrococcus luteus ) затем суспендировали в криогенных гранулах (Thermo Fisher Scientific) и хранили в морозильной камере — 80 ° C.
Сбор пота и эксперименты по культивированию
Человеческий пот собирали из области подмышек и шеи у нескольких человек в этом исследовании, используя 1,5 мл пробирки Эппендорфа, объединяли в стерильные 50 мл пробирки и хранили при 4 ° C. Затем смесь секрета пота стерилизовали центрифугированием 3000, г, × 10 мин и стерильными шприцевыми фильтрами с размером пор 0,2 мкм (Millipore). Бактериальные изоляты были свежеприготовлены в течение ночи и собраны на следующий день, когда OD 600 достигнет 1.0. После этого следовало центрифугирование при 3000 g в течение 10 мин, полученный осадок промывали стерильным 0,01 М фосфатным буфером (pH 6,0) и повторно суспендировали в 10 мл свободного от бактерий пула пота. Эти свежеприготовленные образцы пула бактерий и пота инкубировали в орбитальном шейкере в аэробных условиях при 120 об / мин, 37 ° C в течение 24 часов. Каждый эксперимент включал отрицательные контроли (10 мл стерилизованного фильтром пула пота без бактериальной инокуляции) в тех же условиях, что и выше. Все эксперименты проводились в аэробных условиях.
Аналитическое определение кислых предшественников и отдушек
Лейцин и изолейцин измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Вкратце, 0,2 мл образца вносили пипеткой в центрифужную пробирку на 15 мл. После этого добавляли 4,8 мл 0,05 н. Соляной кислоты и диспергировали образец с помощью вихревой мешалки. Полученный раствор фильтровали через шприц из ПВДФ 0,45 мкм и смешивали с 0,1 мл натрий-боратного буфера (pH 10,2) и 0,2 мл раствора NBD-F в 2-миллилитровом желтом флаконе для ВЭЖХ.После плотного закрытия крышки флакон нагревали в печи при 60 ° C в течение 5 минут, затем охлаждали перед добавлением 0,4 мл 0,05 н. Соляной кислоты и вводом в ВЭЖХ для анализа. Измерение глицерина проводилось с помощью GC-FID. Пять миллилитров пота лиофилизировали в течение ночи с последующим добавлением в пробирку 0,2 мл воды и 1,8 мл экстракционного растворителя. Затем образец фильтровали через шприц из ПВДФ 0,45 мкм в пробирку для ГХ для анализа.
Чтобы измерить уровень молочной кислоты в поту, сначала создайте калибровочную кривую, используя 0.0, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0 и 5,0 частей на миллион стандарта молочной кислоты были установлены путем мониторинга массы иона m / z89 в выбранном ионном режиме (SIM) в анализе ЖХ / МС (ABSciex 4000 QTRAP). Затем образцы пота разбавляли в 500 раз с использованием метанола / воды (1: 1) и вводили в систему ЖХ / МС для анализа, и из образцов получали площади пиков массового числа молочной кислоты (m / z89). . Уровни молочной кислоты определяли путем сравнения площадей пиков образцов и откликов калибровочной кривой.
pH собранной пробы пота (10 мл) доводили до 12,0 добавлением NaOH (Wako), и лиофилизацию проводили в течение 2 дней. После лиофилизации в каждую пробирку с остатками добавляли 1 мл HCl (50% разбавление 37% HCl) (Sigma) с последующим встряхиванием и центрифугированием при 4000 об / мин и 20 ° C в течение 20 минут. Полученный супернатант переносили в пробирку Эппендорфа, добавляли 150 мкл хлороформа (Sigma) с последующим встряхиванием и центрифугированием при 14800 об / мин и 4 ° C в течение 20 мин.Затем фракции хлороформа объединяли и 10 мкл объединенной среды вводили в прибор GCMS для анализа. Agilent GC 7890B / MSD 5977A (Agilent, Wilmington, DE, USA) с автосамплером Gerstel MPS2 -TDU-CIS4 (Gerstel, Германия) использовали для разделения и анализа соединений запаха тела. ГХ-МС был оснащен колонкой DB-Wax, 60 мм × 0,25 мм с толщиной пленки 0,25 мкм (Agilent, Делавэр, США). Использовался режим впрыска жидкости большого объема — начальная температура инжектора была на уровне 10 ° C, уравновешенная на 0.В течение 5 минут использовали линейное изменение скорости 12 ° C / мин до конечной температуры 220 ° C, затем выдерживали в течение 5 минут. Объем инъекции составлял 10 мкл. Температуру печи поддерживали на уровне 40 ° C в течение 2 минут, повышали до 220 ° C со скоростью 3 ° C / мин и выдерживали в течение 4 минут. Расход газа-носителя гелия был постоянным и составлял 1,2 мл / мин. Масс-спектрометр работал при энергии ионизации 70 эВ со скоростью четыре сканирования / с в диапазоне м / z 29–450 и температуре источника ионов 230 ° C. Идентификацию структур / соединений проводили с использованием библиотеки Национального института стандартов и технологий (NIST’11) и внутренней библиотеки P&G MS с коммерчески доступными стандартами.ГХ-ольфактометрия выполнялась при первом запуске. Обонятельные измерения проводились тем же профессиональным парфюмером, который оценивал характеристики и интенсивность запаха у участников этого исследования.
Дополнительные файлы
Дополнительные файлы 2: (92K, zip)Таблица S2. Оценка запаха и данные метагеномного секвенирования для всех образцов в этом исследовании. Таблица S5. GC-ольфактометрия пота, взятого у детей и подростков. Таблица S6. Обнаруженные пути MetaCyc, которые, как было установлено, связаны с неприятным запахом, на основании значений обилия путей из HUMAnN2.Для области головы значимой ассоциации не обнаружено. Таблица S7. Ключевые пути, связанные с производством неприятного запаха, и их таксономические факторы. Таблица S8. Информация о том, как образцы были распределены в партиях для подготовки библиотеки и секвенирования, чтобы избежать эффекта партии. Таблица S9. Считывает сопоставленные (%) семейств генов UniRef90 и пути MetaCyc. (ZIP 92 кб)
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Серену Хейз и Сару Аршад за помощь в проверке содержания рукописи.
Финансирование
Эта работа финансировалась грантом SPF для сотрудничества A * STAR-P&G (APG2013 / 032). Финансовая поддержка компании Procter & Gamble, Цинциннати, Огайо, была использована для разработки и проведения части исследования.
Сокращения
3M2H | 3-метил-2-гексеновая кислота |
3M3SH | 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-гексанол 3-метил-4-гексановая кислота |
HPLC | Высокоэффективная жидкостная хроматография |
LC / GCMS | Жидкостная хроматография и газовая хроматография-масс-спектрометрия |
Вклад авторов
YL, DS, PLN, JL, DS, PLN и задумал это исследование.PB, AHQN и DS участвовали в метагеномном секвенировании. PH, JT, RK, TMUT, JL и MO участвовали в культивировании и масс-спектрометрическом анализе. THL и DV проанализировали метагеномные данные под наблюдением PL и NN. THL и NN написали рукопись при участии всех авторов. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.
Примечания
Утверждение этических норм и согласие на участие
Исследование было проведено, и все образцы были собраны PRICEPTS Inc. (PRICE Product Testing Services Incorporated) в Маниле с одобрения Институционального обзора Сингапурского инновационного центра Procter & Gamble (Сингапур) Правления и в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (поправка 1996 г.).Руководства ICH по надлежащей клинической практике (GCP) были соблюдены, и добровольное информированное согласие было предоставлено с одобрения Совета по этике исследований P&G. Это клиническое исследование соответствовало руководящим принципам STROBE для наблюдательных исследований на людях. Матери, которые согласились принять участие в исследовании своих детей, подписали форму информированного согласия, а подростки, которые согласились участвовать, подписали форму согласия.
Согласие на публикацию
Не применимо.
Конкурирующие интересы
Несколько соавторов (Л.Y. D.S. P.L. J.L. P.B. P.H. J.T. R.K. T.T. M.O.) участвовал и / или проводил это исследование, будучи сотрудником компании Procter & Gamble. Эти соавторы могут владеть акциями компании, но прямой финансовой выгоды или убытков от публикации этой рукописи не ожидается. Согласно требованиям трудовых обязательств компании Procter & Gamble по соблюдению конфиденциальности, эти соавторы не могут заявлять о патентной деятельности.
Примечание издателя
Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и принадлежностей организаций.
Информация для авторов
Цзе Хау Лам, электронная почта: [email protected].
Давиде Верзотто, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@dottozrev.
Пурбита Брахма, электронная почта: [email protected].
Аманда Хуэй Ци Нг, электронная почта: [email protected].
Пин Ху, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@aqhgn.
Дэн Шнелл, электронная почта: [email protected].
Джей Тисман, электронная почта: [email protected].
Ронг Конг, электронная почта: [email protected].
Thi My Uyen Ton, электронная почта: [email protected].
Цзяньцзюнь Ли, электронная почта: [email protected].
May Ong, электронная почта: [email protected].
Ян Лу, электронная почта: [email protected].
Дэвид Суэйл, электронная почта: [email protected].
Пинг Лю, электронная почта: [email protected].
Цзицюань Лю, электронная почта: [email protected].
Ниранджан Нагараджан, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@nnajaragan.
Ссылки
1. Такахаши Л.К., Накашима Б.Р., Хонг Х., Ватанабэ К. Запах опасности: поведенческий и нейронный анализ страха, вызванного запахом хищника.Neurosci Biobehav Rev.2005; 29: 1157–1167. DOI: 10.1016 / j.neubiorev.2005.04.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Стокли П., Боттелл Л., Херст Дж. Л. Проснитесь и почувствуйте конфликт: запаховые сигналы в соревнованиях женщин. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2013; 368: 20130082. DOI: 10.1098 / rstb.2013.0082. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Киёкава Ю. Социальные запахи: феромоны тревоги и социальная буферизация. Curr Top Behav Neurosci. 2017; 30: 47–65. DOI: 10.1007 / 7854_2015_406. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4.Портер Р. Х., Чернох Дж. М., Балог Р. Д.. Сигнатуры запаха и распознавание родства. Physiol Behav. 1985; 34: 445–448. DOI: 10.1016 / 0031-9384 (85)-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Боудон Дэниел, Кокс Диана С., Эшфорд Дэвид, Джеймс А. Гордон, Томас Гэвин Х. Идентификация подмышечного стафилококка. участвует в производстве зловонного тиоспирта 3-метил-3-суфанилгексан-1-ола. Письма о микробиологии FEMS. 2015; 362 (16): fnv111. DOI: 10.1093 / femsle / fnv111. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Джеймс А.Г., Остин С.Дж., Кокс Д.С., Тейлор Д., Калверт Р.Микробиологическое и биохимическое происхождение запаха из подмышек человека. FEMS Microbiol Ecol. 2013; 83: 527–540. DOI: 10.1111 / 1574-6941.12054. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Fredrich E, Barzantny H, Brune I, Tauch A. Ежедневная борьба с запахом тела: в сторону активности подмышечной микробиоты. Trends Microbiol. 2013; 21: 305–312. DOI: 10.1016 / j.tim.2013.03.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Бек ХК, Хансен AM, Лауритсен FR. Катаболизм лейцина в жирные кислоты с разветвленной цепью у Staphylococcus xylosus.J Appl Microbiol. 2004. 96: 1185–1193. DOI: 10.1111 / j.1365-2672.2004.02253.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Troccaz M, et al. Картирование подмышечной микробиоты, ответственной за запах тела, с использованием независимого от культуры подхода. Микробиом. 2015; 3: 3. DOI: 10.1186 / s40168-014-0064-3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Джеймс А.Г., Хилиандс Д., Джонстон Х. Генерация летучих жирных кислот подмышечными бактериями. Int J Cosmet Sci. 2004. 26: 149–156. DOI: 10.1111 / j.1467-2494.2004.00214.Икс. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Лу К., Фукс Э. Предшественники потовых желез в развитии, гомеостазе и заживлении ран. Перспективы Колд-Спринг-Харбор в медицине. 2014; 4 (2): a015222 – a015222. DOI: 10.1101 / cshperspect.a015222. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Вилке К., Мартин А., Терстеген Л., Биль СС. Краткая история биологии потовых желез. Int J Cosmet Sci. 2007. 29: 169–179. DOI: 10.1111 / j.1467-2494.2007.00387.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Тибуто Д.Регулирование работы сальных желез человека. J Invest Dermatol. 2004; 123: 1–12. DOI: 10.1111 / j.1523-1747.2004.t01-2-.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Harker M, et al. Функциональная характеристика SNP в аллеле ABCC11 — влияние на метаболизм кожи в подмышечных впадинах, формирование запаха и связанное с ним поведение. J Dermatol Sci. 2014; 73: 23–30. DOI: 10.1016 / j.jdermsci.2013.08.016. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Мартин А. и др. Функциональный аллель ABCC11 играет важную роль в биохимическом формировании запаха из подмышечных впадин человека.J Invest Dermatol. 2010; 130: 529–540. DOI: 10.1038 / jid.2009.254. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Chng KR, et al. Профилирование всего метагенома выявляет зависимую от микробиома кожи восприимчивость к обострению атопического дерматита. Nat Microbiol. 2016; 1: 16106. DOI: 10.1038 / nmicrobiol.2016.106. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Чибани-Ченнуфи С., Бруттин А., Диллманн М.Л., Брюссоу Х. Взаимодействие фага-хозяина: экологическая перспектива. J Bacteriol. 2004. 186: 3677–3686. DOI: 10.1128 / JB.186.12.3677-3686.2004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Шу М. и др. Ферментация Propionibacterium acnes, комменсальной бактерии в микробиоме кожи человека, в качестве кожных пробиотиков против метициллин-резистентных
Staphylococcus aureus . ПлоС один. 2013; 8: e55380. DOI: 10.1371 / journal.pone.0055380. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Christensen GJ, et al. Антагонизм между Staphylococcus epidermidis и Propionibacterium acnes и его геномная основа.BMC genomics. 2016; 17: 152. DOI: 10.1186 / s12864-016-2489-5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Natsch A, Gfeller H, Gygax P, Schmid J, Acuna G. Специфическая бактериальная аминоацилаза расщепляет предшественники одоранта, секретируемые в подмышечной впадине человека. J Biol Chem. 2003; 278: 5718–5727. DOI: 10.1074 / jbc.M210142200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Эмтер Р., Натч А. Последовательное действие дипептидазы и бета-лиазы требуется для высвобождения одоранта человеческого тела 3-метил-3-сульфанилгексан-1-ола из секретируемого конъюгата Cys-Gly- (S) посредством Коринебактерии.J Biol Chem. 2008; 283: 20645–20652. DOI: 10.1074 / jbc.M800730200. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Ионеску Г., Константиниу С. Биология рода Acinetobacter. Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol. 2004. 49: 157–174. [PubMed] [Google Scholar] 26. Урбан Дж. И др. Влияние привычного и экспериментального использования антиперспирантов и дезодорантов на микробиом подмышек. PeerJ. 2016; 4: e1605. DOI: 10.7717 / peerj.1605. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Callewaert C, et al.Характеристика скоплений стафилококков и коринебактерий в подмышечной области человека. ПлоС один. 2013; 8: e70538. DOI: 10.1371 / journal.pone.0070538. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 28. Совет Сара Э., Сэвидж Эми М., Урбан Джули М., Элерс Меган Э., Скин Дж. Х. Пейт, Платт Майкл Л., Данн Роберт Р., Хорват Джули Э. Разнообразие и эволюция микробиома кожи приматов. Труды Королевского общества B: биологические науки. 2016; 283 (1822): 20152586. DOI: 10.1098 / РСПБ.2015.2586. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Troccaz M, et al. Гендерные различия между концентрациями нелетучих (R) / (S) -3-метил-3-сульфанилгексан-1-Ol и (R) / (S) -3-гидрокси-3-метил-гексановой кислоты предшественников запаха в подмышечные выделения. Chem Senses. 2009; 34: 203–210. DOI: 10.1093 / chemse / bjn076. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Прокоп-Пригге К.А., Грин К., Варалло Л., Высоцкий К.Дж., Прети Г. Влияние этнической принадлежности на производство одоранта в подмышечных впадинах человека.J Chem Ecol. 2016; 42: 33–39. DOI: 10.1007 / s10886-015-0657-8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 32. Йошиура К. и др. SNP в гене ABCC11 является детерминантом типа ушной серы человека. Нат Жене. 2006. 38: 324–330. DOI: 10,1038 / нг1733. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33. Abubucker S, et al. Метаболическая реконструкция метагеномных данных и ее применение к микробиому человека. PLoS Comput Biol. 2012; 8: e1002358. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1002358. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34.van der Ark KCH, van Heck RGA, Martins Dos Santos VAP, Belzer C, de Vos WM. Больше, чем просто интуиция: основанные на ограничениях метаболические модели в масштабе генома для прогнозирования функций кишечных микробов человека. Микробиом. 2017; 5: 78. DOI: 10.1186 / s40168-017-0299-х. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Тилинг Х, Глокнер Ф. Текущие возможности и проблемы в анализе микробного метагенома — биоинформатическая перспектива. Краткий биоинформ. 2012; 13: 728–742. DOI: 10,1093 / bib / bbs039.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Франк Дж. А. и др. Улучшенные сборки метагеномов и таксономическое объединение с использованием данных длинных циклических согласованных последовательностей. Научный доклад 2016; 6: 25373. DOI: 10,1038 / srep25373. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 40. Ли Х, Дурбин Р. Быстрое и точное согласование короткого чтения с преобразованием Барроуза-Уиллера. Биоинформатика. 2009; 25: 1754–1760. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btp324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 42.Kanehisa M, Sato Y, Kawashima M, Furumichi M, Tanabe M. KEGG как справочный ресурс для аннотации генов и белков. Nucleic Acids Res. 2016; 44: D457 – D462. DOI: 10.1093 / нар / gkv1070. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]Понимание микробной основы запаха тела у детей и подростков до полового созревания
Microbiome. 2018; 6: 213.
, 1 , 2 , 1 , 2 , 3 , 3 , 3 , 1 , 1 , 4 , 1 , 1 , 4 , 1 , 1 и 2, 5Tze Hau Lam
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Сингапур, 13854741 Давид Верзот
2 Вычислительная и системная биология, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
Purbita Brahma
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Amanda Hui Qi Ngutational
2 Computing и системной биологии, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
Ping Hu
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Dan Schnell 9 0041
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Jay Tiesman
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Rong Kong
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Singapore, 138547 Singapore
Thi My Uyen Ton
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Singapore, 138547 Singapore
Jianjun Li
4 Procter & Gamble Sharon Woods Innovation Center, Sharonville, OH 45241 США
May Ong
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Ян Лу
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Дэвид Свайл
4 0002 9000 Procter & Gamble Центр инноваций Шэрон Вудс, Шаронвилл, Огайо 45241 СШАПинг Лю
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Цзицюань Лю
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Ниранджан Нагараджан
2 Институт вычислительной и системной биологии of Singapore, Singapore, 138672 Singapore
5 Медицинская школа Yong Loo Lin, Национальный университет Сингапура, Сингапур, 119228 Сингапур
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
2 Вычислительный и системной биологии, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
4 Procter & Gamble Sharon Woods Innovation Center, Sharonville, OH 45241 USA
5 Медицинский факультет Юн Лу Линя, Национальный университет Сингапур, Сингапур, 119228 Сингапур
Автор, ответственный за переписку.Поступило 28.05.2018 г .; Принято 2 ноября 2018 г.
Открытый доступ Эта статья распространяется в соответствии с условиями Международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы должным образом укажете автора (авторов) и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения. Отказ от лицензии Creative Commons Public Domain Dedication (http: // creativecommons.org / publicdomain / zero / 1.0 /) применяется к данным, представленным в этой статье, если не указано иное. Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.- Дополнительные материалы
Дополнительный файл 1: Рисунки S1-S10 , Таблицы S1, S3 и S4 . (PDF 3276 кб)
GUID: 4D6F7D72-9FB1-448F-A881-A5C17FD171DD
Дополнительный файл 2: Таблица S2. Оценка запаха и данные метагеномного секвенирования для всех образцов в этом исследовании. Таблица S5. GC-ольфактометрия пота, взятого у детей и подростков. Таблица S6. Обнаруженные пути MetaCyc, которые, как было установлено, связаны с неприятным запахом, на основании значений обилия путей из HUMAnN2. Для области головы значимой ассоциации не обнаружено. Таблица S7. Ключевые пути, связанные с производством неприятного запаха, и их таксономические факторы. Таблица S8. Информация о том, как образцы были распределены в партиях для подготовки библиотеки и секвенирования, чтобы избежать эффекта партии. Таблица S9. Считывает сопоставленные (%) семейств генов UniRef90 и пути MetaCyc. (ZIP, 92 кб)
GUID: 36CA9ED0-CC48-4DB0-8510-8A2BEB1497C8
- Заявление о доступности данных
Наборы данных, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны в Европейском архиве нуклеотидов в рамках проекта id ERP1084 https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB26427).
Аннотация
Предпосылки
Несмотря на то, что человеческий пот не имеет запаха, считается, что рост бактерий и разложение определенных предшественников запаха в нем вызывает запах тела у людей.Хотя механизмы образования запаха широко изучены у взрослых, мало что известно о подростках и детях, не достигших полового созревания, у которых состав пота отличается от незрелых апокринных и сальных желез, но, возможно, они более восприимчивы к социальному и психологическому воздействию неприятного запаха.
Результаты
Мы интегрировали информацию из анализа всего микробиома нескольких участков кожи (подмышки, шея и голова) и нескольких временных точек (1 час и 8 часов после ванны), проанализировав в общей сложности 180 образцов для проведения самого большого метагенома. проведенное ассоциацией исследование неприятного запаха.Значительные положительные корреляции наблюдались между интенсивностью запаха и относительной численностью Staphylococcus hominis , Staphylococcus epidermidis и Cutibacterium avidum , а также отрицательная корреляция с видами Acinetobacter schindleri и Cutibacterium. Анализ метаболических путей выявил связь продукции изовалериановой и уксусной кислот (кислый запах) из обогащенных S. epidermidis (подростковая подмышечная область) и S.hominis (детская шея) и продукция серы из Staphylococcus видов (подмышечная впадина подростка) с интенсивностью запаха, что хорошо согласуется с наблюдаемыми характеристиками запаха у детей и подростков в предпубертатном возрасте. Эксперименты с культурами человеческого и искусственного пота подтвердили способность S. hominis и S. epidermidis независимо производить неприятный запах с отчетливыми характеристиками запаха.
Выводы
Эти результаты демонстрируют возможности метагеномики кожи для изучения ко-метаболических взаимодействий между хозяином и микробами, выявления различных путей образования запаха от пота у детей и подростков в предполовозрелом возрасте и выделения ключевых ферментативных мишеней для вмешательства.
Электронные дополнительные материалы
Онлайн-версия этой статьи (10.1186 / s40168-018-0588-z) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.
Введение
Запах тела в животном мире часто играет важную роль в защите от хищников и выживании [1–3]. Считается, что у людей обонятельные сигналы играют роль в обнаружении родства и выборе партнера [4]. Несмотря на эти функции, запах тела, как правило, вызывает сильную социальную стигматизацию, а его социальное и психологическое воздействие на затронутых субъектов до конца не изучено.
Считается, что запах тела у людей в первую очередь опосредован бактериальным разложением естественно секретируемых, не пахнущих компонентов пота, особенно жирных кислот, алифатических аминокислот с разветвленной цепью, глицерина и молочной кислоты, происходящих из эккринных, апокринных и сальных желез. железы [5–8]. В исследованиях у взрослых с использованием секвенирования маркерных генов (16S рРНК) и других подходов, ряд бактерий, но в первую очередь видов Corynebacterium , были связаны с неприятным запахом [6, 9, 10].Кроме того, определенные бактериальные ферменты и пути, которые воздействуют на непахучие белковые предшественники или продуцируют молекулы запаха, такие как уксусная кислота, летучие жирные кислоты, сульфанилы и тиоспирты, также были идентифицированы с использованием подходов, основанных на культуре [5-7, 10, 11] . Однако существуют значительные различия между физиологией, связанной с запахом, и микробиотой кожи взрослых и не взрослых. Например, апокриновые железы (в основном находящиеся в местах тела с волосяными фолликулами, например, в подмышечной впадине) неактивны до тех пор, пока не будут стимулированы гормональными изменениями в период полового созревания, и в отличие от эккринных желез, которые секретируют непрерывно, апокриновые железы секретируют периодически [12].Эккриновый пот (прозрачный, без запаха, pH 4,0–6,8, на 98–99% состоит из воды, но также содержащий хлорид натрия, жирные кислоты, молочную кислоту, лимонную кислоту, аскорбиновую кислоту, мочевину и мочевую кислоту) и апокриновый пот (без запаха, pH 6,0–7,5, содержащие воду, белки, углеводы, липиды и стероиды) имеют различный состав и распределение (все участки тела против внутренних волосяных фолликулов) [13]. Кроме того, сальные железы, которые выделяют маслянистое вещество без запаха, называемое кожным салом, в волосяные фолликулы (pH 4,5–5,5), имеют повышенную активность в период полового созревания [14].Таким образом, запах тела обычно считается значимым только у лиц, достигших полового созревания, и у взрослых, и в основном он изучался в области подмышечной впадины, где количество апокринных желез превышает количество эккринных желез в 10 раз.
Большинство исследований неприятного запаха проводилось в умеренном климате и на субъектах из Европы и Северной Америки. Считается, что азиаты, особенно выходцы из Восточной Азии, генетически предрасположены к уменьшению неприятного запаха [15, 16]. Однако жаркая и влажная тропическая среда может увеличить выделение потоотделения и связанное с этим возникновение неприятного запаха.Основываясь на обширных исследованиях в контексте Юго-Восточной Азии, мы определили, что запах тела действительно является серьезной проблемой для детей и подростков, не достигших полового созревания, как с точки зрения оценок родителей, так и с точки зрения экспертных оценок (дополнительный файл 1: таблица S1). Влияние неприятного запаха в детстве на эмоциональное, социальное и психологическое благополучие субъектов является неизведанной областью, но, вероятно, вызывает большее беспокойство, чем неприятный запах взрослых. Более того, поскольку секреция апокринных желез у детей неактивна, метаболические взаимодействия между хозяином и микробами, которые приводят к неприятному запаху, остаются невыясненными.
Для решения этой темы мы набрали когорту детей и подростков до полового созревания на Филиппинах, которые были оценены профессиональным парфюмером на предмет определения интенсивности запаха (диапазон 0–100) и характера (например, сладкого, жирного, прогорклого, кислого и т. hircine, сера), в дополнение к оценке их родителей (дополнительный файл 2: таблица S2). В план исследования входили отбор образцов из нескольких участков тела (шея, подмышки, голова), связанных с запахом тела, а также из нескольких временных точек после ванны и активного отдыха, чтобы систематически понять микробную основу запаха тела у этих людей.В общей сложности 180 образцов были подвергнуты глубокому анализу секвенирования всего метагенома, что позволило нам изучить членов бактериального, вирусного и эукариотического сообществ и их функциональную связь с неприятным запахом. Мультимодальный анализ, сочетающий регрессию к интенсивности запаха и дифференциальные сигнатуры до и после активного отдыха, использовался для выявления таксонов и функций микробов, связанных с неприятным запахом у детей (5–9 лет) и подростков (15–18 лет). Эти подписи частично перекрываются (например, S.hominis ), но также отличные от того, что было зарегистрировано во взрослых когортах. В целом, наше исследование подчеркивает важность перехода от «мешка генов» к анализу метагеномов «мешка геномов» для всестороннего изучения метаболических взаимодействий между хозяином и микробами.
Результаты
Отчетливая интенсивность запаха и характеристики, связанные с различными частями тела у детей и подростков
Наше исследование было основано на двух разных возрастных группах лиц: дети предпубертатного возраста (5–9 лет) и подростки (15–18 лет). лет), что позволяет более детально изучить микробную основу неприятного запаха на ранних этапах жизни (см. раздел «Материалы и методы», рис.a, Дополнительный файл 2: Таблица S2). В то время как подмышечная впадина (подмышечная впадина) была основным местом исследования неприятного запаха, исследования потребителей показали, что неприятный запах из области шеи (затылка) и головы (средняя часть волосистой части головы) также является областью, вызывающей беспокойство у семей, и поэтому были включены в это исследование ( Дополнительный файл 1: Таблица S1). Субъекты оценивались в двух временных точках, разделенных 7 часами отдыха и упражнений для образования потоотделения, что обеспечивало хорошо подходящую экспериментальную установку для учета вариабельности между хозяевами и исследования того, как микробы превращают предшественники пота в неприятный запах (рис.а). Кроме того, первая временная точка была сделана через 1 час после душа, что обеспечило стандартизованный исходный уровень для всех людей. Образцы были взяты в тот же день и в тот же день на Филиппинах (Манила) при относительно постоянной температуре окружающей среды 32 ° C и влажности 66%.
Дизайн исследования и взаимосвязь между интенсивностью запаха, характеристиками запаха, возрастом и участками тела. a Схема с подробным описанием целевых групп исследования, номеров образцов и точек времени сбора. b Распределение интенсивности запаха по участкам тела до (1 ч) и после (8 ч) упражнений и по возрастным группам (дети и подростки; ** p -значение <0.05, * p -значение <0,1). c Линии тренда, показывающие взаимосвязь между различными характеристиками запаха и интенсивностью запаха на разных участках тела (1 = присутствует, 0 = отсутствует). d Относительное распределение кислого запаха и запаха серы у субъектов до (1 ч) и после (8 ч) упражнений по возрастным группам и участкам тела. Точками отмечена интенсивность запаха, как показано на левой оси, в то время как гистограммы показывают количество субъектов, как показано на правой оси
В дополнение к группам запахов, оцененным родителями (дополнительный файл 2: таблица S2), запах оценивался одним профессиональным парфюмером. интенсивность и характер во всех предметах, местах и во все моменты времени.Как и ожидалось, интенсивность запаха, измеренная профессиональным парфюмером, была значительно выше в подмышках у детей и подростков после физических упражнений (тест Вилкоксона p — значение <0,05) (рис. B). Незначительное увеличение интенсивности запаха было также обнаружено в области шеи и головы у подростков и детей, соответственно (критерий Вилкоксона p — значение <0,1). У подростков раньше была более высокая интенсивность запаха, чем у детей в подмышечной области (тест Вилкоксона , p -значение = 2.4 × 10 — 4 ) и после (тест Вилкоксона p -значение = 2,6 × 10 — 4 ) упражнений, и в целом интенсивность запаха была ниже в области шеи и головы по сравнению с областью подмышек. Что касается характеристик запаха, то в области подмышек и шеи наблюдались кислые запахи и запахи серы со средней и высокой интенсивностью запаха, соответственно (рис. C). Напротив, область головы в первую очередь характеризовалась жирным запахом, подчеркивая, что разные области тела, вероятно, имеют разный микробный метаболизм, способствующий возникновению неприятного запаха.Анализ характеристик запаха по возрастным группам и временным точкам показал, что, в то время как дети в первую очередь определяются характеристиками запаха кислого или кислого + серы, подростки с большей вероятностью будут иметь характеристику кислый + сера, которая смещается к доминирующей характеристике серы после упражнений (рис. D). . Однако это свойство, по-видимому, характерно для подмышек, а в области шеи и головы как у детей, так и у подростков преобладает кислый запах (рис. D). Эти наблюдения обеспечивают важный фон для нашего анализа микробного вклада в неприятный запах в следующих разделах.
Особенности микробиома кожи в разных возрастных группах и в связи с неприятным запахом
Для изучения таксономического и функционального состава микробиома кожи в нашей когорте образцы были собраны с использованием недавно установленного протокола снятия ленты [17], обеспечивающего достаточное количество ДНК для построения метагеномные библиотеки дробовика для 100% наших образцов и ни одного из контрольных образцов (коллекционные и лабораторные контроли). Глубокое секвенирование на платформе Illumina было использовано для характеристики образцов микробиома кожи для всех людей, участков и временных точек (180 образцов, ~ 69 миллионов считываний в среднем; дополнительный файл 2: таблица S2).В среднем чтения были высокого качества (> Q30), при этом более 98% чтений можно было использовать после качественной фильтрации (дополнительный файл 2: таблица S2). Используя метагеномные данные для перекрестного анализа царств, мы отметили, что разные участки тела демонстрировали различное распределение уровней царства (дополнительный файл 1: рисунок S1). Бактерии в большей степени присутствовали в образцах подмышек (тест Вилкоксона p — значение <3 × 10 — 4 ), в то время как эукариоты были сравнительно более многочисленными на детских головах (тест Вилкоксона p — значение <2 × 10 — 9 ), а образцы шеи имели уникально более высокую относительную долю вирусов (тест Вилкоксона p — значение <7 × 10 — 3 ).Повышенное количество вирусов и эукариот в областях головы и шеи аналогично тому, что наблюдалось в близлежащих участках (ретроаурикулярная складка, затылок) у взрослых, что свидетельствует об уникальных нишах, которые они предлагают [18].
Определенные сигнатуры микробиома появились для каждого участка тела на уровне видов и рода бактерий (дополнительный файл 1: рисунки S2, S3), несмотря на наличие явных различий между микробиомами подростков и детей (рисунок а, дополнительный файл 1: Рисунок S4).Например, Staphylococcus hominis является наиболее распространенным видом бактерий в подмышечной области, несмотря на заметные различия между детьми и подростками (70% против 37%; тест Вилкоксона p -значение <5 × 10 — 4 ). Точно так же, хотя повышенное присутствие M. globosa и C. acnes отличает шею и голову от подмышек, у детей на голове относительно больше M. globosa , тогда как у подростков преобладают C.acnes (рис. а, дополнительный файл 1: рис. S3, S4). Эти различия коррелируют с изменениями активности апокринных желез в период полового созревания и могут служить основой для различий в характеристиках неприятного запаха между детьми и подростками. Кроме того, у всех субъектов было гораздо меньшее количество видов Corynebacterium в подмышечных впадинах, чем то, что наблюдалось у взрослых [9], что позволяет предположить, что отдельные виды могут играть роль в неприятном запахе в этих возрастных группах.
Связь между микробиомом кожи, интенсивностью запаха, возрастом и временем отбора проб. a Относительная численность кожных микробов (> 0,1%) на разных участках на уровне родов и видов. Данные представлены как средняя относительная численность внутри группы. b Диаграммы распределения для канонического анализа основных координат (CAP), иллюстрирующие силу связи между интенсивностью запаха, возрастом, временем отбора проб и микробиомом кожи. Анализ CAP основан на несходстве Брея-Кертиса. Размер каждой точки представляет собой оценку относительной интенсивности запаха в каждом образце, а число, перекрывающее каждую точку, указывает образцы, собранные до (1) или после (8) упражнения
Канонический анализ основных координат изменения микробиома кожи на разных участках тела в отношение к возрастной группе, полу и временным точкам (1 час или 8 часов) дополнительно иллюстрирует силу связи между интенсивностью запаха, возрастом, временем отбора проб и микробиомом кожи (рис.б). В подмышечной области конкретные возрастные группы и время отбора образцов хорошо коррелируют с интенсивностью запаха (значение p <0,001) и в меньшей степени с полом (значение p <0,05) в зависимости от состава микробиома кожи. Этот образец также наблюдается на шее, но не имеет значения на голове, где существует более сильная связь с полом (дополнительный файл 1: рисунок S5). Состав микробиома в области головы также уникален тем, что не кажется, что он заметно меняется после тренировки.Одна из возможностей для этого - ограниченное воздействие душа на микробиом кожи головы по сравнению с другими участками, поскольку микробы, находящиеся в волосяном фолликуле, делают микробиом кожи головы более стабильным и эластичным.
Виды Staphylococcus сильно коррелируют с интенсивностью запаха у детей и подростковМы отметили, что дети, принадлежащие к определенным родителями категориям («неприятный запах» и «без неприятного запаха»), не демонстрировали существенно различающуюся интенсивность запаха, как это определено профессиональным парфюмером. , по возрастным группам и временным точкам (Дополнительный файл 1: Рисунок S6), потенциально подчеркивая проблемы, связанные с тем, чтобы при таком анализе полагаться исключительно на восприятие потребителей.Однако группы «неприятного запаха» действительно показали тенденцию к более высокой интенсивности запаха, и эта разница может достигать статистической значимости при больших размерах выборки. Вместо проведения категориального анализа в этом исследовании мы искали таксоны и функции микробов, которые напрямую связаны с определяемой парфюмером интенсивностью запаха (см. Раздел «Материалы и методы»). Кроме того, доступность данных из двух временных точек, до и после тренировки, в дальнейшем использовалась для определения таксонов и функций микробов, которые изменяются в долгосрочном плане в связи с повышенным выделением пота и запаха (см. Раздел «Материалы и методы», Дополнительный файл 1: Рисунок S7, таблица).
Таблица 1
Список микробов на уровне видов, которые показывают значительную корреляцию с интенсивностью запаха, по крайней мере, в одной возрастной группе
Виды | Молодежь | Дети | Подростки | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Спирмена 18 4 902 Wilcoxon | Spearman’s ρ | Wilcoxon | Spearman’s ρ | Wilcoxon | | |||||||
ρ | p -значение | p -значение | ρ | p -значение | p -значение | ρ | p -значение | p -значение | ||||
Подмышки | ||||||||||||
Staphylococcus epidermidis | 0.67 | 5 × 10 −7 | ↑ | 0,04 | 0,44 | н.у. | ↑ | н.у. | 0,40 | н.у. | ↑ | н.у. |
Cutibacterium avidum | 0,63 | 5 × 10 −6 | ↑ | н.у. | 0,52 | н.у. | ↑ | н.у. | 0,31 | н.у. | ↑ | н.у. |
Corynebacterium pseudogenitalium | 0.44 | 10 −2 | ↓ | н.у. | 0,42 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,13 | н.у. | ↑ | н.у. |
Corynebacterium tuberculostearicum | 0,38 | 0,06 | ↓ | н.у. | 0,35 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,18 | н.у. | ↑ | н.у. |
Malassezia globosa | 0.53 | 7 × 10 −4 | ↓ | н.у. | 0,37 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,33 | н.у. | ↑ | н.у. |
Шея | ||||||||||||
Staphylococcus hominis | 0,32 | n.s. | ↑ | н.у. | 0,65 | 10 −2 | ↑ | н.у. | 0,09 | н.у. | ↑ | н.с. |
Staphylococcus phage StB27 | 0,49 | 0,02 | ↑ | n.s. | 0,77 | 10 −4 | ↑ | н.у. | 0,19 | н.у. | ↑ | н.у. |
Cutibacterium granulosum | — 0,45 | 0,03 | ↓ | 0,06 | — 0,48 | н.у. | ↓ | н.у. | — 0,38 | н.у. | ↓ | н.у. |
Acinetobacter schindleri | — 0,43 | 0,03 | ↓ | 0,07 | — 0,47 | н.у. | ↓ | н.у. | — 0,30 | н.у. | ↓ | н.у. |
Cutibacterium acnes | — 0,28 | n.s. | ↓ | н.у. | — 0.54 | 0,08 | ↓ | н.у. | — 0,21 | н.у. | ↓ | н.у. |
В целом, между поперечным и продольным анализом наблюдались устойчивые тенденции, где таксоны, которые были положительно коррелированы с неприятным запахом, также увеличивались в изобилии после упражнений (таблица). Анализ по возрастным группам выявил ключевые различия между группами; хотя в некоторых случаях тонкие, но устойчивые тенденции усиливались путем объединения данных по возрастным группам (обозначенным как «Молодежь»).Например, в подмышечной области Staphylococcus epidermidis продемонстрировал наиболее сильную связь с неприятным запахом, когда обе возрастные группы были проанализированы совместно (дополнительный файл 1: рисунок S7, таблица), хотя тенденция постоянно наблюдалась в каждой возрастной группе и во временные точки до и. после тренировки. Напротив, на шее Staphylococcus hominis было связано с интенсивностью неприятного запаха, но только у детей ( ρ = 0,65) и с низкой корреляцией, наблюдаемой у подростков ( ρ = 0.09; Дополнительный файл 1: рисунок S7, таблица). Интересно, что фаг Staphylococcus также обнаружил положительную корреляцию с неприятным запахом, что потенциально обусловлено ассоциацией его видов-хозяев и подчеркивает важность взаимодействия фага-бактерии на коже [19, 20]. Этот анализ дополнительно подчеркивает важную роль, которую виды Staphylococcus играют в неприятном запахе у детей, и определяет их конкретный вклад в различных участках тела и возрастных группах [5, 8].
A Cutibacterium видов ( C. avidum ) был единственным другим организмом с устойчивой ассоциацией с более сильным неприятным запахом, особенно в подмышечной области, хотя его значение остается неясным. Другие виды Cutibacterium ( C. granulosum , C. acnes ) были отрицательно связаны с неприятным запахом в области шеи (таблица), возможно, из-за межбактериальной конкуренции с видами Staphylococcus [21, 22]. Corynebacterium видов ( C.pseudogenitalium и C. tuberculostearicum ) положительно коррелировали с интенсивностью запаха в подмышечной области, но с постоянным увеличением относительной численности после упражнений, наблюдаемым только у подростков (таблица). Поскольку известно, что виды Corynebacterium продуцируют запахи серы [23, 24], это наблюдение может быть отражением того факта, что в микробиоме кожи подмышек до полового созревания отсутствуют предшественники из апокринной секреции, чтобы поддерживать их метаболизм в сернистый неприятный запах.
Интересно, что видов Acinetobacter (в частности, A. schindleri ) были обогащены в области шеи детей с более низкой интенсивностью неприятного запаха, а также в 1-часовой временной точке. Пути, задействованные у этих видов в ослаблении восприятия неприятного запаха, неясны, но один из возможных механизмов — это конкуренция с другими микробами через разложение предшественников неприятного запаха на алифатические молекулы [25]. В соответствии с нашим более ранним анализом (дополнительный файл 1: рис. S5), не было обнаружено, что микробы связаны с неприятным запахом в области головы.
В целом, эти анализы подчеркивают различные микробные ассоциации с запахом тела и то, что различное распределение ключевых микробных факторов и компонентов запаха по людям, участкам тела, возрастным группам и временным точкам может играть роль в образовании запаха. Примечательно, что анализ микробиома на уровне родов не смог выявить ключевые ассоциации в подмышечной области (дополнительный файл 1: таблица S3), что подчеркивает важность видовых различий и сильные стороны метагеномного анализа дробовика для изучения микробов, связанных с неприятным запахом.В частности, наши результаты подчеркивают доминирующую роль, которую S. epidermidis может играть в неприятном запахе подмышек с кислыми характеристиками, который мы часто отмечали у детей и, в некоторой степени, у подростков (рис. D). Переходный период полового созревания приводит к усилению преобладания серы в запахе, и сдвиги в активности Staphylococcus и Corynebacterium могут способствовать этому [5] . Мы дополнительно исследуем эти отношения в следующем разделе с помощью анализа путей, связанных с неприятным запахом, в микробиоме кожи.
Идентификация продукции изовалериановой и уксусной кислоты как ключевого пути, связанного с неприятным запахом, у детей и подростков
В рамках плана исследования пот тела был собран у субъектов, объединен и использован для различных анализов (высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), жидкостная хроматография и газовая хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ / ГХМС)) для выявления предшественников запаха, которые могут по-разному присутствовать у детей и подростков (см. Раздел «Материалы и методы»).Этот анализ показал, что молочная кислота была самым распространенным предшественником у детей и подростков, за ней следовали глицерин (больше у подростков), изолейцин и лейцин (дополнительный файл 1: таблица S4). Затем объединенный пот инкубировали в течение 24 часов для измерения продукции молекул, связанных с неприятным запахом, с использованием GC-ольфактометрии (GC-O) и анализа GCMS (дополнительный файл 1: рисунок S8 и дополнительный файл 2: таблица S5). В целом, дети и подростки выявили схожие профили GCMS и GC-O, причем подростки были более богаты доминирующими соединениями — уксусной кислотой и изовалериановой кислотой.Эти два сильнодействующих одоранта имеют характер кислого / кислого запаха, что позволяет предположить, что наблюдаемый «букет кислинки» у наших испытуемых в значительной степени обусловлен этими двумя одорантами.
На основе этой информации мы затем перешли к функциональному анализу, чтобы обнаружить гены и пути, связанные с неприятным запахом, in vivo и на основе данных. Мы использовали подход, аналогичный тому, который использовался для таксономического анализа, чтобы идентифицировать гены и начальный набор путей, коррелирующих с интенсивностью неприятного запаха, и тех, которые чрезмерно представлены после физических упражнений и образования потоотделения (см. Раздел «Материалы и методы»; Дополнительный файл 2: Таблица S6 ).Затем значительно ассоциированные гены были агрегированы в путях, чтобы понять их вклад в производство соединений, вызывающих неприятный запах. Сначала мы использовали подход «мешка генов», который обычно используется в метагеномике, агрегируя изобилие генов без учета таксономического происхождения считываний, чтобы найти ассоциации с неприятным запахом. Однако сопоставление идентифицированных генов с путями не выявило устойчивых ассоциаций внутри пути (например, Дополнительный файл 1: Рисунок S9), вероятно, из-за присутствия нескольких родственных видов (например.g., S. epidermidis и S. hominis ) с явным вкладом в неприятный запах. Напротив, анализ «мешка геномов», который включал видовую идентичность генов, выдвинул на первый план несколько значимых и последовательных ассоциаций путей и соответствующий вклад видов (дополнительный файл 2: таблица S7).
В частности, в подмышечной области метаболизм пирувата и метаболизм аминокислот с разветвленной цепью были обогащены генами S. epidermidis , которые значительно положительно коррелировали с неприятным запахом, что согласуется с нашим таксономическим анализом (рис.а) . Ферменты, полученные из S. epidermidis , участвуют в каскаде множества метаболических путей, ведущих к выработке как уксусной кислоты, связанной с кислым запахом, так и изовалериановой кислоты. Молочная кислота и глицерин превращаются в пируват в процессе гликолиза. В присутствии пирувата ферменты, ответственные за биосинтез и последующее разложение лейцина, валина и изолейцина с образованием изовалериановой кислоты жирной кислоты с разветвленной цепью (например, ключевые ферменты ацетолактатсинтазы (EC: 2.2.1.6) и трансаминазы аминокислот с разветвленной цепью (EC: 2.6.1.42)), как было обнаружено, в значительной степени связаны с неприятным запахом (рис. B, c). Независимым путем было обнаружено, что ферменты, участвующие в окислительной деградации алифатических карбоксилатов пирувата до ацетил-КоА (конверсия Свансона) в процессе, который является ключевым для производства уксусной кислоты и кислого запаха, связаны с неприятным запахом у S. epidermidis (Рис. D; например, пируватдегидрогеназа (EC: 1.2.4.1)). Эти результаты согласуются с ранее опубликованными исследованиями in vitro [10].Подобные пути были также связаны с неприятным запахом в шее, но на этот раз ассоциации были замечены в первую очередь с генами S. hominis и, что более важно, у детей (рис.).
Пути и ферменты, связанные с производящими кислый запах соединениями в подмышечной области. a Количество ферментов (КО), кодируемых микробами, связанными с неприятным запахом, в подмышечной области для путей «биосинтеза / разложения валина, лейцина и изолейцина» и «метаболизма пирувата» KEGG. Цифры в столбиках указывают количество КО, относительное содержание которых в значительной степени коррелирует с интенсивностью запаха. b — d Соответствующие диаграммы путей KEGG, где розовые прямоугольники указывают на значимые положительно коррелированные КО в S. epidermidis среди подростков, а серые прямоугольники указывают на ферменты, которые присутствуют, но не имеют значительной корреляции с интенсивностью запаха. Соединения, вызывающие запах, и их прекурсоры отмечены звездочкой (*).
Пути и ферменты, связанные с соединениями, вызывающими кислый запах, в области шеи. a Количество ферментов (КО), кодируемых микробами, связанными с неприятным запахом, в области шеи для путей «биосинтеза / разложения валина, лейцина и изолейцина» и «метаболизма пирувата» KEGG.Цифры в столбиках указывают количество КО, относительное содержание которых в значительной степени коррелирует с интенсивностью запаха. b — d Соответствующие диаграммы путей KEGG, где розовые прямоугольники указывают на значимые положительно коррелированные KO у Staphylococcus видов среди детей, а серые прямоугольники указывают на ферменты, которые присутствуют, но не имеют значительной корреляции с интенсивностью запаха. Соединения, вызывающие запах, и их прекурсоры отмечены звездочкой (*)
3-метил-3-сульфанилгексанол (3M3SH), 3-метил-2-гексеновая кислота (3M2H) и 3-метил-3-гидроксигексановая кислота. (HMHA) — известные одоранты, ответственные за запах подмышек у взрослых [7].Для производства 3-метил-3-сульфанилгексанола (3M3SH), который связан с неприятным запахом с характеристиками серы, мы наблюдали положительную связь с обоими видами Staphylococcus ( S. hominis и S. epidermidis ; дополнительный файл 1: Рисунок S10). Предыдущие наблюдения in vitro продемонстрировали способность S. hominis , но не S. epidermidis , генерировать 3MS3H [5]. Наши метагеномные результаты указывают на присутствие цистатионин-бета-лиазы в S.epidermidis , что позволяет предположить, что кроме S. hominis , штаммы S. epidermidis , выделенные в азиатских популяциях, также могут генерировать 3M3SH. Для подтверждения этой возможности необходимы дальнейшие эксперименты in vitro. Для 3M2H и HMHA наш анализ GCMS обнаружил отсутствие или минимальное присутствие этих одорантов. Кроме того, наши метагеномные данные не выявили присутствия Corynebacterium striatum и фермента аминоацилазы (agaA; у детей и подростков), которые, как было показано, опосредуют продукцию HMHA [23].Эти данные показывают, что эти молекулы вряд ли будут основными причинами неприятного запаха в наших когортах по сравнению с их ключевой ролью у взрослых [14].
Чтобы проверить связь видов Staphylococcus с характеристиками кислого запаха, мы культивировали изоляты в стерилизованных пулах пота, полученных от субъектов, включенных в исследование, и измерили продукцию различных соединений с неприятным запахом с помощью анализа GCMS (см. Раздел «Материалы и методы» ). В то время как оба вида Staphylococcus были способны продуцировать значительные количества уксусной кислоты и изовалериановой кислоты, другие виды, обычно встречающиеся на коже, такие как C.acnes и M. luteus — нет (рис.). Эти результаты подчеркивают основную роль видов Staphylococcus в производстве уксусной кислоты, изовалериановой кислоты и 3M3SH из предшественников запаха в поте и в объяснении характеристик запаха кислого и серного, наблюдаемого у азиатских детей и подростков.
Способность превращать предшественники пота в соединения, вызывающие неприятный запах, у различных микробов кожи. GCMS — результат инокуляции одной бактерии в течение 24 часов в поте, собранном у субъектов.Обратите внимание, что только S. epidermidis и S. hominis продуцируют значительные количества уксусной кислоты и изовалериановой кислоты, что согласуется с ассоциациями, наблюдаемыми in vivo. Эксперименты с культивированием проводились в аэробных условиях.
Обсуждение
Неприятный запах — это фенотип, который, как хорошо известно, возникает в результате специфических взаимодействий между предшественниками запаха хозяина и поддерживаемым ими микробным метаболизмом [6]. В этом отношении данное исследование служит идеальной испытательной площадкой для изучения аналитических подходов к раскрытию метаболических взаимодействий между хозяином и микробиомом, которые определяют интересующий фенотип.В то время как неприятный запах у взрослых и европейцев широко изучался [5, 6, 9], неприятный запах у азиатов и особенно у детей и подростков не получил должного внимания. Наши исследования показывают, что это действительно проблема потребительского интереса, которая влияет на качество жизни пострадавших детей, предполагая, что ее влияние на психологическое благополучие детей заслуживает дальнейшего исследования.
При разработке исследования по выявлению видов и путей распространения микробов, связанных с неприятным запахом, необходимо учитывать несколько аспектов, включая возможность того, что могут быть таксоны, которые медленно растут, но сильно связаны с неприятным запахом, в то время как другие могут вызывать неприятный запах только тогда, когда они достаточно обильный.Таким образом, наш дизайн включал как продольные (использование упражнений для создания предшественников пота и запаха), так и поперечные аспекты в разных возрастных группах, чтобы в целом уловить различные сигналы ассоциации. Наши данные показывают, что в большинстве случаев имеются согласованные сигналы от продольного и поперечного анализов, за исключением видов Corynebacterium и M. globosa в подмышечных впадинах детей, чье явное снижение относительной численности при физических упражнениях (несмотря на положительную корреляцию с неприятным запахом) может быть связано с их более медленным ростом по сравнению с S.Эпидермодис . Кроме того, данные этого исследования подчеркивают различные микробные факторы, влияющие на запах тела в разных возрастных группах и участках тела, например, было обнаружено, что S. hominis имеет сильную связь с неприятным запахом в области шеи у детей, в то время как область подмышек показала значимая связь с S. epidermidis . И это несмотря на обилие S. hominis в подмышечной области, что позволяет предположить, что здесь играют роль различия в предшественниках пота из области шеи и подмышек и что S.epidermidis может иметь чрезмерный эффект в отношении образования неприятного запаха, когда присутствуют правильные предшественники.
Предыдущая работа по изучению микробного вклада в неприятный запах подмышек в первую очередь подчеркивала роль видов Corynebacterium [7] у взрослых. Используя секвенирование 16S рРНК, эти исследования показали, что виды Corynebacterium , Staphylococcus и Cutibacterium являются доминирующими бактериями в подмышечной области [9, 26–28]. Из них видов Corynebacterium оказались более многочисленными, чем видов Staphylococcus в группах лиц, не использующих антиперспиранты или дезодоранты [26].Также было обнаружено, что неприятный запах в подмышечной впадине взрослых обычно определяется характеристиками серы или прогорклого запаха от 3M3SH, 3M2H и HMHA, генерируемых в основном видами Corynebacterium [7, 9, 29]. Для сравнения, наше исследование показывает, что видов Corynebacterium менее многочисленны у детей и подростков, а видов Staphylococcus более многочисленны. Это различие может быть частично связано с тем, что микросреда подмышечной впадины у детей и подростков формируется эккринной секрецией.Хотя технические различия в профилировании метагенома также могут влиять на эти сравнения, мы отмечаем, что метагеномика дробовика и профилирование 16S рРНК показали хорошее соответствие в предыдущем исследовании [17]. Кроме того, в этом исследовании было обнаружено, что кислый запах чаще встречается у детей, и, соответственно, наш анализ подчеркнул центральную роль видов Staphylococcus в запахе тела у детей. Среди Staphylococcus видов, тогда как в большинстве более ранних исследований изучалась роль S.haemolyticus и S. hominis [5, 23], наша работа является первой, которая определяет роль S. epidermidis в возникновении неприятного запаха из подмышек у детей. Это имеет серьезные последствия с точки зрения мер по борьбе с неприятным запахом — в то время как основной подход для взрослых использует антиперспиранты для контроля образования неприятного запаха медленнорастущими видами Cornybacterium , противомикробные препараты могут быть более подходящими для быстрорастущих видов Staphylococcus у детей в качестве антиперспирантов. было замечено, что они относительно обогащают их [26].Кроме того, поскольку S. epidermidis является важным кожным комменсалом [30], могут потребоваться методы лечения следующего поколения, которые блокируют активность определенных ферментов, выявленных в этом исследовании.
Что касается влияния генетики хозяина на неприятный запах, несколько исследований описали ассоциацию аллелей ABCC11 с запахом тела у взрослых и показали, что люди, несущие аллели GG / GA, имеют усиленный запах из-за генерации 3M3SH, 3M2H, и HMHA из апокринового пота [15, 16, 31].Большинство населения Филиппин (от ~ 72 до 78%) имеет аллель GG / GA, и, следовательно, взрослые на Филиппинах более подвержены неприятному запаху с серными / прогорклыми характеристиками [15, 32]. У детей до полового созревания апокринные железы не полностью активированы [12], и, таким образом, прекурсоры эккринового происхождения могут играть более значительную роль в наблюдаемых характеристиках запаха. Апокринные железы сравнительно более активны у подростков, чей профиль неприятного запаха, как ожидается, будет более похож на профиль взрослых.Эти ожидания совпадают с нашими наблюдениями более высокой интенсивности запаха у подростков по сравнению с детьми и перехода к более серным характеристикам у подростков.
Наш биоинформатический анализ в этом исследовании еще раз высветил проблемы подхода «мешка генов» к изучению функции микробиома с метагеномными данными. Микробы обмениваются метаболитами контролируемым образом, и предположение, что несколько этапов метаболического процесса могут выполняться у разных видов в «метагеноме», не всегда может быть целесообразным [33, 34].Кроме того, ферменты разных видов, принадлежащие к одному и тому же классу ферментов, могут иметь очень разную эффективность и субстратную специфичность [35], например, объясняя, почему S. epidermidis ассоциировался с неприятным запахом из подмышек у детей, а S. hominis — нет. . Эта проблема проиллюстрирована недавним отчетом, показывающим, что метагеномные конвейеры могут выделять очень разные функциональные пути с использованием одного и того же набора данных [36]. Переход к анализу «мешка геномов» может обеспечить лучшую интерпретируемость наборов метагеномных данных, но существенным ограничением является возможность идентифицировать разные гены, принадлежащие одному и тому же геному.Усовершенствованные подходы к кластеризации и сборке, обеспеченные достижениями в технологии секвенирования, могут помочь устранить эти ограничения в будущем [37, 38].
Насколько нам известно, это первый отчет, в котором описаны таксоны, которые отрицательно коррелируют с неприятным запахом, но механизм их действия остается неясным. Эти ассоциации могут быть вызваны различными причинами, включая (а) производство соединений, которые маскируют неприятный запах или имеют более низкую интенсивность запаха (как предлагается здесь для P. avidum ), (б) микробная конкуренция или ингибирование, ведущее к уменьшению роста неприятного запаха; ассоциированные виды (как было описано между Malassezia и Staphylococcus видов [39]), и (c) метаболические процессы, которые приводят к тому, что ключевые предшественники запаха становятся недоступными для образования соединений неприятного запаха.Проведенные здесь культуральные эксперименты с человеческим потом предоставили уникальную основу для реалистичного моделирования доступности прекурсоров и подчеркнули вклад видов Staphylococcus в образование запаха. Дальнейшие эксперименты с консорциумами бактерий могут помочь изучить взаимодействия между ними и, таким образом, определить механизмы уменьшения неприятного запаха.
Материалы и методы
Дизайн клинического исследования
Для этого исследования были набраны две группы субъектов: (1) 15 детей, состоящих из 8 женщин и 7 мужчин, в возрасте от 5 до 9 лет и (2) 15 подростков, состоящих из 8 женщин. и 7 мужчин от 15 до 18 лет.В начале исследования (0 ч) испытуемым давали для душа стандартное кусковое мыло (без антимикробных активных веществ и отдушек). Через час после душа назначенный профессиональный парфюмер оценил интенсивность запаха (диапазон от 0 до 100) и характер в области подмышек, задней части шеи и кожи головы. Образцы микробиома были собраны сразу после этого для каждого участка путем снятия ленты (D100 D-squame, CuDerm). Каждую полоску ленты прикладывали десять раз к коже со стандартизованным давлением в течение 1 с и помещали в 1.Пробирка Эппендорфа 5 мл на льду. Затем испытуемые выполняли 4–5 часов интенсивных упражнений в среде с температурой 32 ° C и относительной влажностью 66%. Вкратце, испытуемые были разделены на группы, чтобы выполнять комбинацию физических нагрузок (беговая дорожка, езда на велосипеде в помещении, аэробика и баскетбол) поочередно под руководством профессионального инструктора. Физические нагрузки выполнялись с интервалом 10–15 мин с перерывом 10–15 мин. Во время перерыва были собраны образцы пота, и участники поддерживали водный баланс.В 8-часовой временной точке, интенсивность запаха, характер запаха и образцы микробиома были собраны снова, как описано выше (левая или правая подмышка выбирались случайным образом, но оставались неизменными по временным точкам). Испытуемые находились в среде без кондиционирования воздуха в течение 8 часов.
Обработка образцов и экстракция ДНК
Ленточные полоски переносили в пробирки Lysing Matrix E (MP Biomedicals) и добавляли 500 мкл буфера ATL (Qiagen). Образцы подвергали взбиванию шариками с помощью прибора FastPrep-24 (MP Biomedicals) на скорости 6.0 м / с в течение 40 с. Затем образцы центрифугировали при 16000 г в течение 5 минут, 200 мкл супернатанта обрабатывали 10 мкл протеиназы K (Qiagen) и инкубировали при 56 ° C в течение 15 минут. ДНК экстрагировали с помощью EZ1 Advanced XL Instrument (Qiagen) с набором EZ1 DNA Tissue Kit (Qiagen) с объемом элюции 100 мкл и количественно определяли с помощью набора Qubit dsDNA HS Assay Kit (Life Technologies), а затем хранили в морозильной камере — 20 ° C. .
Подготовка библиотеки, комбинаторное объединение и секвенирование
Стандартный объем экстрагированной ДНК в 50 мкл подвергали сдвигу с использованием Adaptive Focused Acoustics ™ (Covaris).Библиотеки ДНК получали с использованием основного набора Gene Read DNA Library I (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя, за исключением использования пользовательских адаптеров вместо набора адаптеров GeneRead I. Пользовательские индексные праймеры использовали для обогащения библиотек ДНК, которое выполняли в соответствии с протоколом обогащения, адаптированным из набора олигонуклеотидов для подготовки мультиплексных образцов (Illumina). Количественную оценку библиотек проводили с использованием Agilent Bioanalyzer, подготовленного с помощью набора Agilent High Sensitivity DNA Kit или Agilent DNA1000 Kit (Agilent Technologies).
Чтобы избежать пакетных эффектов, объединение библиотеки всего метагенома было выполнено комбинаторным способом (дополнительный файл 2: таблица S8). Что касается подмышек, образцы от детей и подростков были равномерно разделены на две партии подготовки библиотеки, причем каждая партия содержала равное количество детей, подростков, образцов с более сильным неприятным запахом и более слабым неприятным запахом. Библиотеки образцов от детей были затем объединены в эквимолярных количествах на одной полосе, а библиотеки образцов от подростков на другой дорожке.Для областей шеи и головы библиотеки были построены путем подготовки образцов от одного и того же объекта (1 час и 8 часов) один за другим, чередуя детей и подростков, а также образцов с более сильным неприятным запахом и более слабым неприятным запахом. Образцы с каждого сайта сбора были объединены в один пул. Парное секвенирование (считывание 2 × 101 п.н.) было выполнено на успешных библиотеках ДНК с использованием платформы Illumina HiSeq 2000.
Предварительная обработка чтения
После демультиплексирования чтения были отфильтрованы с помощью программного обеспечения Bcl2fastq (CASAVA version 1.8.4) от Illumina, и FastQC был выполнен для оставшихся чтений (Pass Filter Reads). Основания секвенирования с показателями качества ниже 30 были обрезаны с 5′- и 3′-концов каждого считывания, а считывания с длиной менее 30 нуклеотидов были удалены. Человеческие чтения были отфильтрованы путем сопоставления с человеческим геномом (GRCh48) с использованием BWA-MEM [40] (версия 0.7.13-r1126; параметры по умолчанию), оставив после себя 4,71 миллиарда нечеловеческих парных и одноэлементных считываний.
Таксономическая классификация
Таксономическое профилирование образцов было выполнено по всем таксономическим рангам с использованием MetaPhlAn2 [41] (версия 2.5.0; параметры по умолчанию). MetaPhlAn2 использует гены-маркеры клады, охватывающие бактериальные, архейные, вирусные и эукариотические микробы, для выполнения однозначных таксономических задач. Метагеном каждого образца анализировали независимо для вычисления относительной численности. Затем выходные файлы были объединены в единую таблицу с указанием относительной численности на образец (столбцы) и на микроб (строка). Таксоны со средней относительной численностью> 1% у детей или подростков были консервативно определены для каждого участка тела для дальнейшего статистического анализа.
Функциональное профилирование
HUMAnN2 [33] (v0.7.1; параметры по умолчанию) было запущено с базой данных белков UniRef90 для получения функциональных профилей для каждого метагенома. HUMAnN2 обеспечивает (i) численность каждого семейства ортологичных генов UnifRef, указанную в виде числа чтений на килобазу (RPK), (ii) численность путей MetaCyc в RPK и (iii) охват каждого пути MetaCyc, масштабируемое от 0 до 1. Ген Семьи и пути со средними значениями RPK> 10 по выборкам от детей или подростков были сохранены и были повторно нормализованы до относительной численности для последующего анализа ассоциации, в то время как путь MetaCyc рассматривался для дальнейшего статистического анализа только в том случае, если средний охват путей по всем образцам было> 0.3. В целом, мы идентифицировали 69 792, 65 939 и 45 684 уникальных семейства генов из метагеномов подмышек, шеи и головы, соответственно. Для путей MetaCyc существует 89 (подмышками), 103 (шея) и 83 (голова) путей, которые соответствуют указанным выше критериям. Процент считываний, назначенных семействам и путям генов, а также считываний без назначения можно найти в Дополнительном файле 2: Таблица S9. Вклад каждого таксона в семейство генов и путь также определяли на основе таксономического назначения каждого считывания из выходов HUMAnN2.Вклад в семейство генов был визуализирован путем сопоставления идентификаторов UniRef90 с идентификаторами ортологической группы KEGG в путях KEGG [42] (версия обновлена в феврале 2016 г.).
Статистический анализ
Многомерный анализ для оценки ассоциаций между интенсивностью запаха, возрастом и микробными сообществами до и после тренировки был выполнен с использованием подхода канонического анализа основных координат (с несходством Брея-Кертиса), реализованного в веганском R-пакете ( версия 2.4-3).Существенные связи между таксонами / функциями микробов и неприятным запахом были выявлены с помощью комбинации статистических тестов, в которых (i) коэффициент корреляции Спирмена между интенсивностью запаха и таксонами / функциями микробов использовался для поперечного анализа и (ii) ранговый критерий Вилкоксона для анализа численность до и после тренировки использовалась для продольного анализа. Значения p были скорректированы с использованием подхода Бенджамини-Хохберга, и все статистические анализы были выполнены в R.Для путей, которые считались обнаруженными, было проведено ассоциативное тестирование для молодежи, детей и подростков, чтобы выявить те, у которых скорректированные по FDR значения p <0,1, по крайней мере, в двух из шести сравнений в качестве возможных путей для дальнейшего анализа на уровне генов.
Выделение микробов из подмышечной области у субъектов
В этом исследовании микробы были собраны в асептических условиях путем мазка подмышечной области с использованием предварительно увлажненного (стерильного 0,15 M NaCl + 0.1% раствор Твин 20) тампоны из хлопка (Puritan Med). Образец мазка от субъекта с наивысшей интенсивностью запаха помещали на кровяной агар TSA (Thermo Fisher Scientific) и инкубировали при 37 ° C в течение ночи. Репрезентативные одиночные колонии на основе морфологии были отобраны и недавно субкультивированы для масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF (Bruker) для идентификации видов. Идентификация видов была дополнительно подтверждена секвенированием 16S рРНК (Charles River). Выбранные представляющие интерес бактерии ( Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus hominis, Cutibacterium acnes и Micrococcus luteus ) затем суспендировали в криогенных гранулах (Thermo Fisher Scientific) и хранили в морозильной камере — 80 ° C.
Сбор пота и эксперименты по культивированию
Человеческий пот собирали из области подмышек и шеи у нескольких человек в этом исследовании, используя 1,5 мл пробирки Эппендорфа, объединяли в стерильные 50 мл пробирки и хранили при 4 ° C. Затем смесь секрета пота стерилизовали центрифугированием 3000, г, × 10 мин и стерильными шприцевыми фильтрами с размером пор 0,2 мкм (Millipore). Бактериальные изоляты были свежеприготовлены в течение ночи и собраны на следующий день, когда OD 600 достигнет 1.0. После этого следовало центрифугирование при 3000 g в течение 10 мин, полученный осадок промывали стерильным 0,01 М фосфатным буфером (pH 6,0) и повторно суспендировали в 10 мл свободного от бактерий пула пота. Эти свежеприготовленные образцы пула бактерий и пота инкубировали в орбитальном шейкере в аэробных условиях при 120 об / мин, 37 ° C в течение 24 часов. Каждый эксперимент включал отрицательные контроли (10 мл стерилизованного фильтром пула пота без бактериальной инокуляции) в тех же условиях, что и выше. Все эксперименты проводились в аэробных условиях.
Аналитическое определение кислых предшественников и отдушек
Лейцин и изолейцин измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Вкратце, 0,2 мл образца вносили пипеткой в центрифужную пробирку на 15 мл. После этого добавляли 4,8 мл 0,05 н. Соляной кислоты и диспергировали образец с помощью вихревой мешалки. Полученный раствор фильтровали через шприц из ПВДФ 0,45 мкм и смешивали с 0,1 мл натрий-боратного буфера (pH 10,2) и 0,2 мл раствора NBD-F в 2-миллилитровом желтом флаконе для ВЭЖХ.После плотного закрытия крышки флакон нагревали в печи при 60 ° C в течение 5 минут, затем охлаждали перед добавлением 0,4 мл 0,05 н. Соляной кислоты и вводом в ВЭЖХ для анализа. Измерение глицерина проводилось с помощью GC-FID. Пять миллилитров пота лиофилизировали в течение ночи с последующим добавлением в пробирку 0,2 мл воды и 1,8 мл экстракционного растворителя. Затем образец фильтровали через шприц из ПВДФ 0,45 мкм в пробирку для ГХ для анализа.
Чтобы измерить уровень молочной кислоты в поту, сначала создайте калибровочную кривую, используя 0.0, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0 и 5,0 частей на миллион стандарта молочной кислоты были установлены путем мониторинга массы иона m / z89 в выбранном ионном режиме (SIM) в анализе ЖХ / МС (ABSciex 4000 QTRAP). Затем образцы пота разбавляли в 500 раз с использованием метанола / воды (1: 1) и вводили в систему ЖХ / МС для анализа, и из образцов получали площади пиков массового числа молочной кислоты (m / z89). . Уровни молочной кислоты определяли путем сравнения площадей пиков образцов и откликов калибровочной кривой.
pH собранной пробы пота (10 мл) доводили до 12,0 добавлением NaOH (Wako), и лиофилизацию проводили в течение 2 дней. После лиофилизации в каждую пробирку с остатками добавляли 1 мл HCl (50% разбавление 37% HCl) (Sigma) с последующим встряхиванием и центрифугированием при 4000 об / мин и 20 ° C в течение 20 минут. Полученный супернатант переносили в пробирку Эппендорфа, добавляли 150 мкл хлороформа (Sigma) с последующим встряхиванием и центрифугированием при 14800 об / мин и 4 ° C в течение 20 мин.Затем фракции хлороформа объединяли и 10 мкл объединенной среды вводили в прибор GCMS для анализа. Agilent GC 7890B / MSD 5977A (Agilent, Wilmington, DE, USA) с автосамплером Gerstel MPS2 -TDU-CIS4 (Gerstel, Германия) использовали для разделения и анализа соединений запаха тела. ГХ-МС был оснащен колонкой DB-Wax, 60 мм × 0,25 мм с толщиной пленки 0,25 мкм (Agilent, Делавэр, США). Использовался режим впрыска жидкости большого объема — начальная температура инжектора была на уровне 10 ° C, уравновешенная на 0.В течение 5 минут использовали линейное изменение скорости 12 ° C / мин до конечной температуры 220 ° C, затем выдерживали в течение 5 минут. Объем инъекции составлял 10 мкл. Температуру печи поддерживали на уровне 40 ° C в течение 2 минут, повышали до 220 ° C со скоростью 3 ° C / мин и выдерживали в течение 4 минут. Расход газа-носителя гелия был постоянным и составлял 1,2 мл / мин. Масс-спектрометр работал при энергии ионизации 70 эВ со скоростью четыре сканирования / с в диапазоне м / z 29–450 и температуре источника ионов 230 ° C. Идентификацию структур / соединений проводили с использованием библиотеки Национального института стандартов и технологий (NIST’11) и внутренней библиотеки P&G MS с коммерчески доступными стандартами.ГХ-ольфактометрия выполнялась при первом запуске. Обонятельные измерения проводились тем же профессиональным парфюмером, который оценивал характеристики и интенсивность запаха у участников этого исследования.
Дополнительные файлы
Дополнительные файлы 2: (92K, zip)Таблица S2. Оценка запаха и данные метагеномного секвенирования для всех образцов в этом исследовании. Таблица S5. GC-ольфактометрия пота, взятого у детей и подростков. Таблица S6. Обнаруженные пути MetaCyc, которые, как было установлено, связаны с неприятным запахом, на основании значений обилия путей из HUMAnN2.Для области головы значимой ассоциации не обнаружено. Таблица S7. Ключевые пути, связанные с производством неприятного запаха, и их таксономические факторы. Таблица S8. Информация о том, как образцы были распределены в партиях для подготовки библиотеки и секвенирования, чтобы избежать эффекта партии. Таблица S9. Считывает сопоставленные (%) семейств генов UniRef90 и пути MetaCyc. (ZIP 92 кб)
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Серену Хейз и Сару Аршад за помощь в проверке содержания рукописи.
Финансирование
Эта работа финансировалась грантом SPF для сотрудничества A * STAR-P&G (APG2013 / 032). Финансовая поддержка компании Procter & Gamble, Цинциннати, Огайо, была использована для разработки и проведения части исследования.
Сокращения
3M2H | 3-метил-2-гексеновая кислота |
3M3SH | 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-гексанол 3-метил-4-гексановая кислота |
HPLC | Высокоэффективная жидкостная хроматография |
LC / GCMS | Жидкостная хроматография и газовая хроматография-масс-спектрометрия |
Вклад авторов
YL, DS, PLN, JL, DS, PLN и задумал это исследование.PB, AHQN и DS участвовали в метагеномном секвенировании. PH, JT, RK, TMUT, JL и MO участвовали в культивировании и масс-спектрометрическом анализе. THL и DV проанализировали метагеномные данные под наблюдением PL и NN. THL и NN написали рукопись при участии всех авторов. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.
Примечания
Утверждение этических норм и согласие на участие
Исследование было проведено, и все образцы были собраны PRICEPTS Inc. (PRICE Product Testing Services Incorporated) в Маниле с одобрения Институционального обзора Сингапурского инновационного центра Procter & Gamble (Сингапур) Правления и в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (поправка 1996 г.).Руководства ICH по надлежащей клинической практике (GCP) были соблюдены, и добровольное информированное согласие было предоставлено с одобрения Совета по этике исследований P&G. Это клиническое исследование соответствовало руководящим принципам STROBE для наблюдательных исследований на людях. Матери, которые согласились принять участие в исследовании своих детей, подписали форму информированного согласия, а подростки, которые согласились участвовать, подписали форму согласия.
Согласие на публикацию
Не применимо.
Конкурирующие интересы
Несколько соавторов (Л.Y. D.S. P.L. J.L. P.B. P.H. J.T. R.K. T.T. M.O.) участвовал и / или проводил это исследование, будучи сотрудником компании Procter & Gamble. Эти соавторы могут владеть акциями компании, но прямой финансовой выгоды или убытков от публикации этой рукописи не ожидается. Согласно требованиям трудовых обязательств компании Procter & Gamble по соблюдению конфиденциальности, эти соавторы не могут заявлять о патентной деятельности.
Примечание издателя
Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и принадлежностей организаций.
Информация для авторов
Цзе Хау Лам, электронная почта: [email protected].
Давиде Верзотто, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@dottozrev.
Пурбита Брахма, электронная почта: [email protected].
Аманда Хуэй Ци Нг, электронная почта: [email protected].
Пин Ху, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@aqhgn.
Дэн Шнелл, электронная почта: [email protected].
Джей Тисман, электронная почта: [email protected].
Ронг Конг, электронная почта: [email protected].
Thi My Uyen Ton, электронная почта: [email protected].
Цзяньцзюнь Ли, электронная почта: [email protected].
May Ong, электронная почта: [email protected].
Ян Лу, электронная почта: [email protected].
Дэвид Суэйл, электронная почта: [email protected].
Пинг Лю, электронная почта: [email protected].
Цзицюань Лю, электронная почта: [email protected].
Ниранджан Нагараджан, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@nnajaragan.
Ссылки
1. Такахаши Л.К., Накашима Б.Р., Хонг Х., Ватанабэ К. Запах опасности: поведенческий и нейронный анализ страха, вызванного запахом хищника.Neurosci Biobehav Rev.2005; 29: 1157–1167. DOI: 10.1016 / j.neubiorev.2005.04.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Стокли П., Боттелл Л., Херст Дж. Л. Проснитесь и почувствуйте конфликт: запаховые сигналы в соревнованиях женщин. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2013; 368: 20130082. DOI: 10.1098 / rstb.2013.0082. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Киёкава Ю. Социальные запахи: феромоны тревоги и социальная буферизация. Curr Top Behav Neurosci. 2017; 30: 47–65. DOI: 10.1007 / 7854_2015_406. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4.Портер Р. Х., Чернох Дж. М., Балог Р. Д.. Сигнатуры запаха и распознавание родства. Physiol Behav. 1985; 34: 445–448. DOI: 10.1016 / 0031-9384 (85)-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Боудон Дэниел, Кокс Диана С., Эшфорд Дэвид, Джеймс А. Гордон, Томас Гэвин Х. Идентификация подмышечного стафилококка. участвует в производстве зловонного тиоспирта 3-метил-3-суфанилгексан-1-ола. Письма о микробиологии FEMS. 2015; 362 (16): fnv111. DOI: 10.1093 / femsle / fnv111. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Джеймс А.Г., Остин С.Дж., Кокс Д.С., Тейлор Д., Калверт Р.Микробиологическое и биохимическое происхождение запаха из подмышек человека. FEMS Microbiol Ecol. 2013; 83: 527–540. DOI: 10.1111 / 1574-6941.12054. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Fredrich E, Barzantny H, Brune I, Tauch A. Ежедневная борьба с запахом тела: в сторону активности подмышечной микробиоты. Trends Microbiol. 2013; 21: 305–312. DOI: 10.1016 / j.tim.2013.03.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Бек ХК, Хансен AM, Лауритсен FR. Катаболизм лейцина в жирные кислоты с разветвленной цепью у Staphylococcus xylosus.J Appl Microbiol. 2004. 96: 1185–1193. DOI: 10.1111 / j.1365-2672.2004.02253.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Troccaz M, et al. Картирование подмышечной микробиоты, ответственной за запах тела, с использованием независимого от культуры подхода. Микробиом. 2015; 3: 3. DOI: 10.1186 / s40168-014-0064-3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Джеймс А.Г., Хилиандс Д., Джонстон Х. Генерация летучих жирных кислот подмышечными бактериями. Int J Cosmet Sci. 2004. 26: 149–156. DOI: 10.1111 / j.1467-2494.2004.00214.Икс. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Лу К., Фукс Э. Предшественники потовых желез в развитии, гомеостазе и заживлении ран. Перспективы Колд-Спринг-Харбор в медицине. 2014; 4 (2): a015222 – a015222. DOI: 10.1101 / cshperspect.a015222. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Вилке К., Мартин А., Терстеген Л., Биль СС. Краткая история биологии потовых желез. Int J Cosmet Sci. 2007. 29: 169–179. DOI: 10.1111 / j.1467-2494.2007.00387.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Тибуто Д.Регулирование работы сальных желез человека. J Invest Dermatol. 2004; 123: 1–12. DOI: 10.1111 / j.1523-1747.2004.t01-2-.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Harker M, et al. Функциональная характеристика SNP в аллеле ABCC11 — влияние на метаболизм кожи в подмышечных впадинах, формирование запаха и связанное с ним поведение. J Dermatol Sci. 2014; 73: 23–30. DOI: 10.1016 / j.jdermsci.2013.08.016. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Мартин А. и др. Функциональный аллель ABCC11 играет важную роль в биохимическом формировании запаха из подмышечных впадин человека.J Invest Dermatol. 2010; 130: 529–540. DOI: 10.1038 / jid.2009.254. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Chng KR, et al. Профилирование всего метагенома выявляет зависимую от микробиома кожи восприимчивость к обострению атопического дерматита. Nat Microbiol. 2016; 1: 16106. DOI: 10.1038 / nmicrobiol.2016.106. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Чибани-Ченнуфи С., Бруттин А., Диллманн М.Л., Брюссоу Х. Взаимодействие фага-хозяина: экологическая перспектива. J Bacteriol. 2004. 186: 3677–3686. DOI: 10.1128 / JB.186.12.3677-3686.2004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Шу М. и др. Ферментация Propionibacterium acnes, комменсальной бактерии в микробиоме кожи человека, в качестве кожных пробиотиков против метициллин-резистентных
Staphylococcus aureus . ПлоС один. 2013; 8: e55380. DOI: 10.1371 / journal.pone.0055380. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Christensen GJ, et al. Антагонизм между Staphylococcus epidermidis и Propionibacterium acnes и его геномная основа.BMC genomics. 2016; 17: 152. DOI: 10.1186 / s12864-016-2489-5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Natsch A, Gfeller H, Gygax P, Schmid J, Acuna G. Специфическая бактериальная аминоацилаза расщепляет предшественники одоранта, секретируемые в подмышечной впадине человека. J Biol Chem. 2003; 278: 5718–5727. DOI: 10.1074 / jbc.M210142200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Эмтер Р., Натч А. Последовательное действие дипептидазы и бета-лиазы требуется для высвобождения одоранта человеческого тела 3-метил-3-сульфанилгексан-1-ола из секретируемого конъюгата Cys-Gly- (S) посредством Коринебактерии.J Biol Chem. 2008; 283: 20645–20652. DOI: 10.1074 / jbc.M800730200. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Ионеску Г., Константиниу С. Биология рода Acinetobacter. Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol. 2004. 49: 157–174. [PubMed] [Google Scholar] 26. Урбан Дж. И др. Влияние привычного и экспериментального использования антиперспирантов и дезодорантов на микробиом подмышек. PeerJ. 2016; 4: e1605. DOI: 10.7717 / peerj.1605. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Callewaert C, et al.Характеристика скоплений стафилококков и коринебактерий в подмышечной области человека. ПлоС один. 2013; 8: e70538. DOI: 10.1371 / journal.pone.0070538. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 28. Совет Сара Э., Сэвидж Эми М., Урбан Джули М., Элерс Меган Э., Скин Дж. Х. Пейт, Платт Майкл Л., Данн Роберт Р., Хорват Джули Э. Разнообразие и эволюция микробиома кожи приматов. Труды Королевского общества B: биологические науки. 2016; 283 (1822): 20152586. DOI: 10.1098 / РСПБ.2015.2586. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Troccaz M, et al. Гендерные различия между концентрациями нелетучих (R) / (S) -3-метил-3-сульфанилгексан-1-Ol и (R) / (S) -3-гидрокси-3-метил-гексановой кислоты предшественников запаха в подмышечные выделения. Chem Senses. 2009; 34: 203–210. DOI: 10.1093 / chemse / bjn076. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Прокоп-Пригге К.А., Грин К., Варалло Л., Высоцкий К.Дж., Прети Г. Влияние этнической принадлежности на производство одоранта в подмышечных впадинах человека.J Chem Ecol. 2016; 42: 33–39. DOI: 10.1007 / s10886-015-0657-8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 32. Йошиура К. и др. SNP в гене ABCC11 является детерминантом типа ушной серы человека. Нат Жене. 2006. 38: 324–330. DOI: 10,1038 / нг1733. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33. Abubucker S, et al. Метаболическая реконструкция метагеномных данных и ее применение к микробиому человека. PLoS Comput Biol. 2012; 8: e1002358. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1002358. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34.van der Ark KCH, van Heck RGA, Martins Dos Santos VAP, Belzer C, de Vos WM. Больше, чем просто интуиция: основанные на ограничениях метаболические модели в масштабе генома для прогнозирования функций кишечных микробов человека. Микробиом. 2017; 5: 78. DOI: 10.1186 / s40168-017-0299-х. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Тилинг Х, Глокнер Ф. Текущие возможности и проблемы в анализе микробного метагенома — биоинформатическая перспектива. Краткий биоинформ. 2012; 13: 728–742. DOI: 10,1093 / bib / bbs039.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Франк Дж. А. и др. Улучшенные сборки метагеномов и таксономическое объединение с использованием данных длинных циклических согласованных последовательностей. Научный доклад 2016; 6: 25373. DOI: 10,1038 / srep25373. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 40. Ли Х, Дурбин Р. Быстрое и точное согласование короткого чтения с преобразованием Барроуза-Уиллера. Биоинформатика. 2009; 25: 1754–1760. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btp324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 42.Kanehisa M, Sato Y, Kawashima M, Furumichi M, Tanabe M. KEGG как справочный ресурс для аннотации генов и белков. Nucleic Acids Res. 2016; 44: D457 – D462. DOI: 10.1093 / нар / gkv1070. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]Понимание микробной основы запаха тела у детей и подростков до полового созревания
Microbiome. 2018; 6: 213.
, 1 , 2 , 1 , 2 , 3 , 3 , 3 , 1 , 1 , 4 , 1 , 1 , 4 , 1 , 1 и 2, 5Tze Hau Lam
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Сингапур, 13854741 Давид Верзот
2 Вычислительная и системная биология, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
Purbita Brahma
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Amanda Hui Qi Ngutational
2 Computing и системной биологии, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
Ping Hu
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Dan Schnell 9 0041
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Jay Tiesman
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Rong Kong
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Singapore, 138547 Singapore
Thi My Uyen Ton
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Singapore, 138547 Singapore
Jianjun Li
4 Procter & Gamble Sharon Woods Innovation Center, Sharonville, OH 45241 США
May Ong
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Ян Лу
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Дэвид Свайл
4 0002 9000 Procter & Gamble Центр инноваций Шэрон Вудс, Шаронвилл, Огайо 45241 СШАПинг Лю
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Цзицюань Лю
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Ниранджан Нагараджан
2 Институт вычислительной и системной биологии of Singapore, Singapore, 138672 Singapore
5 Медицинская школа Yong Loo Lin, Национальный университет Сингапура, Сингапур, 119228 Сингапур
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
2 Вычислительный и системной биологии, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
4 Procter & Gamble Sharon Woods Innovation Center, Sharonville, OH 45241 USA
5 Медицинский факультет Юн Лу Линя, Национальный университет Сингапур, Сингапур, 119228 Сингапур
Автор, ответственный за переписку.Поступило 28.05.2018 г .; Принято 2 ноября 2018 г.
Открытый доступ Эта статья распространяется в соответствии с условиями Международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы должным образом укажете автора (авторов) и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения. Отказ от лицензии Creative Commons Public Domain Dedication (http: // creativecommons.org / publicdomain / zero / 1.0 /) применяется к данным, представленным в этой статье, если не указано иное. Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.- Дополнительные материалы
Дополнительный файл 1: Рисунки S1-S10 , Таблицы S1, S3 и S4 . (PDF 3276 кб)
GUID: 4D6F7D72-9FB1-448F-A881-A5C17FD171DD
Дополнительный файл 2: Таблица S2. Оценка запаха и данные метагеномного секвенирования для всех образцов в этом исследовании. Таблица S5. GC-ольфактометрия пота, взятого у детей и подростков. Таблица S6. Обнаруженные пути MetaCyc, которые, как было установлено, связаны с неприятным запахом, на основании значений обилия путей из HUMAnN2. Для области головы значимой ассоциации не обнаружено. Таблица S7. Ключевые пути, связанные с производством неприятного запаха, и их таксономические факторы. Таблица S8. Информация о том, как образцы были распределены в партиях для подготовки библиотеки и секвенирования, чтобы избежать эффекта партии. Таблица S9. Считывает сопоставленные (%) семейств генов UniRef90 и пути MetaCyc. (ZIP, 92 кб)
GUID: 36CA9ED0-CC48-4DB0-8510-8A2BEB1497C8
- Заявление о доступности данных
Наборы данных, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны в Европейском архиве нуклеотидов в рамках проекта id ERP1084 https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB26427).
Аннотация
Предпосылки
Несмотря на то, что человеческий пот не имеет запаха, считается, что рост бактерий и разложение определенных предшественников запаха в нем вызывает запах тела у людей.Хотя механизмы образования запаха широко изучены у взрослых, мало что известно о подростках и детях, не достигших полового созревания, у которых состав пота отличается от незрелых апокринных и сальных желез, но, возможно, они более восприимчивы к социальному и психологическому воздействию неприятного запаха.
Результаты
Мы интегрировали информацию из анализа всего микробиома нескольких участков кожи (подмышки, шея и голова) и нескольких временных точек (1 час и 8 часов после ванны), проанализировав в общей сложности 180 образцов для проведения самого большого метагенома. проведенное ассоциацией исследование неприятного запаха.Значительные положительные корреляции наблюдались между интенсивностью запаха и относительной численностью Staphylococcus hominis , Staphylococcus epidermidis и Cutibacterium avidum , а также отрицательная корреляция с видами Acinetobacter schindleri и Cutibacterium. Анализ метаболических путей выявил связь продукции изовалериановой и уксусной кислот (кислый запах) из обогащенных S. epidermidis (подростковая подмышечная область) и S.hominis (детская шея) и продукция серы из Staphylococcus видов (подмышечная впадина подростка) с интенсивностью запаха, что хорошо согласуется с наблюдаемыми характеристиками запаха у детей и подростков в предпубертатном возрасте. Эксперименты с культурами человеческого и искусственного пота подтвердили способность S. hominis и S. epidermidis независимо производить неприятный запах с отчетливыми характеристиками запаха.
Выводы
Эти результаты демонстрируют возможности метагеномики кожи для изучения ко-метаболических взаимодействий между хозяином и микробами, выявления различных путей образования запаха от пота у детей и подростков в предполовозрелом возрасте и выделения ключевых ферментативных мишеней для вмешательства.
Электронные дополнительные материалы
Онлайн-версия этой статьи (10.1186 / s40168-018-0588-z) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.
Введение
Запах тела в животном мире часто играет важную роль в защите от хищников и выживании [1–3]. Считается, что у людей обонятельные сигналы играют роль в обнаружении родства и выборе партнера [4]. Несмотря на эти функции, запах тела, как правило, вызывает сильную социальную стигматизацию, а его социальное и психологическое воздействие на затронутых субъектов до конца не изучено.
Считается, что запах тела у людей в первую очередь опосредован бактериальным разложением естественно секретируемых, не пахнущих компонентов пота, особенно жирных кислот, алифатических аминокислот с разветвленной цепью, глицерина и молочной кислоты, происходящих из эккринных, апокринных и сальных желез. железы [5–8]. В исследованиях у взрослых с использованием секвенирования маркерных генов (16S рРНК) и других подходов, ряд бактерий, но в первую очередь видов Corynebacterium , были связаны с неприятным запахом [6, 9, 10].Кроме того, определенные бактериальные ферменты и пути, которые воздействуют на непахучие белковые предшественники или продуцируют молекулы запаха, такие как уксусная кислота, летучие жирные кислоты, сульфанилы и тиоспирты, также были идентифицированы с использованием подходов, основанных на культуре [5-7, 10, 11] . Однако существуют значительные различия между физиологией, связанной с запахом, и микробиотой кожи взрослых и не взрослых. Например, апокриновые железы (в основном находящиеся в местах тела с волосяными фолликулами, например, в подмышечной впадине) неактивны до тех пор, пока не будут стимулированы гормональными изменениями в период полового созревания, и в отличие от эккринных желез, которые секретируют непрерывно, апокриновые железы секретируют периодически [12].Эккриновый пот (прозрачный, без запаха, pH 4,0–6,8, на 98–99% состоит из воды, но также содержащий хлорид натрия, жирные кислоты, молочную кислоту, лимонную кислоту, аскорбиновую кислоту, мочевину и мочевую кислоту) и апокриновый пот (без запаха, pH 6,0–7,5, содержащие воду, белки, углеводы, липиды и стероиды) имеют различный состав и распределение (все участки тела против внутренних волосяных фолликулов) [13]. Кроме того, сальные железы, которые выделяют маслянистое вещество без запаха, называемое кожным салом, в волосяные фолликулы (pH 4,5–5,5), имеют повышенную активность в период полового созревания [14].Таким образом, запах тела обычно считается значимым только у лиц, достигших полового созревания, и у взрослых, и в основном он изучался в области подмышечной впадины, где количество апокринных желез превышает количество эккринных желез в 10 раз.
Большинство исследований неприятного запаха проводилось в умеренном климате и на субъектах из Европы и Северной Америки. Считается, что азиаты, особенно выходцы из Восточной Азии, генетически предрасположены к уменьшению неприятного запаха [15, 16]. Однако жаркая и влажная тропическая среда может увеличить выделение потоотделения и связанное с этим возникновение неприятного запаха.Основываясь на обширных исследованиях в контексте Юго-Восточной Азии, мы определили, что запах тела действительно является серьезной проблемой для детей и подростков, не достигших полового созревания, как с точки зрения оценок родителей, так и с точки зрения экспертных оценок (дополнительный файл 1: таблица S1). Влияние неприятного запаха в детстве на эмоциональное, социальное и психологическое благополучие субъектов является неизведанной областью, но, вероятно, вызывает большее беспокойство, чем неприятный запах взрослых. Более того, поскольку секреция апокринных желез у детей неактивна, метаболические взаимодействия между хозяином и микробами, которые приводят к неприятному запаху, остаются невыясненными.
Для решения этой темы мы набрали когорту детей и подростков до полового созревания на Филиппинах, которые были оценены профессиональным парфюмером на предмет определения интенсивности запаха (диапазон 0–100) и характера (например, сладкого, жирного, прогорклого, кислого и т. hircine, сера), в дополнение к оценке их родителей (дополнительный файл 2: таблица S2). В план исследования входили отбор образцов из нескольких участков тела (шея, подмышки, голова), связанных с запахом тела, а также из нескольких временных точек после ванны и активного отдыха, чтобы систематически понять микробную основу запаха тела у этих людей.В общей сложности 180 образцов были подвергнуты глубокому анализу секвенирования всего метагенома, что позволило нам изучить членов бактериального, вирусного и эукариотического сообществ и их функциональную связь с неприятным запахом. Мультимодальный анализ, сочетающий регрессию к интенсивности запаха и дифференциальные сигнатуры до и после активного отдыха, использовался для выявления таксонов и функций микробов, связанных с неприятным запахом у детей (5–9 лет) и подростков (15–18 лет). Эти подписи частично перекрываются (например, S.hominis ), но также отличные от того, что было зарегистрировано во взрослых когортах. В целом, наше исследование подчеркивает важность перехода от «мешка генов» к анализу метагеномов «мешка геномов» для всестороннего изучения метаболических взаимодействий между хозяином и микробами.
Результаты
Отчетливая интенсивность запаха и характеристики, связанные с различными частями тела у детей и подростков
Наше исследование было основано на двух разных возрастных группах лиц: дети предпубертатного возраста (5–9 лет) и подростки (15–18 лет). лет), что позволяет более детально изучить микробную основу неприятного запаха на ранних этапах жизни (см. раздел «Материалы и методы», рис.a, Дополнительный файл 2: Таблица S2). В то время как подмышечная впадина (подмышечная впадина) была основным местом исследования неприятного запаха, исследования потребителей показали, что неприятный запах из области шеи (затылка) и головы (средняя часть волосистой части головы) также является областью, вызывающей беспокойство у семей, и поэтому были включены в это исследование ( Дополнительный файл 1: Таблица S1). Субъекты оценивались в двух временных точках, разделенных 7 часами отдыха и упражнений для образования потоотделения, что обеспечивало хорошо подходящую экспериментальную установку для учета вариабельности между хозяевами и исследования того, как микробы превращают предшественники пота в неприятный запах (рис.а). Кроме того, первая временная точка была сделана через 1 час после душа, что обеспечило стандартизованный исходный уровень для всех людей. Образцы были взяты в тот же день и в тот же день на Филиппинах (Манила) при относительно постоянной температуре окружающей среды 32 ° C и влажности 66%.
Дизайн исследования и взаимосвязь между интенсивностью запаха, характеристиками запаха, возрастом и участками тела. a Схема с подробным описанием целевых групп исследования, номеров образцов и точек времени сбора. b Распределение интенсивности запаха по участкам тела до (1 ч) и после (8 ч) упражнений и по возрастным группам (дети и подростки; ** p -значение <0.05, * p -значение <0,1). c Линии тренда, показывающие взаимосвязь между различными характеристиками запаха и интенсивностью запаха на разных участках тела (1 = присутствует, 0 = отсутствует). d Относительное распределение кислого запаха и запаха серы у субъектов до (1 ч) и после (8 ч) упражнений по возрастным группам и участкам тела. Точками отмечена интенсивность запаха, как показано на левой оси, в то время как гистограммы показывают количество субъектов, как показано на правой оси
В дополнение к группам запахов, оцененным родителями (дополнительный файл 2: таблица S2), запах оценивался одним профессиональным парфюмером. интенсивность и характер во всех предметах, местах и во все моменты времени.Как и ожидалось, интенсивность запаха, измеренная профессиональным парфюмером, была значительно выше в подмышках у детей и подростков после физических упражнений (тест Вилкоксона p — значение <0,05) (рис. B). Незначительное увеличение интенсивности запаха было также обнаружено в области шеи и головы у подростков и детей, соответственно (критерий Вилкоксона p — значение <0,1). У подростков раньше была более высокая интенсивность запаха, чем у детей в подмышечной области (тест Вилкоксона , p -значение = 2.4 × 10 — 4 ) и после (тест Вилкоксона p -значение = 2,6 × 10 — 4 ) упражнений, и в целом интенсивность запаха была ниже в области шеи и головы по сравнению с областью подмышек. Что касается характеристик запаха, то в области подмышек и шеи наблюдались кислые запахи и запахи серы со средней и высокой интенсивностью запаха, соответственно (рис. C). Напротив, область головы в первую очередь характеризовалась жирным запахом, подчеркивая, что разные области тела, вероятно, имеют разный микробный метаболизм, способствующий возникновению неприятного запаха.Анализ характеристик запаха по возрастным группам и временным точкам показал, что, в то время как дети в первую очередь определяются характеристиками запаха кислого или кислого + серы, подростки с большей вероятностью будут иметь характеристику кислый + сера, которая смещается к доминирующей характеристике серы после упражнений (рис. D). . Однако это свойство, по-видимому, характерно для подмышек, а в области шеи и головы как у детей, так и у подростков преобладает кислый запах (рис. D). Эти наблюдения обеспечивают важный фон для нашего анализа микробного вклада в неприятный запах в следующих разделах.
Особенности микробиома кожи в разных возрастных группах и в связи с неприятным запахом
Для изучения таксономического и функционального состава микробиома кожи в нашей когорте образцы были собраны с использованием недавно установленного протокола снятия ленты [17], обеспечивающего достаточное количество ДНК для построения метагеномные библиотеки дробовика для 100% наших образцов и ни одного из контрольных образцов (коллекционные и лабораторные контроли). Глубокое секвенирование на платформе Illumina было использовано для характеристики образцов микробиома кожи для всех людей, участков и временных точек (180 образцов, ~ 69 миллионов считываний в среднем; дополнительный файл 2: таблица S2).В среднем чтения были высокого качества (> Q30), при этом более 98% чтений можно было использовать после качественной фильтрации (дополнительный файл 2: таблица S2). Используя метагеномные данные для перекрестного анализа царств, мы отметили, что разные участки тела демонстрировали различное распределение уровней царства (дополнительный файл 1: рисунок S1). Бактерии в большей степени присутствовали в образцах подмышек (тест Вилкоксона p — значение <3 × 10 — 4 ), в то время как эукариоты были сравнительно более многочисленными на детских головах (тест Вилкоксона p — значение <2 × 10 — 9 ), а образцы шеи имели уникально более высокую относительную долю вирусов (тест Вилкоксона p — значение <7 × 10 — 3 ).Повышенное количество вирусов и эукариот в областях головы и шеи аналогично тому, что наблюдалось в близлежащих участках (ретроаурикулярная складка, затылок) у взрослых, что свидетельствует об уникальных нишах, которые они предлагают [18].
Определенные сигнатуры микробиома появились для каждого участка тела на уровне видов и рода бактерий (дополнительный файл 1: рисунки S2, S3), несмотря на наличие явных различий между микробиомами подростков и детей (рисунок а, дополнительный файл 1: Рисунок S4).Например, Staphylococcus hominis является наиболее распространенным видом бактерий в подмышечной области, несмотря на заметные различия между детьми и подростками (70% против 37%; тест Вилкоксона p -значение <5 × 10 — 4 ). Точно так же, хотя повышенное присутствие M. globosa и C. acnes отличает шею и голову от подмышек, у детей на голове относительно больше M. globosa , тогда как у подростков преобладают C.acnes (рис. а, дополнительный файл 1: рис. S3, S4). Эти различия коррелируют с изменениями активности апокринных желез в период полового созревания и могут служить основой для различий в характеристиках неприятного запаха между детьми и подростками. Кроме того, у всех субъектов было гораздо меньшее количество видов Corynebacterium в подмышечных впадинах, чем то, что наблюдалось у взрослых [9], что позволяет предположить, что отдельные виды могут играть роль в неприятном запахе в этих возрастных группах.
Связь между микробиомом кожи, интенсивностью запаха, возрастом и временем отбора проб. a Относительная численность кожных микробов (> 0,1%) на разных участках на уровне родов и видов. Данные представлены как средняя относительная численность внутри группы. b Диаграммы распределения для канонического анализа основных координат (CAP), иллюстрирующие силу связи между интенсивностью запаха, возрастом, временем отбора проб и микробиомом кожи. Анализ CAP основан на несходстве Брея-Кертиса. Размер каждой точки представляет собой оценку относительной интенсивности запаха в каждом образце, а число, перекрывающее каждую точку, указывает образцы, собранные до (1) или после (8) упражнения
Канонический анализ основных координат изменения микробиома кожи на разных участках тела в отношение к возрастной группе, полу и временным точкам (1 час или 8 часов) дополнительно иллюстрирует силу связи между интенсивностью запаха, возрастом, временем отбора проб и микробиомом кожи (рис.б). В подмышечной области конкретные возрастные группы и время отбора образцов хорошо коррелируют с интенсивностью запаха (значение p <0,001) и в меньшей степени с полом (значение p <0,05) в зависимости от состава микробиома кожи. Этот образец также наблюдается на шее, но не имеет значения на голове, где существует более сильная связь с полом (дополнительный файл 1: рисунок S5). Состав микробиома в области головы также уникален тем, что не кажется, что он заметно меняется после тренировки.Одна из возможностей для этого - ограниченное воздействие душа на микробиом кожи головы по сравнению с другими участками, поскольку микробы, находящиеся в волосяном фолликуле, делают микробиом кожи головы более стабильным и эластичным.
Виды Staphylococcus сильно коррелируют с интенсивностью запаха у детей и подростковМы отметили, что дети, принадлежащие к определенным родителями категориям («неприятный запах» и «без неприятного запаха»), не демонстрировали существенно различающуюся интенсивность запаха, как это определено профессиональным парфюмером. , по возрастным группам и временным точкам (Дополнительный файл 1: Рисунок S6), потенциально подчеркивая проблемы, связанные с тем, чтобы при таком анализе полагаться исключительно на восприятие потребителей.Однако группы «неприятного запаха» действительно показали тенденцию к более высокой интенсивности запаха, и эта разница может достигать статистической значимости при больших размерах выборки. Вместо проведения категориального анализа в этом исследовании мы искали таксоны и функции микробов, которые напрямую связаны с определяемой парфюмером интенсивностью запаха (см. Раздел «Материалы и методы»). Кроме того, доступность данных из двух временных точек, до и после тренировки, в дальнейшем использовалась для определения таксонов и функций микробов, которые изменяются в долгосрочном плане в связи с повышенным выделением пота и запаха (см. Раздел «Материалы и методы», Дополнительный файл 1: Рисунок S7, таблица).
Таблица 1
Список микробов на уровне видов, которые показывают значительную корреляцию с интенсивностью запаха, по крайней мере, в одной возрастной группе
Виды | Молодежь | Дети | Подростки | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Спирмена 18 4 902 Wilcoxon | Spearman’s ρ | Wilcoxon | Spearman’s ρ | Wilcoxon | | |||||||
ρ | p -значение | p -значение | ρ | p -значение | p -значение | ρ | p -значение | p -значение | ||||
Подмышки | ||||||||||||
Staphylococcus epidermidis | 0.67 | 5 × 10 −7 | ↑ | 0,04 | 0,44 | н.у. | ↑ | н.у. | 0,40 | н.у. | ↑ | н.у. |
Cutibacterium avidum | 0,63 | 5 × 10 −6 | ↑ | н.у. | 0,52 | н.у. | ↑ | н.у. | 0,31 | н.у. | ↑ | н.у. |
Corynebacterium pseudogenitalium | 0.44 | 10 −2 | ↓ | н.у. | 0,42 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,13 | н.у. | ↑ | н.у. |
Corynebacterium tuberculostearicum | 0,38 | 0,06 | ↓ | н.у. | 0,35 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,18 | н.у. | ↑ | н.у. |
Malassezia globosa | 0.53 | 7 × 10 −4 | ↓ | н.у. | 0,37 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,33 | н.у. | ↑ | н.у. |
Шея | ||||||||||||
Staphylococcus hominis | 0,32 | n.s. | ↑ | н.у. | 0,65 | 10 −2 | ↑ | н.у. | 0,09 | н.у. | ↑ | н.с. |
Staphylococcus phage StB27 | 0,49 | 0,02 | ↑ | n.s. | 0,77 | 10 −4 | ↑ | н.у. | 0,19 | н.у. | ↑ | н.у. |
Cutibacterium granulosum | — 0,45 | 0,03 | ↓ | 0,06 | — 0,48 | н.у. | ↓ | н.у. | — 0,38 | н.у. | ↓ | н.у. |
Acinetobacter schindleri | — 0,43 | 0,03 | ↓ | 0,07 | — 0,47 | н.у. | ↓ | н.у. | — 0,30 | н.у. | ↓ | н.у. |
Cutibacterium acnes | — 0,28 | n.s. | ↓ | н.у. | — 0.54 | 0,08 | ↓ | н.у. | — 0,21 | н.у. | ↓ | н.у. |
В целом, между поперечным и продольным анализом наблюдались устойчивые тенденции, где таксоны, которые были положительно коррелированы с неприятным запахом, также увеличивались в изобилии после упражнений (таблица). Анализ по возрастным группам выявил ключевые различия между группами; хотя в некоторых случаях тонкие, но устойчивые тенденции усиливались путем объединения данных по возрастным группам (обозначенным как «Молодежь»).Например, в подмышечной области Staphylococcus epidermidis продемонстрировал наиболее сильную связь с неприятным запахом, когда обе возрастные группы были проанализированы совместно (дополнительный файл 1: рисунок S7, таблица), хотя тенденция постоянно наблюдалась в каждой возрастной группе и во временные точки до и. после тренировки. Напротив, на шее Staphylococcus hominis было связано с интенсивностью неприятного запаха, но только у детей ( ρ = 0,65) и с низкой корреляцией, наблюдаемой у подростков ( ρ = 0.09; Дополнительный файл 1: рисунок S7, таблица). Интересно, что фаг Staphylococcus также обнаружил положительную корреляцию с неприятным запахом, что потенциально обусловлено ассоциацией его видов-хозяев и подчеркивает важность взаимодействия фага-бактерии на коже [19, 20]. Этот анализ дополнительно подчеркивает важную роль, которую виды Staphylococcus играют в неприятном запахе у детей, и определяет их конкретный вклад в различных участках тела и возрастных группах [5, 8].
A Cutibacterium видов ( C. avidum ) был единственным другим организмом с устойчивой ассоциацией с более сильным неприятным запахом, особенно в подмышечной области, хотя его значение остается неясным. Другие виды Cutibacterium ( C. granulosum , C. acnes ) были отрицательно связаны с неприятным запахом в области шеи (таблица), возможно, из-за межбактериальной конкуренции с видами Staphylococcus [21, 22]. Corynebacterium видов ( C.pseudogenitalium и C. tuberculostearicum ) положительно коррелировали с интенсивностью запаха в подмышечной области, но с постоянным увеличением относительной численности после упражнений, наблюдаемым только у подростков (таблица). Поскольку известно, что виды Corynebacterium продуцируют запахи серы [23, 24], это наблюдение может быть отражением того факта, что в микробиоме кожи подмышек до полового созревания отсутствуют предшественники из апокринной секреции, чтобы поддерживать их метаболизм в сернистый неприятный запах.
Интересно, что видов Acinetobacter (в частности, A. schindleri ) были обогащены в области шеи детей с более низкой интенсивностью неприятного запаха, а также в 1-часовой временной точке. Пути, задействованные у этих видов в ослаблении восприятия неприятного запаха, неясны, но один из возможных механизмов — это конкуренция с другими микробами через разложение предшественников неприятного запаха на алифатические молекулы [25]. В соответствии с нашим более ранним анализом (дополнительный файл 1: рис. S5), не было обнаружено, что микробы связаны с неприятным запахом в области головы.
В целом, эти анализы подчеркивают различные микробные ассоциации с запахом тела и то, что различное распределение ключевых микробных факторов и компонентов запаха по людям, участкам тела, возрастным группам и временным точкам может играть роль в образовании запаха. Примечательно, что анализ микробиома на уровне родов не смог выявить ключевые ассоциации в подмышечной области (дополнительный файл 1: таблица S3), что подчеркивает важность видовых различий и сильные стороны метагеномного анализа дробовика для изучения микробов, связанных с неприятным запахом.В частности, наши результаты подчеркивают доминирующую роль, которую S. epidermidis может играть в неприятном запахе подмышек с кислыми характеристиками, который мы часто отмечали у детей и, в некоторой степени, у подростков (рис. D). Переходный период полового созревания приводит к усилению преобладания серы в запахе, и сдвиги в активности Staphylococcus и Corynebacterium могут способствовать этому [5] . Мы дополнительно исследуем эти отношения в следующем разделе с помощью анализа путей, связанных с неприятным запахом, в микробиоме кожи.
Идентификация продукции изовалериановой и уксусной кислоты как ключевого пути, связанного с неприятным запахом, у детей и подростков
В рамках плана исследования пот тела был собран у субъектов, объединен и использован для различных анализов (высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), жидкостная хроматография и газовая хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ / ГХМС)) для выявления предшественников запаха, которые могут по-разному присутствовать у детей и подростков (см. Раздел «Материалы и методы»).Этот анализ показал, что молочная кислота была самым распространенным предшественником у детей и подростков, за ней следовали глицерин (больше у подростков), изолейцин и лейцин (дополнительный файл 1: таблица S4). Затем объединенный пот инкубировали в течение 24 часов для измерения продукции молекул, связанных с неприятным запахом, с использованием GC-ольфактометрии (GC-O) и анализа GCMS (дополнительный файл 1: рисунок S8 и дополнительный файл 2: таблица S5). В целом, дети и подростки выявили схожие профили GCMS и GC-O, причем подростки были более богаты доминирующими соединениями — уксусной кислотой и изовалериановой кислотой.Эти два сильнодействующих одоранта имеют характер кислого / кислого запаха, что позволяет предположить, что наблюдаемый «букет кислинки» у наших испытуемых в значительной степени обусловлен этими двумя одорантами.
На основе этой информации мы затем перешли к функциональному анализу, чтобы обнаружить гены и пути, связанные с неприятным запахом, in vivo и на основе данных. Мы использовали подход, аналогичный тому, который использовался для таксономического анализа, чтобы идентифицировать гены и начальный набор путей, коррелирующих с интенсивностью неприятного запаха, и тех, которые чрезмерно представлены после физических упражнений и образования потоотделения (см. Раздел «Материалы и методы»; Дополнительный файл 2: Таблица S6 ).Затем значительно ассоциированные гены были агрегированы в путях, чтобы понять их вклад в производство соединений, вызывающих неприятный запах. Сначала мы использовали подход «мешка генов», который обычно используется в метагеномике, агрегируя изобилие генов без учета таксономического происхождения считываний, чтобы найти ассоциации с неприятным запахом. Однако сопоставление идентифицированных генов с путями не выявило устойчивых ассоциаций внутри пути (например, Дополнительный файл 1: Рисунок S9), вероятно, из-за присутствия нескольких родственных видов (например.g., S. epidermidis и S. hominis ) с явным вкладом в неприятный запах. Напротив, анализ «мешка геномов», который включал видовую идентичность генов, выдвинул на первый план несколько значимых и последовательных ассоциаций путей и соответствующий вклад видов (дополнительный файл 2: таблица S7).
В частности, в подмышечной области метаболизм пирувата и метаболизм аминокислот с разветвленной цепью были обогащены генами S. epidermidis , которые значительно положительно коррелировали с неприятным запахом, что согласуется с нашим таксономическим анализом (рис.а) . Ферменты, полученные из S. epidermidis , участвуют в каскаде множества метаболических путей, ведущих к выработке как уксусной кислоты, связанной с кислым запахом, так и изовалериановой кислоты. Молочная кислота и глицерин превращаются в пируват в процессе гликолиза. В присутствии пирувата ферменты, ответственные за биосинтез и последующее разложение лейцина, валина и изолейцина с образованием изовалериановой кислоты жирной кислоты с разветвленной цепью (например, ключевые ферменты ацетолактатсинтазы (EC: 2.2.1.6) и трансаминазы аминокислот с разветвленной цепью (EC: 2.6.1.42)), как было обнаружено, в значительной степени связаны с неприятным запахом (рис. B, c). Независимым путем было обнаружено, что ферменты, участвующие в окислительной деградации алифатических карбоксилатов пирувата до ацетил-КоА (конверсия Свансона) в процессе, который является ключевым для производства уксусной кислоты и кислого запаха, связаны с неприятным запахом у S. epidermidis (Рис. D; например, пируватдегидрогеназа (EC: 1.2.4.1)). Эти результаты согласуются с ранее опубликованными исследованиями in vitro [10].Подобные пути были также связаны с неприятным запахом в шее, но на этот раз ассоциации были замечены в первую очередь с генами S. hominis и, что более важно, у детей (рис.).
Пути и ферменты, связанные с производящими кислый запах соединениями в подмышечной области. a Количество ферментов (КО), кодируемых микробами, связанными с неприятным запахом, в подмышечной области для путей «биосинтеза / разложения валина, лейцина и изолейцина» и «метаболизма пирувата» KEGG. Цифры в столбиках указывают количество КО, относительное содержание которых в значительной степени коррелирует с интенсивностью запаха. b — d Соответствующие диаграммы путей KEGG, где розовые прямоугольники указывают на значимые положительно коррелированные КО в S. epidermidis среди подростков, а серые прямоугольники указывают на ферменты, которые присутствуют, но не имеют значительной корреляции с интенсивностью запаха. Соединения, вызывающие запах, и их прекурсоры отмечены звездочкой (*).
Пути и ферменты, связанные с соединениями, вызывающими кислый запах, в области шеи. a Количество ферментов (КО), кодируемых микробами, связанными с неприятным запахом, в области шеи для путей «биосинтеза / разложения валина, лейцина и изолейцина» и «метаболизма пирувата» KEGG.Цифры в столбиках указывают количество КО, относительное содержание которых в значительной степени коррелирует с интенсивностью запаха. b — d Соответствующие диаграммы путей KEGG, где розовые прямоугольники указывают на значимые положительно коррелированные KO у Staphylococcus видов среди детей, а серые прямоугольники указывают на ферменты, которые присутствуют, но не имеют значительной корреляции с интенсивностью запаха. Соединения, вызывающие запах, и их прекурсоры отмечены звездочкой (*)
3-метил-3-сульфанилгексанол (3M3SH), 3-метил-2-гексеновая кислота (3M2H) и 3-метил-3-гидроксигексановая кислота. (HMHA) — известные одоранты, ответственные за запах подмышек у взрослых [7].Для производства 3-метил-3-сульфанилгексанола (3M3SH), который связан с неприятным запахом с характеристиками серы, мы наблюдали положительную связь с обоими видами Staphylococcus ( S. hominis и S. epidermidis ; дополнительный файл 1: Рисунок S10). Предыдущие наблюдения in vitro продемонстрировали способность S. hominis , но не S. epidermidis , генерировать 3MS3H [5]. Наши метагеномные результаты указывают на присутствие цистатионин-бета-лиазы в S.epidermidis , что позволяет предположить, что кроме S. hominis , штаммы S. epidermidis , выделенные в азиатских популяциях, также могут генерировать 3M3SH. Для подтверждения этой возможности необходимы дальнейшие эксперименты in vitro. Для 3M2H и HMHA наш анализ GCMS обнаружил отсутствие или минимальное присутствие этих одорантов. Кроме того, наши метагеномные данные не выявили присутствия Corynebacterium striatum и фермента аминоацилазы (agaA; у детей и подростков), которые, как было показано, опосредуют продукцию HMHA [23].Эти данные показывают, что эти молекулы вряд ли будут основными причинами неприятного запаха в наших когортах по сравнению с их ключевой ролью у взрослых [14].
Чтобы проверить связь видов Staphylococcus с характеристиками кислого запаха, мы культивировали изоляты в стерилизованных пулах пота, полученных от субъектов, включенных в исследование, и измерили продукцию различных соединений с неприятным запахом с помощью анализа GCMS (см. Раздел «Материалы и методы» ). В то время как оба вида Staphylococcus были способны продуцировать значительные количества уксусной кислоты и изовалериановой кислоты, другие виды, обычно встречающиеся на коже, такие как C.acnes и M. luteus — нет (рис.). Эти результаты подчеркивают основную роль видов Staphylococcus в производстве уксусной кислоты, изовалериановой кислоты и 3M3SH из предшественников запаха в поте и в объяснении характеристик запаха кислого и серного, наблюдаемого у азиатских детей и подростков.
Способность превращать предшественники пота в соединения, вызывающие неприятный запах, у различных микробов кожи. GCMS — результат инокуляции одной бактерии в течение 24 часов в поте, собранном у субъектов.Обратите внимание, что только S. epidermidis и S. hominis продуцируют значительные количества уксусной кислоты и изовалериановой кислоты, что согласуется с ассоциациями, наблюдаемыми in vivo. Эксперименты с культивированием проводились в аэробных условиях.
Обсуждение
Неприятный запах — это фенотип, который, как хорошо известно, возникает в результате специфических взаимодействий между предшественниками запаха хозяина и поддерживаемым ими микробным метаболизмом [6]. В этом отношении данное исследование служит идеальной испытательной площадкой для изучения аналитических подходов к раскрытию метаболических взаимодействий между хозяином и микробиомом, которые определяют интересующий фенотип.В то время как неприятный запах у взрослых и европейцев широко изучался [5, 6, 9], неприятный запах у азиатов и особенно у детей и подростков не получил должного внимания. Наши исследования показывают, что это действительно проблема потребительского интереса, которая влияет на качество жизни пострадавших детей, предполагая, что ее влияние на психологическое благополучие детей заслуживает дальнейшего исследования.
При разработке исследования по выявлению видов и путей распространения микробов, связанных с неприятным запахом, необходимо учитывать несколько аспектов, включая возможность того, что могут быть таксоны, которые медленно растут, но сильно связаны с неприятным запахом, в то время как другие могут вызывать неприятный запах только тогда, когда они достаточно обильный.Таким образом, наш дизайн включал как продольные (использование упражнений для создания предшественников пота и запаха), так и поперечные аспекты в разных возрастных группах, чтобы в целом уловить различные сигналы ассоциации. Наши данные показывают, что в большинстве случаев имеются согласованные сигналы от продольного и поперечного анализов, за исключением видов Corynebacterium и M. globosa в подмышечных впадинах детей, чье явное снижение относительной численности при физических упражнениях (несмотря на положительную корреляцию с неприятным запахом) может быть связано с их более медленным ростом по сравнению с S.Эпидермодис . Кроме того, данные этого исследования подчеркивают различные микробные факторы, влияющие на запах тела в разных возрастных группах и участках тела, например, было обнаружено, что S. hominis имеет сильную связь с неприятным запахом в области шеи у детей, в то время как область подмышек показала значимая связь с S. epidermidis . И это несмотря на обилие S. hominis в подмышечной области, что позволяет предположить, что здесь играют роль различия в предшественниках пота из области шеи и подмышек и что S.epidermidis может иметь чрезмерный эффект в отношении образования неприятного запаха, когда присутствуют правильные предшественники.
Предыдущая работа по изучению микробного вклада в неприятный запах подмышек в первую очередь подчеркивала роль видов Corynebacterium [7] у взрослых. Используя секвенирование 16S рРНК, эти исследования показали, что виды Corynebacterium , Staphylococcus и Cutibacterium являются доминирующими бактериями в подмышечной области [9, 26–28]. Из них видов Corynebacterium оказались более многочисленными, чем видов Staphylococcus в группах лиц, не использующих антиперспиранты или дезодоранты [26].Также было обнаружено, что неприятный запах в подмышечной впадине взрослых обычно определяется характеристиками серы или прогорклого запаха от 3M3SH, 3M2H и HMHA, генерируемых в основном видами Corynebacterium [7, 9, 29]. Для сравнения, наше исследование показывает, что видов Corynebacterium менее многочисленны у детей и подростков, а видов Staphylococcus более многочисленны. Это различие может быть частично связано с тем, что микросреда подмышечной впадины у детей и подростков формируется эккринной секрецией.Хотя технические различия в профилировании метагенома также могут влиять на эти сравнения, мы отмечаем, что метагеномика дробовика и профилирование 16S рРНК показали хорошее соответствие в предыдущем исследовании [17]. Кроме того, в этом исследовании было обнаружено, что кислый запах чаще встречается у детей, и, соответственно, наш анализ подчеркнул центральную роль видов Staphylococcus в запахе тела у детей. Среди Staphylococcus видов, тогда как в большинстве более ранних исследований изучалась роль S.haemolyticus и S. hominis [5, 23], наша работа является первой, которая определяет роль S. epidermidis в возникновении неприятного запаха из подмышек у детей. Это имеет серьезные последствия с точки зрения мер по борьбе с неприятным запахом — в то время как основной подход для взрослых использует антиперспиранты для контроля образования неприятного запаха медленнорастущими видами Cornybacterium , противомикробные препараты могут быть более подходящими для быстрорастущих видов Staphylococcus у детей в качестве антиперспирантов. было замечено, что они относительно обогащают их [26].Кроме того, поскольку S. epidermidis является важным кожным комменсалом [30], могут потребоваться методы лечения следующего поколения, которые блокируют активность определенных ферментов, выявленных в этом исследовании.
Что касается влияния генетики хозяина на неприятный запах, несколько исследований описали ассоциацию аллелей ABCC11 с запахом тела у взрослых и показали, что люди, несущие аллели GG / GA, имеют усиленный запах из-за генерации 3M3SH, 3M2H, и HMHA из апокринового пота [15, 16, 31].Большинство населения Филиппин (от ~ 72 до 78%) имеет аллель GG / GA, и, следовательно, взрослые на Филиппинах более подвержены неприятному запаху с серными / прогорклыми характеристиками [15, 32]. У детей до полового созревания апокринные железы не полностью активированы [12], и, таким образом, прекурсоры эккринового происхождения могут играть более значительную роль в наблюдаемых характеристиках запаха. Апокринные железы сравнительно более активны у подростков, чей профиль неприятного запаха, как ожидается, будет более похож на профиль взрослых.Эти ожидания совпадают с нашими наблюдениями более высокой интенсивности запаха у подростков по сравнению с детьми и перехода к более серным характеристикам у подростков.
Наш биоинформатический анализ в этом исследовании еще раз высветил проблемы подхода «мешка генов» к изучению функции микробиома с метагеномными данными. Микробы обмениваются метаболитами контролируемым образом, и предположение, что несколько этапов метаболического процесса могут выполняться у разных видов в «метагеноме», не всегда может быть целесообразным [33, 34].Кроме того, ферменты разных видов, принадлежащие к одному и тому же классу ферментов, могут иметь очень разную эффективность и субстратную специфичность [35], например, объясняя, почему S. epidermidis ассоциировался с неприятным запахом из подмышек у детей, а S. hominis — нет. . Эта проблема проиллюстрирована недавним отчетом, показывающим, что метагеномные конвейеры могут выделять очень разные функциональные пути с использованием одного и того же набора данных [36]. Переход к анализу «мешка геномов» может обеспечить лучшую интерпретируемость наборов метагеномных данных, но существенным ограничением является возможность идентифицировать разные гены, принадлежащие одному и тому же геному.Усовершенствованные подходы к кластеризации и сборке, обеспеченные достижениями в технологии секвенирования, могут помочь устранить эти ограничения в будущем [37, 38].
Насколько нам известно, это первый отчет, в котором описаны таксоны, которые отрицательно коррелируют с неприятным запахом, но механизм их действия остается неясным. Эти ассоциации могут быть вызваны различными причинами, включая (а) производство соединений, которые маскируют неприятный запах или имеют более низкую интенсивность запаха (как предлагается здесь для P. avidum ), (б) микробная конкуренция или ингибирование, ведущее к уменьшению роста неприятного запаха; ассоциированные виды (как было описано между Malassezia и Staphylococcus видов [39]), и (c) метаболические процессы, которые приводят к тому, что ключевые предшественники запаха становятся недоступными для образования соединений неприятного запаха.Проведенные здесь культуральные эксперименты с человеческим потом предоставили уникальную основу для реалистичного моделирования доступности прекурсоров и подчеркнули вклад видов Staphylococcus в образование запаха. Дальнейшие эксперименты с консорциумами бактерий могут помочь изучить взаимодействия между ними и, таким образом, определить механизмы уменьшения неприятного запаха.
Материалы и методы
Дизайн клинического исследования
Для этого исследования были набраны две группы субъектов: (1) 15 детей, состоящих из 8 женщин и 7 мужчин, в возрасте от 5 до 9 лет и (2) 15 подростков, состоящих из 8 женщин. и 7 мужчин от 15 до 18 лет.В начале исследования (0 ч) испытуемым давали для душа стандартное кусковое мыло (без антимикробных активных веществ и отдушек). Через час после душа назначенный профессиональный парфюмер оценил интенсивность запаха (диапазон от 0 до 100) и характер в области подмышек, задней части шеи и кожи головы. Образцы микробиома были собраны сразу после этого для каждого участка путем снятия ленты (D100 D-squame, CuDerm). Каждую полоску ленты прикладывали десять раз к коже со стандартизованным давлением в течение 1 с и помещали в 1.Пробирка Эппендорфа 5 мл на льду. Затем испытуемые выполняли 4–5 часов интенсивных упражнений в среде с температурой 32 ° C и относительной влажностью 66%. Вкратце, испытуемые были разделены на группы, чтобы выполнять комбинацию физических нагрузок (беговая дорожка, езда на велосипеде в помещении, аэробика и баскетбол) поочередно под руководством профессионального инструктора. Физические нагрузки выполнялись с интервалом 10–15 мин с перерывом 10–15 мин. Во время перерыва были собраны образцы пота, и участники поддерживали водный баланс.В 8-часовой временной точке, интенсивность запаха, характер запаха и образцы микробиома были собраны снова, как описано выше (левая или правая подмышка выбирались случайным образом, но оставались неизменными по временным точкам). Испытуемые находились в среде без кондиционирования воздуха в течение 8 часов.
Обработка образцов и экстракция ДНК
Ленточные полоски переносили в пробирки Lysing Matrix E (MP Biomedicals) и добавляли 500 мкл буфера ATL (Qiagen). Образцы подвергали взбиванию шариками с помощью прибора FastPrep-24 (MP Biomedicals) на скорости 6.0 м / с в течение 40 с. Затем образцы центрифугировали при 16000 г в течение 5 минут, 200 мкл супернатанта обрабатывали 10 мкл протеиназы K (Qiagen) и инкубировали при 56 ° C в течение 15 минут. ДНК экстрагировали с помощью EZ1 Advanced XL Instrument (Qiagen) с набором EZ1 DNA Tissue Kit (Qiagen) с объемом элюции 100 мкл и количественно определяли с помощью набора Qubit dsDNA HS Assay Kit (Life Technologies), а затем хранили в морозильной камере — 20 ° C. .
Подготовка библиотеки, комбинаторное объединение и секвенирование
Стандартный объем экстрагированной ДНК в 50 мкл подвергали сдвигу с использованием Adaptive Focused Acoustics ™ (Covaris).Библиотеки ДНК получали с использованием основного набора Gene Read DNA Library I (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя, за исключением использования пользовательских адаптеров вместо набора адаптеров GeneRead I. Пользовательские индексные праймеры использовали для обогащения библиотек ДНК, которое выполняли в соответствии с протоколом обогащения, адаптированным из набора олигонуклеотидов для подготовки мультиплексных образцов (Illumina). Количественную оценку библиотек проводили с использованием Agilent Bioanalyzer, подготовленного с помощью набора Agilent High Sensitivity DNA Kit или Agilent DNA1000 Kit (Agilent Technologies).
Чтобы избежать пакетных эффектов, объединение библиотеки всего метагенома было выполнено комбинаторным способом (дополнительный файл 2: таблица S8). Что касается подмышек, образцы от детей и подростков были равномерно разделены на две партии подготовки библиотеки, причем каждая партия содержала равное количество детей, подростков, образцов с более сильным неприятным запахом и более слабым неприятным запахом. Библиотеки образцов от детей были затем объединены в эквимолярных количествах на одной полосе, а библиотеки образцов от подростков на другой дорожке.Для областей шеи и головы библиотеки были построены путем подготовки образцов от одного и того же объекта (1 час и 8 часов) один за другим, чередуя детей и подростков, а также образцов с более сильным неприятным запахом и более слабым неприятным запахом. Образцы с каждого сайта сбора были объединены в один пул. Парное секвенирование (считывание 2 × 101 п.н.) было выполнено на успешных библиотеках ДНК с использованием платформы Illumina HiSeq 2000.
Предварительная обработка чтения
После демультиплексирования чтения были отфильтрованы с помощью программного обеспечения Bcl2fastq (CASAVA version 1.8.4) от Illumina, и FastQC был выполнен для оставшихся чтений (Pass Filter Reads). Основания секвенирования с показателями качества ниже 30 были обрезаны с 5′- и 3′-концов каждого считывания, а считывания с длиной менее 30 нуклеотидов были удалены. Человеческие чтения были отфильтрованы путем сопоставления с человеческим геномом (GRCh48) с использованием BWA-MEM [40] (версия 0.7.13-r1126; параметры по умолчанию), оставив после себя 4,71 миллиарда нечеловеческих парных и одноэлементных считываний.
Таксономическая классификация
Таксономическое профилирование образцов было выполнено по всем таксономическим рангам с использованием MetaPhlAn2 [41] (версия 2.5.0; параметры по умолчанию). MetaPhlAn2 использует гены-маркеры клады, охватывающие бактериальные, архейные, вирусные и эукариотические микробы, для выполнения однозначных таксономических задач. Метагеном каждого образца анализировали независимо для вычисления относительной численности. Затем выходные файлы были объединены в единую таблицу с указанием относительной численности на образец (столбцы) и на микроб (строка). Таксоны со средней относительной численностью> 1% у детей или подростков были консервативно определены для каждого участка тела для дальнейшего статистического анализа.
Функциональное профилирование
HUMAnN2 [33] (v0.7.1; параметры по умолчанию) было запущено с базой данных белков UniRef90 для получения функциональных профилей для каждого метагенома. HUMAnN2 обеспечивает (i) численность каждого семейства ортологичных генов UnifRef, указанную в виде числа чтений на килобазу (RPK), (ii) численность путей MetaCyc в RPK и (iii) охват каждого пути MetaCyc, масштабируемое от 0 до 1. Ген Семьи и пути со средними значениями RPK> 10 по выборкам от детей или подростков были сохранены и были повторно нормализованы до относительной численности для последующего анализа ассоциации, в то время как путь MetaCyc рассматривался для дальнейшего статистического анализа только в том случае, если средний охват путей по всем образцам было> 0.3. В целом, мы идентифицировали 69 792, 65 939 и 45 684 уникальных семейства генов из метагеномов подмышек, шеи и головы, соответственно. Для путей MetaCyc существует 89 (подмышками), 103 (шея) и 83 (голова) путей, которые соответствуют указанным выше критериям. Процент считываний, назначенных семействам и путям генов, а также считываний без назначения можно найти в Дополнительном файле 2: Таблица S9. Вклад каждого таксона в семейство генов и путь также определяли на основе таксономического назначения каждого считывания из выходов HUMAnN2.Вклад в семейство генов был визуализирован путем сопоставления идентификаторов UniRef90 с идентификаторами ортологической группы KEGG в путях KEGG [42] (версия обновлена в феврале 2016 г.).
Статистический анализ
Многомерный анализ для оценки ассоциаций между интенсивностью запаха, возрастом и микробными сообществами до и после тренировки был выполнен с использованием подхода канонического анализа основных координат (с несходством Брея-Кертиса), реализованного в веганском R-пакете ( версия 2.4-3).Существенные связи между таксонами / функциями микробов и неприятным запахом были выявлены с помощью комбинации статистических тестов, в которых (i) коэффициент корреляции Спирмена между интенсивностью запаха и таксонами / функциями микробов использовался для поперечного анализа и (ii) ранговый критерий Вилкоксона для анализа численность до и после тренировки использовалась для продольного анализа. Значения p были скорректированы с использованием подхода Бенджамини-Хохберга, и все статистические анализы были выполнены в R.Для путей, которые считались обнаруженными, было проведено ассоциативное тестирование для молодежи, детей и подростков, чтобы выявить те, у которых скорректированные по FDR значения p <0,1, по крайней мере, в двух из шести сравнений в качестве возможных путей для дальнейшего анализа на уровне генов.
Выделение микробов из подмышечной области у субъектов
В этом исследовании микробы были собраны в асептических условиях путем мазка подмышечной области с использованием предварительно увлажненного (стерильного 0,15 M NaCl + 0.1% раствор Твин 20) тампоны из хлопка (Puritan Med). Образец мазка от субъекта с наивысшей интенсивностью запаха помещали на кровяной агар TSA (Thermo Fisher Scientific) и инкубировали при 37 ° C в течение ночи. Репрезентативные одиночные колонии на основе морфологии были отобраны и недавно субкультивированы для масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF (Bruker) для идентификации видов. Идентификация видов была дополнительно подтверждена секвенированием 16S рРНК (Charles River). Выбранные представляющие интерес бактерии ( Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus hominis, Cutibacterium acnes и Micrococcus luteus ) затем суспендировали в криогенных гранулах (Thermo Fisher Scientific) и хранили в морозильной камере — 80 ° C.
Сбор пота и эксперименты по культивированию
Человеческий пот собирали из области подмышек и шеи у нескольких человек в этом исследовании, используя 1,5 мл пробирки Эппендорфа, объединяли в стерильные 50 мл пробирки и хранили при 4 ° C. Затем смесь секрета пота стерилизовали центрифугированием 3000, г, × 10 мин и стерильными шприцевыми фильтрами с размером пор 0,2 мкм (Millipore). Бактериальные изоляты были свежеприготовлены в течение ночи и собраны на следующий день, когда OD 600 достигнет 1.0. После этого следовало центрифугирование при 3000 g в течение 10 мин, полученный осадок промывали стерильным 0,01 М фосфатным буфером (pH 6,0) и повторно суспендировали в 10 мл свободного от бактерий пула пота. Эти свежеприготовленные образцы пула бактерий и пота инкубировали в орбитальном шейкере в аэробных условиях при 120 об / мин, 37 ° C в течение 24 часов. Каждый эксперимент включал отрицательные контроли (10 мл стерилизованного фильтром пула пота без бактериальной инокуляции) в тех же условиях, что и выше. Все эксперименты проводились в аэробных условиях.
Аналитическое определение кислых предшественников и отдушек
Лейцин и изолейцин измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Вкратце, 0,2 мл образца вносили пипеткой в центрифужную пробирку на 15 мл. После этого добавляли 4,8 мл 0,05 н. Соляной кислоты и диспергировали образец с помощью вихревой мешалки. Полученный раствор фильтровали через шприц из ПВДФ 0,45 мкм и смешивали с 0,1 мл натрий-боратного буфера (pH 10,2) и 0,2 мл раствора NBD-F в 2-миллилитровом желтом флаконе для ВЭЖХ.После плотного закрытия крышки флакон нагревали в печи при 60 ° C в течение 5 минут, затем охлаждали перед добавлением 0,4 мл 0,05 н. Соляной кислоты и вводом в ВЭЖХ для анализа. Измерение глицерина проводилось с помощью GC-FID. Пять миллилитров пота лиофилизировали в течение ночи с последующим добавлением в пробирку 0,2 мл воды и 1,8 мл экстракционного растворителя. Затем образец фильтровали через шприц из ПВДФ 0,45 мкм в пробирку для ГХ для анализа.
Чтобы измерить уровень молочной кислоты в поту, сначала создайте калибровочную кривую, используя 0.0, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0 и 5,0 частей на миллион стандарта молочной кислоты были установлены путем мониторинга массы иона m / z89 в выбранном ионном режиме (SIM) в анализе ЖХ / МС (ABSciex 4000 QTRAP). Затем образцы пота разбавляли в 500 раз с использованием метанола / воды (1: 1) и вводили в систему ЖХ / МС для анализа, и из образцов получали площади пиков массового числа молочной кислоты (m / z89). . Уровни молочной кислоты определяли путем сравнения площадей пиков образцов и откликов калибровочной кривой.
pH собранной пробы пота (10 мл) доводили до 12,0 добавлением NaOH (Wako), и лиофилизацию проводили в течение 2 дней. После лиофилизации в каждую пробирку с остатками добавляли 1 мл HCl (50% разбавление 37% HCl) (Sigma) с последующим встряхиванием и центрифугированием при 4000 об / мин и 20 ° C в течение 20 минут. Полученный супернатант переносили в пробирку Эппендорфа, добавляли 150 мкл хлороформа (Sigma) с последующим встряхиванием и центрифугированием при 14800 об / мин и 4 ° C в течение 20 мин.Затем фракции хлороформа объединяли и 10 мкл объединенной среды вводили в прибор GCMS для анализа. Agilent GC 7890B / MSD 5977A (Agilent, Wilmington, DE, USA) с автосамплером Gerstel MPS2 -TDU-CIS4 (Gerstel, Германия) использовали для разделения и анализа соединений запаха тела. ГХ-МС был оснащен колонкой DB-Wax, 60 мм × 0,25 мм с толщиной пленки 0,25 мкм (Agilent, Делавэр, США). Использовался режим впрыска жидкости большого объема — начальная температура инжектора была на уровне 10 ° C, уравновешенная на 0.В течение 5 минут использовали линейное изменение скорости 12 ° C / мин до конечной температуры 220 ° C, затем выдерживали в течение 5 минут. Объем инъекции составлял 10 мкл. Температуру печи поддерживали на уровне 40 ° C в течение 2 минут, повышали до 220 ° C со скоростью 3 ° C / мин и выдерживали в течение 4 минут. Расход газа-носителя гелия был постоянным и составлял 1,2 мл / мин. Масс-спектрометр работал при энергии ионизации 70 эВ со скоростью четыре сканирования / с в диапазоне м / z 29–450 и температуре источника ионов 230 ° C. Идентификацию структур / соединений проводили с использованием библиотеки Национального института стандартов и технологий (NIST’11) и внутренней библиотеки P&G MS с коммерчески доступными стандартами.ГХ-ольфактометрия выполнялась при первом запуске. Обонятельные измерения проводились тем же профессиональным парфюмером, который оценивал характеристики и интенсивность запаха у участников этого исследования.
Дополнительные файлы
Дополнительные файлы 2: (92K, zip)Таблица S2. Оценка запаха и данные метагеномного секвенирования для всех образцов в этом исследовании. Таблица S5. GC-ольфактометрия пота, взятого у детей и подростков. Таблица S6. Обнаруженные пути MetaCyc, которые, как было установлено, связаны с неприятным запахом, на основании значений обилия путей из HUMAnN2.Для области головы значимой ассоциации не обнаружено. Таблица S7. Ключевые пути, связанные с производством неприятного запаха, и их таксономические факторы. Таблица S8. Информация о том, как образцы были распределены в партиях для подготовки библиотеки и секвенирования, чтобы избежать эффекта партии. Таблица S9. Считывает сопоставленные (%) семейств генов UniRef90 и пути MetaCyc. (ZIP 92 кб)
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Серену Хейз и Сару Аршад за помощь в проверке содержания рукописи.
Финансирование
Эта работа финансировалась грантом SPF для сотрудничества A * STAR-P&G (APG2013 / 032). Финансовая поддержка компании Procter & Gamble, Цинциннати, Огайо, была использована для разработки и проведения части исследования.
Сокращения
3M2H | 3-метил-2-гексеновая кислота |
3M3SH | 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-гексанол 3-метил-4-гексановая кислота |
HPLC | Высокоэффективная жидкостная хроматография |
LC / GCMS | Жидкостная хроматография и газовая хроматография-масс-спектрометрия |
Вклад авторов
YL, DS, PLN, JL, DS, PLN и задумал это исследование.PB, AHQN и DS участвовали в метагеномном секвенировании. PH, JT, RK, TMUT, JL и MO участвовали в культивировании и масс-спектрометрическом анализе. THL и DV проанализировали метагеномные данные под наблюдением PL и NN. THL и NN написали рукопись при участии всех авторов. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.
Примечания
Утверждение этических норм и согласие на участие
Исследование было проведено, и все образцы были собраны PRICEPTS Inc. (PRICE Product Testing Services Incorporated) в Маниле с одобрения Институционального обзора Сингапурского инновационного центра Procter & Gamble (Сингапур) Правления и в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (поправка 1996 г.).Руководства ICH по надлежащей клинической практике (GCP) были соблюдены, и добровольное информированное согласие было предоставлено с одобрения Совета по этике исследований P&G. Это клиническое исследование соответствовало руководящим принципам STROBE для наблюдательных исследований на людях. Матери, которые согласились принять участие в исследовании своих детей, подписали форму информированного согласия, а подростки, которые согласились участвовать, подписали форму согласия.
Согласие на публикацию
Не применимо.
Конкурирующие интересы
Несколько соавторов (Л.Y. D.S. P.L. J.L. P.B. P.H. J.T. R.K. T.T. M.O.) участвовал и / или проводил это исследование, будучи сотрудником компании Procter & Gamble. Эти соавторы могут владеть акциями компании, но прямой финансовой выгоды или убытков от публикации этой рукописи не ожидается. Согласно требованиям трудовых обязательств компании Procter & Gamble по соблюдению конфиденциальности, эти соавторы не могут заявлять о патентной деятельности.
Примечание издателя
Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и принадлежностей организаций.
Информация для авторов
Цзе Хау Лам, электронная почта: [email protected].
Давиде Верзотто, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@dottozrev.
Пурбита Брахма, электронная почта: [email protected].
Аманда Хуэй Ци Нг, электронная почта: [email protected].
Пин Ху, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@aqhgn.
Дэн Шнелл, электронная почта: [email protected].
Джей Тисман, электронная почта: [email protected].
Ронг Конг, электронная почта: [email protected].
Thi My Uyen Ton, электронная почта: [email protected].
Цзяньцзюнь Ли, электронная почта: [email protected].
May Ong, электронная почта: [email protected].
Ян Лу, электронная почта: [email protected].
Дэвид Суэйл, электронная почта: [email protected].
Пинг Лю, электронная почта: [email protected].
Цзицюань Лю, электронная почта: [email protected].
Ниранджан Нагараджан, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@nnajaragan.
Ссылки
1. Такахаши Л.К., Накашима Б.Р., Хонг Х., Ватанабэ К. Запах опасности: поведенческий и нейронный анализ страха, вызванного запахом хищника.Neurosci Biobehav Rev.2005; 29: 1157–1167. DOI: 10.1016 / j.neubiorev.2005.04.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Стокли П., Боттелл Л., Херст Дж. Л. Проснитесь и почувствуйте конфликт: запаховые сигналы в соревнованиях женщин. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2013; 368: 20130082. DOI: 10.1098 / rstb.2013.0082. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Киёкава Ю. Социальные запахи: феромоны тревоги и социальная буферизация. Curr Top Behav Neurosci. 2017; 30: 47–65. DOI: 10.1007 / 7854_2015_406. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4.Портер Р. Х., Чернох Дж. М., Балог Р. Д.. Сигнатуры запаха и распознавание родства. Physiol Behav. 1985; 34: 445–448. DOI: 10.1016 / 0031-9384 (85)-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Боудон Дэниел, Кокс Диана С., Эшфорд Дэвид, Джеймс А. Гордон, Томас Гэвин Х. Идентификация подмышечного стафилококка. участвует в производстве зловонного тиоспирта 3-метил-3-суфанилгексан-1-ола. Письма о микробиологии FEMS. 2015; 362 (16): fnv111. DOI: 10.1093 / femsle / fnv111. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Джеймс А.Г., Остин С.Дж., Кокс Д.С., Тейлор Д., Калверт Р.Микробиологическое и биохимическое происхождение запаха из подмышек человека. FEMS Microbiol Ecol. 2013; 83: 527–540. DOI: 10.1111 / 1574-6941.12054. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Fredrich E, Barzantny H, Brune I, Tauch A. Ежедневная борьба с запахом тела: в сторону активности подмышечной микробиоты. Trends Microbiol. 2013; 21: 305–312. DOI: 10.1016 / j.tim.2013.03.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Бек ХК, Хансен AM, Лауритсен FR. Катаболизм лейцина в жирные кислоты с разветвленной цепью у Staphylococcus xylosus.J Appl Microbiol. 2004. 96: 1185–1193. DOI: 10.1111 / j.1365-2672.2004.02253.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Troccaz M, et al. Картирование подмышечной микробиоты, ответственной за запах тела, с использованием независимого от культуры подхода. Микробиом. 2015; 3: 3. DOI: 10.1186 / s40168-014-0064-3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Джеймс А.Г., Хилиандс Д., Джонстон Х. Генерация летучих жирных кислот подмышечными бактериями. Int J Cosmet Sci. 2004. 26: 149–156. DOI: 10.1111 / j.1467-2494.2004.00214.Икс. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Лу К., Фукс Э. Предшественники потовых желез в развитии, гомеостазе и заживлении ран. Перспективы Колд-Спринг-Харбор в медицине. 2014; 4 (2): a015222 – a015222. DOI: 10.1101 / cshperspect.a015222. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Вилке К., Мартин А., Терстеген Л., Биль СС. Краткая история биологии потовых желез. Int J Cosmet Sci. 2007. 29: 169–179. DOI: 10.1111 / j.1467-2494.2007.00387.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Тибуто Д.Регулирование работы сальных желез человека. J Invest Dermatol. 2004; 123: 1–12. DOI: 10.1111 / j.1523-1747.2004.t01-2-.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Harker M, et al. Функциональная характеристика SNP в аллеле ABCC11 — влияние на метаболизм кожи в подмышечных впадинах, формирование запаха и связанное с ним поведение. J Dermatol Sci. 2014; 73: 23–30. DOI: 10.1016 / j.jdermsci.2013.08.016. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Мартин А. и др. Функциональный аллель ABCC11 играет важную роль в биохимическом формировании запаха из подмышечных впадин человека.J Invest Dermatol. 2010; 130: 529–540. DOI: 10.1038 / jid.2009.254. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Chng KR, et al. Профилирование всего метагенома выявляет зависимую от микробиома кожи восприимчивость к обострению атопического дерматита. Nat Microbiol. 2016; 1: 16106. DOI: 10.1038 / nmicrobiol.2016.106. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Чибани-Ченнуфи С., Бруттин А., Диллманн М.Л., Брюссоу Х. Взаимодействие фага-хозяина: экологическая перспектива. J Bacteriol. 2004. 186: 3677–3686. DOI: 10.1128 / JB.186.12.3677-3686.2004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Шу М. и др. Ферментация Propionibacterium acnes, комменсальной бактерии в микробиоме кожи человека, в качестве кожных пробиотиков против метициллин-резистентных
Staphylococcus aureus . ПлоС один. 2013; 8: e55380. DOI: 10.1371 / journal.pone.0055380. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Christensen GJ, et al. Антагонизм между Staphylococcus epidermidis и Propionibacterium acnes и его геномная основа.BMC genomics. 2016; 17: 152. DOI: 10.1186 / s12864-016-2489-5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Natsch A, Gfeller H, Gygax P, Schmid J, Acuna G. Специфическая бактериальная аминоацилаза расщепляет предшественники одоранта, секретируемые в подмышечной впадине человека. J Biol Chem. 2003; 278: 5718–5727. DOI: 10.1074 / jbc.M210142200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Эмтер Р., Натч А. Последовательное действие дипептидазы и бета-лиазы требуется для высвобождения одоранта человеческого тела 3-метил-3-сульфанилгексан-1-ола из секретируемого конъюгата Cys-Gly- (S) посредством Коринебактерии.J Biol Chem. 2008; 283: 20645–20652. DOI: 10.1074 / jbc.M800730200. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Ионеску Г., Константиниу С. Биология рода Acinetobacter. Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol. 2004. 49: 157–174. [PubMed] [Google Scholar] 26. Урбан Дж. И др. Влияние привычного и экспериментального использования антиперспирантов и дезодорантов на микробиом подмышек. PeerJ. 2016; 4: e1605. DOI: 10.7717 / peerj.1605. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Callewaert C, et al.Характеристика скоплений стафилококков и коринебактерий в подмышечной области человека. ПлоС один. 2013; 8: e70538. DOI: 10.1371 / journal.pone.0070538. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 28. Совет Сара Э., Сэвидж Эми М., Урбан Джули М., Элерс Меган Э., Скин Дж. Х. Пейт, Платт Майкл Л., Данн Роберт Р., Хорват Джули Э. Разнообразие и эволюция микробиома кожи приматов. Труды Королевского общества B: биологические науки. 2016; 283 (1822): 20152586. DOI: 10.1098 / РСПБ.2015.2586. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Troccaz M, et al. Гендерные различия между концентрациями нелетучих (R) / (S) -3-метил-3-сульфанилгексан-1-Ol и (R) / (S) -3-гидрокси-3-метил-гексановой кислоты предшественников запаха в подмышечные выделения. Chem Senses. 2009; 34: 203–210. DOI: 10.1093 / chemse / bjn076. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Прокоп-Пригге К.А., Грин К., Варалло Л., Высоцкий К.Дж., Прети Г. Влияние этнической принадлежности на производство одоранта в подмышечных впадинах человека.J Chem Ecol. 2016; 42: 33–39. DOI: 10.1007 / s10886-015-0657-8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 32. Йошиура К. и др. SNP в гене ABCC11 является детерминантом типа ушной серы человека. Нат Жене. 2006. 38: 324–330. DOI: 10,1038 / нг1733. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33. Abubucker S, et al. Метаболическая реконструкция метагеномных данных и ее применение к микробиому человека. PLoS Comput Biol. 2012; 8: e1002358. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1002358. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34.van der Ark KCH, van Heck RGA, Martins Dos Santos VAP, Belzer C, de Vos WM. Больше, чем просто интуиция: основанные на ограничениях метаболические модели в масштабе генома для прогнозирования функций кишечных микробов человека. Микробиом. 2017; 5: 78. DOI: 10.1186 / s40168-017-0299-х. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Тилинг Х, Глокнер Ф. Текущие возможности и проблемы в анализе микробного метагенома — биоинформатическая перспектива. Краткий биоинформ. 2012; 13: 728–742. DOI: 10,1093 / bib / bbs039.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Франк Дж. А. и др. Улучшенные сборки метагеномов и таксономическое объединение с использованием данных длинных циклических согласованных последовательностей. Научный доклад 2016; 6: 25373. DOI: 10,1038 / srep25373. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 40. Ли Х, Дурбин Р. Быстрое и точное согласование короткого чтения с преобразованием Барроуза-Уиллера. Биоинформатика. 2009; 25: 1754–1760. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btp324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 42.Kanehisa M, Sato Y, Kawashima M, Furumichi M, Tanabe M. KEGG как справочный ресурс для аннотации генов и белков. Nucleic Acids Res. 2016; 44: D457 – D462. DOI: 10.1093 / нар / gkv1070. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]Понимание микробной основы запаха тела у детей и подростков до полового созревания
Microbiome. 2018; 6: 213.
, 1 , 2 , 1 , 2 , 3 , 3 , 3 , 1 , 1 , 4 , 1 , 1 , 4 , 1 , 1 и 2, 5Tze Hau Lam
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Сингапур, 13854741 Давид Верзот
2 Вычислительная и системная биология, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
Purbita Brahma
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Amanda Hui Qi Ngutational
2 Computing и системной биологии, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
Ping Hu
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Dan Schnell 9 0041
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Jay Tiesman
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
Rong Kong
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Singapore, 138547 Singapore
Thi My Uyen Ton
1 Procter & Gamble Singapore Innovation Center, Singapore, 138547 Singapore
Jianjun Li
4 Procter & Gamble Sharon Woods Innovation Center, Sharonville, OH 45241 США
May Ong
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Ян Лу
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Дэвид Свайл
4 0002 9000 Procter & Gamble Центр инноваций Шэрон Вудс, Шаронвилл, Огайо 45241 СШАПинг Лю
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Цзицюань Лю
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
Ниранджан Нагараджан
2 Институт вычислительной и системной биологии of Singapore, Singapore, 138672 Singapore
5 Медицинская школа Yong Loo Lin, Национальный университет Сингапура, Сингапур, 119228 Сингапур
1 Сингапурский инновационный центр Procter & Gamble, Сингапур, 138547 Сингапур
2 Вычислительный и системной биологии, Институт генома Сингапура, Сингапур, 138672 Сингапур
3 Procter & Gamble Mason Business Center, Mason, OH 45040 USA
4 Procter & Gamble Sharon Woods Innovation Center, Sharonville, OH 45241 USA
5 Медицинский факультет Юн Лу Линя, Национальный университет Сингапур, Сингапур, 119228 Сингапур
Автор, ответственный за переписку.Поступило 28.05.2018 г .; Принято 2 ноября 2018 г.
Открытый доступ Эта статья распространяется в соответствии с условиями Международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы должным образом укажете автора (авторов) и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения. Отказ от лицензии Creative Commons Public Domain Dedication (http: // creativecommons.org / publicdomain / zero / 1.0 /) применяется к данным, представленным в этой статье, если не указано иное. Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.- Дополнительные материалы
Дополнительный файл 1: Рисунки S1-S10 , Таблицы S1, S3 и S4 . (PDF 3276 кб)
GUID: 4D6F7D72-9FB1-448F-A881-A5C17FD171DD
Дополнительный файл 2: Таблица S2. Оценка запаха и данные метагеномного секвенирования для всех образцов в этом исследовании. Таблица S5. GC-ольфактометрия пота, взятого у детей и подростков. Таблица S6. Обнаруженные пути MetaCyc, которые, как было установлено, связаны с неприятным запахом, на основании значений обилия путей из HUMAnN2. Для области головы значимой ассоциации не обнаружено. Таблица S7. Ключевые пути, связанные с производством неприятного запаха, и их таксономические факторы. Таблица S8. Информация о том, как образцы были распределены в партиях для подготовки библиотеки и секвенирования, чтобы избежать эффекта партии. Таблица S9. Считывает сопоставленные (%) семейств генов UniRef90 и пути MetaCyc. (ZIP, 92 кб)
GUID: 36CA9ED0-CC48-4DB0-8510-8A2BEB1497C8
- Заявление о доступности данных
Наборы данных, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны в Европейском архиве нуклеотидов в рамках проекта id ERP1084 https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB26427).
Аннотация
Предпосылки
Несмотря на то, что человеческий пот не имеет запаха, считается, что рост бактерий и разложение определенных предшественников запаха в нем вызывает запах тела у людей.Хотя механизмы образования запаха широко изучены у взрослых, мало что известно о подростках и детях, не достигших полового созревания, у которых состав пота отличается от незрелых апокринных и сальных желез, но, возможно, они более восприимчивы к социальному и психологическому воздействию неприятного запаха.
Результаты
Мы интегрировали информацию из анализа всего микробиома нескольких участков кожи (подмышки, шея и голова) и нескольких временных точек (1 час и 8 часов после ванны), проанализировав в общей сложности 180 образцов для проведения самого большого метагенома. проведенное ассоциацией исследование неприятного запаха.Значительные положительные корреляции наблюдались между интенсивностью запаха и относительной численностью Staphylococcus hominis , Staphylococcus epidermidis и Cutibacterium avidum , а также отрицательная корреляция с видами Acinetobacter schindleri и Cutibacterium. Анализ метаболических путей выявил связь продукции изовалериановой и уксусной кислот (кислый запах) из обогащенных S. epidermidis (подростковая подмышечная область) и S.hominis (детская шея) и продукция серы из Staphylococcus видов (подмышечная впадина подростка) с интенсивностью запаха, что хорошо согласуется с наблюдаемыми характеристиками запаха у детей и подростков в предпубертатном возрасте. Эксперименты с культурами человеческого и искусственного пота подтвердили способность S. hominis и S. epidermidis независимо производить неприятный запах с отчетливыми характеристиками запаха.
Выводы
Эти результаты демонстрируют возможности метагеномики кожи для изучения ко-метаболических взаимодействий между хозяином и микробами, выявления различных путей образования запаха от пота у детей и подростков в предполовозрелом возрасте и выделения ключевых ферментативных мишеней для вмешательства.
Электронные дополнительные материалы
Онлайн-версия этой статьи (10.1186 / s40168-018-0588-z) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.
Введение
Запах тела в животном мире часто играет важную роль в защите от хищников и выживании [1–3]. Считается, что у людей обонятельные сигналы играют роль в обнаружении родства и выборе партнера [4]. Несмотря на эти функции, запах тела, как правило, вызывает сильную социальную стигматизацию, а его социальное и психологическое воздействие на затронутых субъектов до конца не изучено.
Считается, что запах тела у людей в первую очередь опосредован бактериальным разложением естественно секретируемых, не пахнущих компонентов пота, особенно жирных кислот, алифатических аминокислот с разветвленной цепью, глицерина и молочной кислоты, происходящих из эккринных, апокринных и сальных желез. железы [5–8]. В исследованиях у взрослых с использованием секвенирования маркерных генов (16S рРНК) и других подходов, ряд бактерий, но в первую очередь видов Corynebacterium , были связаны с неприятным запахом [6, 9, 10].Кроме того, определенные бактериальные ферменты и пути, которые воздействуют на непахучие белковые предшественники или продуцируют молекулы запаха, такие как уксусная кислота, летучие жирные кислоты, сульфанилы и тиоспирты, также были идентифицированы с использованием подходов, основанных на культуре [5-7, 10, 11] . Однако существуют значительные различия между физиологией, связанной с запахом, и микробиотой кожи взрослых и не взрослых. Например, апокриновые железы (в основном находящиеся в местах тела с волосяными фолликулами, например, в подмышечной впадине) неактивны до тех пор, пока не будут стимулированы гормональными изменениями в период полового созревания, и в отличие от эккринных желез, которые секретируют непрерывно, апокриновые железы секретируют периодически [12].Эккриновый пот (прозрачный, без запаха, pH 4,0–6,8, на 98–99% состоит из воды, но также содержащий хлорид натрия, жирные кислоты, молочную кислоту, лимонную кислоту, аскорбиновую кислоту, мочевину и мочевую кислоту) и апокриновый пот (без запаха, pH 6,0–7,5, содержащие воду, белки, углеводы, липиды и стероиды) имеют различный состав и распределение (все участки тела против внутренних волосяных фолликулов) [13]. Кроме того, сальные железы, которые выделяют маслянистое вещество без запаха, называемое кожным салом, в волосяные фолликулы (pH 4,5–5,5), имеют повышенную активность в период полового созревания [14].Таким образом, запах тела обычно считается значимым только у лиц, достигших полового созревания, и у взрослых, и в основном он изучался в области подмышечной впадины, где количество апокринных желез превышает количество эккринных желез в 10 раз.
Большинство исследований неприятного запаха проводилось в умеренном климате и на субъектах из Европы и Северной Америки. Считается, что азиаты, особенно выходцы из Восточной Азии, генетически предрасположены к уменьшению неприятного запаха [15, 16]. Однако жаркая и влажная тропическая среда может увеличить выделение потоотделения и связанное с этим возникновение неприятного запаха.Основываясь на обширных исследованиях в контексте Юго-Восточной Азии, мы определили, что запах тела действительно является серьезной проблемой для детей и подростков, не достигших полового созревания, как с точки зрения оценок родителей, так и с точки зрения экспертных оценок (дополнительный файл 1: таблица S1). Влияние неприятного запаха в детстве на эмоциональное, социальное и психологическое благополучие субъектов является неизведанной областью, но, вероятно, вызывает большее беспокойство, чем неприятный запах взрослых. Более того, поскольку секреция апокринных желез у детей неактивна, метаболические взаимодействия между хозяином и микробами, которые приводят к неприятному запаху, остаются невыясненными.
Для решения этой темы мы набрали когорту детей и подростков до полового созревания на Филиппинах, которые были оценены профессиональным парфюмером на предмет определения интенсивности запаха (диапазон 0–100) и характера (например, сладкого, жирного, прогорклого, кислого и т. hircine, сера), в дополнение к оценке их родителей (дополнительный файл 2: таблица S2). В план исследования входили отбор образцов из нескольких участков тела (шея, подмышки, голова), связанных с запахом тела, а также из нескольких временных точек после ванны и активного отдыха, чтобы систематически понять микробную основу запаха тела у этих людей.В общей сложности 180 образцов были подвергнуты глубокому анализу секвенирования всего метагенома, что позволило нам изучить членов бактериального, вирусного и эукариотического сообществ и их функциональную связь с неприятным запахом. Мультимодальный анализ, сочетающий регрессию к интенсивности запаха и дифференциальные сигнатуры до и после активного отдыха, использовался для выявления таксонов и функций микробов, связанных с неприятным запахом у детей (5–9 лет) и подростков (15–18 лет). Эти подписи частично перекрываются (например, S.hominis ), но также отличные от того, что было зарегистрировано во взрослых когортах. В целом, наше исследование подчеркивает важность перехода от «мешка генов» к анализу метагеномов «мешка геномов» для всестороннего изучения метаболических взаимодействий между хозяином и микробами.
Результаты
Отчетливая интенсивность запаха и характеристики, связанные с различными частями тела у детей и подростков
Наше исследование было основано на двух разных возрастных группах лиц: дети предпубертатного возраста (5–9 лет) и подростки (15–18 лет). лет), что позволяет более детально изучить микробную основу неприятного запаха на ранних этапах жизни (см. раздел «Материалы и методы», рис.a, Дополнительный файл 2: Таблица S2). В то время как подмышечная впадина (подмышечная впадина) была основным местом исследования неприятного запаха, исследования потребителей показали, что неприятный запах из области шеи (затылка) и головы (средняя часть волосистой части головы) также является областью, вызывающей беспокойство у семей, и поэтому были включены в это исследование ( Дополнительный файл 1: Таблица S1). Субъекты оценивались в двух временных точках, разделенных 7 часами отдыха и упражнений для образования потоотделения, что обеспечивало хорошо подходящую экспериментальную установку для учета вариабельности между хозяевами и исследования того, как микробы превращают предшественники пота в неприятный запах (рис.а). Кроме того, первая временная точка была сделана через 1 час после душа, что обеспечило стандартизованный исходный уровень для всех людей. Образцы были взяты в тот же день и в тот же день на Филиппинах (Манила) при относительно постоянной температуре окружающей среды 32 ° C и влажности 66%.
Дизайн исследования и взаимосвязь между интенсивностью запаха, характеристиками запаха, возрастом и участками тела. a Схема с подробным описанием целевых групп исследования, номеров образцов и точек времени сбора. b Распределение интенсивности запаха по участкам тела до (1 ч) и после (8 ч) упражнений и по возрастным группам (дети и подростки; ** p -значение <0.05, * p -значение <0,1). c Линии тренда, показывающие взаимосвязь между различными характеристиками запаха и интенсивностью запаха на разных участках тела (1 = присутствует, 0 = отсутствует). d Относительное распределение кислого запаха и запаха серы у субъектов до (1 ч) и после (8 ч) упражнений по возрастным группам и участкам тела. Точками отмечена интенсивность запаха, как показано на левой оси, в то время как гистограммы показывают количество субъектов, как показано на правой оси
В дополнение к группам запахов, оцененным родителями (дополнительный файл 2: таблица S2), запах оценивался одним профессиональным парфюмером. интенсивность и характер во всех предметах, местах и во все моменты времени.Как и ожидалось, интенсивность запаха, измеренная профессиональным парфюмером, была значительно выше в подмышках у детей и подростков после физических упражнений (тест Вилкоксона p — значение <0,05) (рис. B). Незначительное увеличение интенсивности запаха было также обнаружено в области шеи и головы у подростков и детей, соответственно (критерий Вилкоксона p — значение <0,1). У подростков раньше была более высокая интенсивность запаха, чем у детей в подмышечной области (тест Вилкоксона , p -значение = 2.4 × 10 — 4 ) и после (тест Вилкоксона p -значение = 2,6 × 10 — 4 ) упражнений, и в целом интенсивность запаха была ниже в области шеи и головы по сравнению с областью подмышек. Что касается характеристик запаха, то в области подмышек и шеи наблюдались кислые запахи и запахи серы со средней и высокой интенсивностью запаха, соответственно (рис. C). Напротив, область головы в первую очередь характеризовалась жирным запахом, подчеркивая, что разные области тела, вероятно, имеют разный микробный метаболизм, способствующий возникновению неприятного запаха.Анализ характеристик запаха по возрастным группам и временным точкам показал, что, в то время как дети в первую очередь определяются характеристиками запаха кислого или кислого + серы, подростки с большей вероятностью будут иметь характеристику кислый + сера, которая смещается к доминирующей характеристике серы после упражнений (рис. D). . Однако это свойство, по-видимому, характерно для подмышек, а в области шеи и головы как у детей, так и у подростков преобладает кислый запах (рис. D). Эти наблюдения обеспечивают важный фон для нашего анализа микробного вклада в неприятный запах в следующих разделах.
Особенности микробиома кожи в разных возрастных группах и в связи с неприятным запахом
Для изучения таксономического и функционального состава микробиома кожи в нашей когорте образцы были собраны с использованием недавно установленного протокола снятия ленты [17], обеспечивающего достаточное количество ДНК для построения метагеномные библиотеки дробовика для 100% наших образцов и ни одного из контрольных образцов (коллекционные и лабораторные контроли). Глубокое секвенирование на платформе Illumina было использовано для характеристики образцов микробиома кожи для всех людей, участков и временных точек (180 образцов, ~ 69 миллионов считываний в среднем; дополнительный файл 2: таблица S2).В среднем чтения были высокого качества (> Q30), при этом более 98% чтений можно было использовать после качественной фильтрации (дополнительный файл 2: таблица S2). Используя метагеномные данные для перекрестного анализа царств, мы отметили, что разные участки тела демонстрировали различное распределение уровней царства (дополнительный файл 1: рисунок S1). Бактерии в большей степени присутствовали в образцах подмышек (тест Вилкоксона p — значение <3 × 10 — 4 ), в то время как эукариоты были сравнительно более многочисленными на детских головах (тест Вилкоксона p — значение <2 × 10 — 9 ), а образцы шеи имели уникально более высокую относительную долю вирусов (тест Вилкоксона p — значение <7 × 10 — 3 ).Повышенное количество вирусов и эукариот в областях головы и шеи аналогично тому, что наблюдалось в близлежащих участках (ретроаурикулярная складка, затылок) у взрослых, что свидетельствует об уникальных нишах, которые они предлагают [18].
Определенные сигнатуры микробиома появились для каждого участка тела на уровне видов и рода бактерий (дополнительный файл 1: рисунки S2, S3), несмотря на наличие явных различий между микробиомами подростков и детей (рисунок а, дополнительный файл 1: Рисунок S4).Например, Staphylococcus hominis является наиболее распространенным видом бактерий в подмышечной области, несмотря на заметные различия между детьми и подростками (70% против 37%; тест Вилкоксона p -значение <5 × 10 — 4 ). Точно так же, хотя повышенное присутствие M. globosa и C. acnes отличает шею и голову от подмышек, у детей на голове относительно больше M. globosa , тогда как у подростков преобладают C.acnes (рис. а, дополнительный файл 1: рис. S3, S4). Эти различия коррелируют с изменениями активности апокринных желез в период полового созревания и могут служить основой для различий в характеристиках неприятного запаха между детьми и подростками. Кроме того, у всех субъектов было гораздо меньшее количество видов Corynebacterium в подмышечных впадинах, чем то, что наблюдалось у взрослых [9], что позволяет предположить, что отдельные виды могут играть роль в неприятном запахе в этих возрастных группах.
Связь между микробиомом кожи, интенсивностью запаха, возрастом и временем отбора проб. a Относительная численность кожных микробов (> 0,1%) на разных участках на уровне родов и видов. Данные представлены как средняя относительная численность внутри группы. b Диаграммы распределения для канонического анализа основных координат (CAP), иллюстрирующие силу связи между интенсивностью запаха, возрастом, временем отбора проб и микробиомом кожи. Анализ CAP основан на несходстве Брея-Кертиса. Размер каждой точки представляет собой оценку относительной интенсивности запаха в каждом образце, а число, перекрывающее каждую точку, указывает образцы, собранные до (1) или после (8) упражнения
Канонический анализ основных координат изменения микробиома кожи на разных участках тела в отношение к возрастной группе, полу и временным точкам (1 час или 8 часов) дополнительно иллюстрирует силу связи между интенсивностью запаха, возрастом, временем отбора проб и микробиомом кожи (рис.б). В подмышечной области конкретные возрастные группы и время отбора образцов хорошо коррелируют с интенсивностью запаха (значение p <0,001) и в меньшей степени с полом (значение p <0,05) в зависимости от состава микробиома кожи. Этот образец также наблюдается на шее, но не имеет значения на голове, где существует более сильная связь с полом (дополнительный файл 1: рисунок S5). Состав микробиома в области головы также уникален тем, что не кажется, что он заметно меняется после тренировки.Одна из возможностей для этого - ограниченное воздействие душа на микробиом кожи головы по сравнению с другими участками, поскольку микробы, находящиеся в волосяном фолликуле, делают микробиом кожи головы более стабильным и эластичным.
Виды Staphylococcus сильно коррелируют с интенсивностью запаха у детей и подростковМы отметили, что дети, принадлежащие к определенным родителями категориям («неприятный запах» и «без неприятного запаха»), не демонстрировали существенно различающуюся интенсивность запаха, как это определено профессиональным парфюмером. , по возрастным группам и временным точкам (Дополнительный файл 1: Рисунок S6), потенциально подчеркивая проблемы, связанные с тем, чтобы при таком анализе полагаться исключительно на восприятие потребителей.Однако группы «неприятного запаха» действительно показали тенденцию к более высокой интенсивности запаха, и эта разница может достигать статистической значимости при больших размерах выборки. Вместо проведения категориального анализа в этом исследовании мы искали таксоны и функции микробов, которые напрямую связаны с определяемой парфюмером интенсивностью запаха (см. Раздел «Материалы и методы»). Кроме того, доступность данных из двух временных точек, до и после тренировки, в дальнейшем использовалась для определения таксонов и функций микробов, которые изменяются в долгосрочном плане в связи с повышенным выделением пота и запаха (см. Раздел «Материалы и методы», Дополнительный файл 1: Рисунок S7, таблица).
Таблица 1
Список микробов на уровне видов, которые показывают значительную корреляцию с интенсивностью запаха, по крайней мере, в одной возрастной группе
Виды | Молодежь | Дети | Подростки | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Спирмена 18 4 902 Wilcoxon | Spearman’s ρ | Wilcoxon | Spearman’s ρ | Wilcoxon | | |||||||
ρ | p -значение | p -значение | ρ | p -значение | p -значение | ρ | p -значение | p -значение | ||||
Подмышки | ||||||||||||
Staphylococcus epidermidis | 0.67 | 5 × 10 −7 | ↑ | 0,04 | 0,44 | н.у. | ↑ | н.у. | 0,40 | н.у. | ↑ | н.у. |
Cutibacterium avidum | 0,63 | 5 × 10 −6 | ↑ | н.у. | 0,52 | н.у. | ↑ | н.у. | 0,31 | н.у. | ↑ | н.у. |
Corynebacterium pseudogenitalium | 0.44 | 10 −2 | ↓ | н.у. | 0,42 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,13 | н.у. | ↑ | н.у. |
Corynebacterium tuberculostearicum | 0,38 | 0,06 | ↓ | н.у. | 0,35 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,18 | н.у. | ↑ | н.у. |
Malassezia globosa | 0.53 | 7 × 10 −4 | ↓ | н.у. | 0,37 | н.у. | ↓ | н.у. | 0,33 | н.у. | ↑ | н.у. |
Шея | ||||||||||||
Staphylococcus hominis | 0,32 | n.s. | ↑ | н.у. | 0,65 | 10 −2 | ↑ | н.у. | 0,09 | н.у. | ↑ | н.с. |
Staphylococcus phage StB27 | 0,49 | 0,02 | ↑ | n.s. | 0,77 | 10 −4 | ↑ | н.у. | 0,19 | н.у. | ↑ | н.у. |
Cutibacterium granulosum | — 0,45 | 0,03 | ↓ | 0,06 | — 0,48 | н.у. | ↓ | н.у. | — 0,38 | н.у. | ↓ | н.у. |
Acinetobacter schindleri | — 0,43 | 0,03 | ↓ | 0,07 | — 0,47 | н.у. | ↓ | н.у. | — 0,30 | н.у. | ↓ | н.у. |
Cutibacterium acnes | — 0,28 | n.s. | ↓ | н.у. | — 0.54 | 0,08 | ↓ | н.у. | — 0,21 | н.у. | ↓ | н.у. |
В целом, между поперечным и продольным анализом наблюдались устойчивые тенденции, где таксоны, которые были положительно коррелированы с неприятным запахом, также увеличивались в изобилии после упражнений (таблица). Анализ по возрастным группам выявил ключевые различия между группами; хотя в некоторых случаях тонкие, но устойчивые тенденции усиливались путем объединения данных по возрастным группам (обозначенным как «Молодежь»).Например, в подмышечной области Staphylococcus epidermidis продемонстрировал наиболее сильную связь с неприятным запахом, когда обе возрастные группы были проанализированы совместно (дополнительный файл 1: рисунок S7, таблица), хотя тенденция постоянно наблюдалась в каждой возрастной группе и во временные точки до и. после тренировки. Напротив, на шее Staphylococcus hominis было связано с интенсивностью неприятного запаха, но только у детей ( ρ = 0,65) и с низкой корреляцией, наблюдаемой у подростков ( ρ = 0.09; Дополнительный файл 1: рисунок S7, таблица). Интересно, что фаг Staphylococcus также обнаружил положительную корреляцию с неприятным запахом, что потенциально обусловлено ассоциацией его видов-хозяев и подчеркивает важность взаимодействия фага-бактерии на коже [19, 20]. Этот анализ дополнительно подчеркивает важную роль, которую виды Staphylococcus играют в неприятном запахе у детей, и определяет их конкретный вклад в различных участках тела и возрастных группах [5, 8].
A Cutibacterium видов ( C. avidum ) был единственным другим организмом с устойчивой ассоциацией с более сильным неприятным запахом, особенно в подмышечной области, хотя его значение остается неясным. Другие виды Cutibacterium ( C. granulosum , C. acnes ) были отрицательно связаны с неприятным запахом в области шеи (таблица), возможно, из-за межбактериальной конкуренции с видами Staphylococcus [21, 22]. Corynebacterium видов ( C.pseudogenitalium и C. tuberculostearicum ) положительно коррелировали с интенсивностью запаха в подмышечной области, но с постоянным увеличением относительной численности после упражнений, наблюдаемым только у подростков (таблица). Поскольку известно, что виды Corynebacterium продуцируют запахи серы [23, 24], это наблюдение может быть отражением того факта, что в микробиоме кожи подмышек до полового созревания отсутствуют предшественники из апокринной секреции, чтобы поддерживать их метаболизм в сернистый неприятный запах.
Интересно, что видов Acinetobacter (в частности, A. schindleri ) были обогащены в области шеи детей с более низкой интенсивностью неприятного запаха, а также в 1-часовой временной точке. Пути, задействованные у этих видов в ослаблении восприятия неприятного запаха, неясны, но один из возможных механизмов — это конкуренция с другими микробами через разложение предшественников неприятного запаха на алифатические молекулы [25]. В соответствии с нашим более ранним анализом (дополнительный файл 1: рис. S5), не было обнаружено, что микробы связаны с неприятным запахом в области головы.
В целом, эти анализы подчеркивают различные микробные ассоциации с запахом тела и то, что различное распределение ключевых микробных факторов и компонентов запаха по людям, участкам тела, возрастным группам и временным точкам может играть роль в образовании запаха. Примечательно, что анализ микробиома на уровне родов не смог выявить ключевые ассоциации в подмышечной области (дополнительный файл 1: таблица S3), что подчеркивает важность видовых различий и сильные стороны метагеномного анализа дробовика для изучения микробов, связанных с неприятным запахом.В частности, наши результаты подчеркивают доминирующую роль, которую S. epidermidis может играть в неприятном запахе подмышек с кислыми характеристиками, который мы часто отмечали у детей и, в некоторой степени, у подростков (рис. D). Переходный период полового созревания приводит к усилению преобладания серы в запахе, и сдвиги в активности Staphylococcus и Corynebacterium могут способствовать этому [5] . Мы дополнительно исследуем эти отношения в следующем разделе с помощью анализа путей, связанных с неприятным запахом, в микробиоме кожи.
Идентификация продукции изовалериановой и уксусной кислоты как ключевого пути, связанного с неприятным запахом, у детей и подростков
В рамках плана исследования пот тела был собран у субъектов, объединен и использован для различных анализов (высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), жидкостная хроматография и газовая хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ / ГХМС)) для выявления предшественников запаха, которые могут по-разному присутствовать у детей и подростков (см. Раздел «Материалы и методы»).Этот анализ показал, что молочная кислота была самым распространенным предшественником у детей и подростков, за ней следовали глицерин (больше у подростков), изолейцин и лейцин (дополнительный файл 1: таблица S4). Затем объединенный пот инкубировали в течение 24 часов для измерения продукции молекул, связанных с неприятным запахом, с использованием GC-ольфактометрии (GC-O) и анализа GCMS (дополнительный файл 1: рисунок S8 и дополнительный файл 2: таблица S5). В целом, дети и подростки выявили схожие профили GCMS и GC-O, причем подростки были более богаты доминирующими соединениями — уксусной кислотой и изовалериановой кислотой.Эти два сильнодействующих одоранта имеют характер кислого / кислого запаха, что позволяет предположить, что наблюдаемый «букет кислинки» у наших испытуемых в значительной степени обусловлен этими двумя одорантами.
На основе этой информации мы затем перешли к функциональному анализу, чтобы обнаружить гены и пути, связанные с неприятным запахом, in vivo и на основе данных. Мы использовали подход, аналогичный тому, который использовался для таксономического анализа, чтобы идентифицировать гены и начальный набор путей, коррелирующих с интенсивностью неприятного запаха, и тех, которые чрезмерно представлены после физических упражнений и образования потоотделения (см. Раздел «Материалы и методы»; Дополнительный файл 2: Таблица S6 ).Затем значительно ассоциированные гены были агрегированы в путях, чтобы понять их вклад в производство соединений, вызывающих неприятный запах. Сначала мы использовали подход «мешка генов», который обычно используется в метагеномике, агрегируя изобилие генов без учета таксономического происхождения считываний, чтобы найти ассоциации с неприятным запахом. Однако сопоставление идентифицированных генов с путями не выявило устойчивых ассоциаций внутри пути (например, Дополнительный файл 1: Рисунок S9), вероятно, из-за присутствия нескольких родственных видов (например.g., S. epidermidis и S. hominis ) с явным вкладом в неприятный запах. Напротив, анализ «мешка геномов», который включал видовую идентичность генов, выдвинул на первый план несколько значимых и последовательных ассоциаций путей и соответствующий вклад видов (дополнительный файл 2: таблица S7).
В частности, в подмышечной области метаболизм пирувата и метаболизм аминокислот с разветвленной цепью были обогащены генами S. epidermidis , которые значительно положительно коррелировали с неприятным запахом, что согласуется с нашим таксономическим анализом (рис.а) . Ферменты, полученные из S. epidermidis , участвуют в каскаде множества метаболических путей, ведущих к выработке как уксусной кислоты, связанной с кислым запахом, так и изовалериановой кислоты. Молочная кислота и глицерин превращаются в пируват в процессе гликолиза. В присутствии пирувата ферменты, ответственные за биосинтез и последующее разложение лейцина, валина и изолейцина с образованием изовалериановой кислоты жирной кислоты с разветвленной цепью (например, ключевые ферменты ацетолактатсинтазы (EC: 2.2.1.6) и трансаминазы аминокислот с разветвленной цепью (EC: 2.6.1.42)), как было обнаружено, в значительной степени связаны с неприятным запахом (рис. B, c). Независимым путем было обнаружено, что ферменты, участвующие в окислительной деградации алифатических карбоксилатов пирувата до ацетил-КоА (конверсия Свансона) в процессе, который является ключевым для производства уксусной кислоты и кислого запаха, связаны с неприятным запахом у S. epidermidis (Рис. D; например, пируватдегидрогеназа (EC: 1.2.4.1)). Эти результаты согласуются с ранее опубликованными исследованиями in vitro [10].Подобные пути были также связаны с неприятным запахом в шее, но на этот раз ассоциации были замечены в первую очередь с генами S. hominis и, что более важно, у детей (рис.).
Пути и ферменты, связанные с производящими кислый запах соединениями в подмышечной области. a Количество ферментов (КО), кодируемых микробами, связанными с неприятным запахом, в подмышечной области для путей «биосинтеза / разложения валина, лейцина и изолейцина» и «метаболизма пирувата» KEGG. Цифры в столбиках указывают количество КО, относительное содержание которых в значительной степени коррелирует с интенсивностью запаха. b — d Соответствующие диаграммы путей KEGG, где розовые прямоугольники указывают на значимые положительно коррелированные КО в S. epidermidis среди подростков, а серые прямоугольники указывают на ферменты, которые присутствуют, но не имеют значительной корреляции с интенсивностью запаха. Соединения, вызывающие запах, и их прекурсоры отмечены звездочкой (*).
Пути и ферменты, связанные с соединениями, вызывающими кислый запах, в области шеи. a Количество ферментов (КО), кодируемых микробами, связанными с неприятным запахом, в области шеи для путей «биосинтеза / разложения валина, лейцина и изолейцина» и «метаболизма пирувата» KEGG.Цифры в столбиках указывают количество КО, относительное содержание которых в значительной степени коррелирует с интенсивностью запаха. b — d Соответствующие диаграммы путей KEGG, где розовые прямоугольники указывают на значимые положительно коррелированные KO у Staphylococcus видов среди детей, а серые прямоугольники указывают на ферменты, которые присутствуют, но не имеют значительной корреляции с интенсивностью запаха. Соединения, вызывающие запах, и их прекурсоры отмечены звездочкой (*)
3-метил-3-сульфанилгексанол (3M3SH), 3-метил-2-гексеновая кислота (3M2H) и 3-метил-3-гидроксигексановая кислота. (HMHA) — известные одоранты, ответственные за запах подмышек у взрослых [7].Для производства 3-метил-3-сульфанилгексанола (3M3SH), который связан с неприятным запахом с характеристиками серы, мы наблюдали положительную связь с обоими видами Staphylococcus ( S. hominis и S. epidermidis ; дополнительный файл 1: Рисунок S10). Предыдущие наблюдения in vitro продемонстрировали способность S. hominis , но не S. epidermidis , генерировать 3MS3H [5]. Наши метагеномные результаты указывают на присутствие цистатионин-бета-лиазы в S.epidermidis , что позволяет предположить, что кроме S. hominis , штаммы S. epidermidis , выделенные в азиатских популяциях, также могут генерировать 3M3SH. Для подтверждения этой возможности необходимы дальнейшие эксперименты in vitro. Для 3M2H и HMHA наш анализ GCMS обнаружил отсутствие или минимальное присутствие этих одорантов. Кроме того, наши метагеномные данные не выявили присутствия Corynebacterium striatum и фермента аминоацилазы (agaA; у детей и подростков), которые, как было показано, опосредуют продукцию HMHA [23].Эти данные показывают, что эти молекулы вряд ли будут основными причинами неприятного запаха в наших когортах по сравнению с их ключевой ролью у взрослых [14].
Чтобы проверить связь видов Staphylococcus с характеристиками кислого запаха, мы культивировали изоляты в стерилизованных пулах пота, полученных от субъектов, включенных в исследование, и измерили продукцию различных соединений с неприятным запахом с помощью анализа GCMS (см. Раздел «Материалы и методы» ). В то время как оба вида Staphylococcus были способны продуцировать значительные количества уксусной кислоты и изовалериановой кислоты, другие виды, обычно встречающиеся на коже, такие как C.acnes и M. luteus — нет (рис.). Эти результаты подчеркивают основную роль видов Staphylococcus в производстве уксусной кислоты, изовалериановой кислоты и 3M3SH из предшественников запаха в поте и в объяснении характеристик запаха кислого и серного, наблюдаемого у азиатских детей и подростков.
Способность превращать предшественники пота в соединения, вызывающие неприятный запах, у различных микробов кожи. GCMS — результат инокуляции одной бактерии в течение 24 часов в поте, собранном у субъектов.Обратите внимание, что только S. epidermidis и S. hominis продуцируют значительные количества уксусной кислоты и изовалериановой кислоты, что согласуется с ассоциациями, наблюдаемыми in vivo. Эксперименты с культивированием проводились в аэробных условиях.
Обсуждение
Неприятный запах — это фенотип, который, как хорошо известно, возникает в результате специфических взаимодействий между предшественниками запаха хозяина и поддерживаемым ими микробным метаболизмом [6]. В этом отношении данное исследование служит идеальной испытательной площадкой для изучения аналитических подходов к раскрытию метаболических взаимодействий между хозяином и микробиомом, которые определяют интересующий фенотип.В то время как неприятный запах у взрослых и европейцев широко изучался [5, 6, 9], неприятный запах у азиатов и особенно у детей и подростков не получил должного внимания. Наши исследования показывают, что это действительно проблема потребительского интереса, которая влияет на качество жизни пострадавших детей, предполагая, что ее влияние на психологическое благополучие детей заслуживает дальнейшего исследования.
При разработке исследования по выявлению видов и путей распространения микробов, связанных с неприятным запахом, необходимо учитывать несколько аспектов, включая возможность того, что могут быть таксоны, которые медленно растут, но сильно связаны с неприятным запахом, в то время как другие могут вызывать неприятный запах только тогда, когда они достаточно обильный.Таким образом, наш дизайн включал как продольные (использование упражнений для создания предшественников пота и запаха), так и поперечные аспекты в разных возрастных группах, чтобы в целом уловить различные сигналы ассоциации. Наши данные показывают, что в большинстве случаев имеются согласованные сигналы от продольного и поперечного анализов, за исключением видов Corynebacterium и M. globosa в подмышечных впадинах детей, чье явное снижение относительной численности при физических упражнениях (несмотря на положительную корреляцию с неприятным запахом) может быть связано с их более медленным ростом по сравнению с S.Эпидермодис . Кроме того, данные этого исследования подчеркивают различные микробные факторы, влияющие на запах тела в разных возрастных группах и участках тела, например, было обнаружено, что S. hominis имеет сильную связь с неприятным запахом в области шеи у детей, в то время как область подмышек показала значимая связь с S. epidermidis . И это несмотря на обилие S. hominis в подмышечной области, что позволяет предположить, что здесь играют роль различия в предшественниках пота из области шеи и подмышек и что S.epidermidis может иметь чрезмерный эффект в отношении образования неприятного запаха, когда присутствуют правильные предшественники.
Предыдущая работа по изучению микробного вклада в неприятный запах подмышек в первую очередь подчеркивала роль видов Corynebacterium [7] у взрослых. Используя секвенирование 16S рРНК, эти исследования показали, что виды Corynebacterium , Staphylococcus и Cutibacterium являются доминирующими бактериями в подмышечной области [9, 26–28]. Из них видов Corynebacterium оказались более многочисленными, чем видов Staphylococcus в группах лиц, не использующих антиперспиранты или дезодоранты [26].Также было обнаружено, что неприятный запах в подмышечной впадине взрослых обычно определяется характеристиками серы или прогорклого запаха от 3M3SH, 3M2H и HMHA, генерируемых в основном видами Corynebacterium [7, 9, 29]. Для сравнения, наше исследование показывает, что видов Corynebacterium менее многочисленны у детей и подростков, а видов Staphylococcus более многочисленны. Это различие может быть частично связано с тем, что микросреда подмышечной впадины у детей и подростков формируется эккринной секрецией.Хотя технические различия в профилировании метагенома также могут влиять на эти сравнения, мы отмечаем, что метагеномика дробовика и профилирование 16S рРНК показали хорошее соответствие в предыдущем исследовании [17]. Кроме того, в этом исследовании было обнаружено, что кислый запах чаще встречается у детей, и, соответственно, наш анализ подчеркнул центральную роль видов Staphylococcus в запахе тела у детей. Среди Staphylococcus видов, тогда как в большинстве более ранних исследований изучалась роль S.haemolyticus и S. hominis [5, 23], наша работа является первой, которая определяет роль S. epidermidis в возникновении неприятного запаха из подмышек у детей. Это имеет серьезные последствия с точки зрения мер по борьбе с неприятным запахом — в то время как основной подход для взрослых использует антиперспиранты для контроля образования неприятного запаха медленнорастущими видами Cornybacterium , противомикробные препараты могут быть более подходящими для быстрорастущих видов Staphylococcus у детей в качестве антиперспирантов. было замечено, что они относительно обогащают их [26].Кроме того, поскольку S. epidermidis является важным кожным комменсалом [30], могут потребоваться методы лечения следующего поколения, которые блокируют активность определенных ферментов, выявленных в этом исследовании.
Что касается влияния генетики хозяина на неприятный запах, несколько исследований описали ассоциацию аллелей ABCC11 с запахом тела у взрослых и показали, что люди, несущие аллели GG / GA, имеют усиленный запах из-за генерации 3M3SH, 3M2H, и HMHA из апокринового пота [15, 16, 31].Большинство населения Филиппин (от ~ 72 до 78%) имеет аллель GG / GA, и, следовательно, взрослые на Филиппинах более подвержены неприятному запаху с серными / прогорклыми характеристиками [15, 32]. У детей до полового созревания апокринные железы не полностью активированы [12], и, таким образом, прекурсоры эккринового происхождения могут играть более значительную роль в наблюдаемых характеристиках запаха. Апокринные железы сравнительно более активны у подростков, чей профиль неприятного запаха, как ожидается, будет более похож на профиль взрослых.Эти ожидания совпадают с нашими наблюдениями более высокой интенсивности запаха у подростков по сравнению с детьми и перехода к более серным характеристикам у подростков.
Наш биоинформатический анализ в этом исследовании еще раз высветил проблемы подхода «мешка генов» к изучению функции микробиома с метагеномными данными. Микробы обмениваются метаболитами контролируемым образом, и предположение, что несколько этапов метаболического процесса могут выполняться у разных видов в «метагеноме», не всегда может быть целесообразным [33, 34].Кроме того, ферменты разных видов, принадлежащие к одному и тому же классу ферментов, могут иметь очень разную эффективность и субстратную специфичность [35], например, объясняя, почему S. epidermidis ассоциировался с неприятным запахом из подмышек у детей, а S. hominis — нет. . Эта проблема проиллюстрирована недавним отчетом, показывающим, что метагеномные конвейеры могут выделять очень разные функциональные пути с использованием одного и того же набора данных [36]. Переход к анализу «мешка геномов» может обеспечить лучшую интерпретируемость наборов метагеномных данных, но существенным ограничением является возможность идентифицировать разные гены, принадлежащие одному и тому же геному.Усовершенствованные подходы к кластеризации и сборке, обеспеченные достижениями в технологии секвенирования, могут помочь устранить эти ограничения в будущем [37, 38].
Насколько нам известно, это первый отчет, в котором описаны таксоны, которые отрицательно коррелируют с неприятным запахом, но механизм их действия остается неясным. Эти ассоциации могут быть вызваны различными причинами, включая (а) производство соединений, которые маскируют неприятный запах или имеют более низкую интенсивность запаха (как предлагается здесь для P. avidum ), (б) микробная конкуренция или ингибирование, ведущее к уменьшению роста неприятного запаха; ассоциированные виды (как было описано между Malassezia и Staphylococcus видов [39]), и (c) метаболические процессы, которые приводят к тому, что ключевые предшественники запаха становятся недоступными для образования соединений неприятного запаха.Проведенные здесь культуральные эксперименты с человеческим потом предоставили уникальную основу для реалистичного моделирования доступности прекурсоров и подчеркнули вклад видов Staphylococcus в образование запаха. Дальнейшие эксперименты с консорциумами бактерий могут помочь изучить взаимодействия между ними и, таким образом, определить механизмы уменьшения неприятного запаха.
Материалы и методы
Дизайн клинического исследования
Для этого исследования были набраны две группы субъектов: (1) 15 детей, состоящих из 8 женщин и 7 мужчин, в возрасте от 5 до 9 лет и (2) 15 подростков, состоящих из 8 женщин. и 7 мужчин от 15 до 18 лет.В начале исследования (0 ч) испытуемым давали для душа стандартное кусковое мыло (без антимикробных активных веществ и отдушек). Через час после душа назначенный профессиональный парфюмер оценил интенсивность запаха (диапазон от 0 до 100) и характер в области подмышек, задней части шеи и кожи головы. Образцы микробиома были собраны сразу после этого для каждого участка путем снятия ленты (D100 D-squame, CuDerm). Каждую полоску ленты прикладывали десять раз к коже со стандартизованным давлением в течение 1 с и помещали в 1.Пробирка Эппендорфа 5 мл на льду. Затем испытуемые выполняли 4–5 часов интенсивных упражнений в среде с температурой 32 ° C и относительной влажностью 66%. Вкратце, испытуемые были разделены на группы, чтобы выполнять комбинацию физических нагрузок (беговая дорожка, езда на велосипеде в помещении, аэробика и баскетбол) поочередно под руководством профессионального инструктора. Физические нагрузки выполнялись с интервалом 10–15 мин с перерывом 10–15 мин. Во время перерыва были собраны образцы пота, и участники поддерживали водный баланс.В 8-часовой временной точке, интенсивность запаха, характер запаха и образцы микробиома были собраны снова, как описано выше (левая или правая подмышка выбирались случайным образом, но оставались неизменными по временным точкам). Испытуемые находились в среде без кондиционирования воздуха в течение 8 часов.
Обработка образцов и экстракция ДНК
Ленточные полоски переносили в пробирки Lysing Matrix E (MP Biomedicals) и добавляли 500 мкл буфера ATL (Qiagen). Образцы подвергали взбиванию шариками с помощью прибора FastPrep-24 (MP Biomedicals) на скорости 6.0 м / с в течение 40 с. Затем образцы центрифугировали при 16000 г в течение 5 минут, 200 мкл супернатанта обрабатывали 10 мкл протеиназы K (Qiagen) и инкубировали при 56 ° C в течение 15 минут. ДНК экстрагировали с помощью EZ1 Advanced XL Instrument (Qiagen) с набором EZ1 DNA Tissue Kit (Qiagen) с объемом элюции 100 мкл и количественно определяли с помощью набора Qubit dsDNA HS Assay Kit (Life Technologies), а затем хранили в морозильной камере — 20 ° C. .
Подготовка библиотеки, комбинаторное объединение и секвенирование
Стандартный объем экстрагированной ДНК в 50 мкл подвергали сдвигу с использованием Adaptive Focused Acoustics ™ (Covaris).Библиотеки ДНК получали с использованием основного набора Gene Read DNA Library I (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя, за исключением использования пользовательских адаптеров вместо набора адаптеров GeneRead I. Пользовательские индексные праймеры использовали для обогащения библиотек ДНК, которое выполняли в соответствии с протоколом обогащения, адаптированным из набора олигонуклеотидов для подготовки мультиплексных образцов (Illumina). Количественную оценку библиотек проводили с использованием Agilent Bioanalyzer, подготовленного с помощью набора Agilent High Sensitivity DNA Kit или Agilent DNA1000 Kit (Agilent Technologies).
Чтобы избежать пакетных эффектов, объединение библиотеки всего метагенома было выполнено комбинаторным способом (дополнительный файл 2: таблица S8). Что касается подмышек, образцы от детей и подростков были равномерно разделены на две партии подготовки библиотеки, причем каждая партия содержала равное количество детей, подростков, образцов с более сильным неприятным запахом и более слабым неприятным запахом. Библиотеки образцов от детей были затем объединены в эквимолярных количествах на одной полосе, а библиотеки образцов от подростков на другой дорожке.Для областей шеи и головы библиотеки были построены путем подготовки образцов от одного и того же объекта (1 час и 8 часов) один за другим, чередуя детей и подростков, а также образцов с более сильным неприятным запахом и более слабым неприятным запахом. Образцы с каждого сайта сбора были объединены в один пул. Парное секвенирование (считывание 2 × 101 п.н.) было выполнено на успешных библиотеках ДНК с использованием платформы Illumina HiSeq 2000.
Предварительная обработка чтения
После демультиплексирования чтения были отфильтрованы с помощью программного обеспечения Bcl2fastq (CASAVA version 1.8.4) от Illumina, и FastQC был выполнен для оставшихся чтений (Pass Filter Reads). Основания секвенирования с показателями качества ниже 30 были обрезаны с 5′- и 3′-концов каждого считывания, а считывания с длиной менее 30 нуклеотидов были удалены. Человеческие чтения были отфильтрованы путем сопоставления с человеческим геномом (GRCh48) с использованием BWA-MEM [40] (версия 0.7.13-r1126; параметры по умолчанию), оставив после себя 4,71 миллиарда нечеловеческих парных и одноэлементных считываний.
Таксономическая классификация
Таксономическое профилирование образцов было выполнено по всем таксономическим рангам с использованием MetaPhlAn2 [41] (версия 2.5.0; параметры по умолчанию). MetaPhlAn2 использует гены-маркеры клады, охватывающие бактериальные, архейные, вирусные и эукариотические микробы, для выполнения однозначных таксономических задач. Метагеном каждого образца анализировали независимо для вычисления относительной численности. Затем выходные файлы были объединены в единую таблицу с указанием относительной численности на образец (столбцы) и на микроб (строка). Таксоны со средней относительной численностью> 1% у детей или подростков были консервативно определены для каждого участка тела для дальнейшего статистического анализа.
Функциональное профилирование
HUMAnN2 [33] (v0.7.1; параметры по умолчанию) было запущено с базой данных белков UniRef90 для получения функциональных профилей для каждого метагенома. HUMAnN2 обеспечивает (i) численность каждого семейства ортологичных генов UnifRef, указанную в виде числа чтений на килобазу (RPK), (ii) численность путей MetaCyc в RPK и (iii) охват каждого пути MetaCyc, масштабируемое от 0 до 1. Ген Семьи и пути со средними значениями RPK> 10 по выборкам от детей или подростков были сохранены и были повторно нормализованы до относительной численности для последующего анализа ассоциации, в то время как путь MetaCyc рассматривался для дальнейшего статистического анализа только в том случае, если средний охват путей по всем образцам было> 0.3. В целом, мы идентифицировали 69 792, 65 939 и 45 684 уникальных семейства генов из метагеномов подмышек, шеи и головы, соответственно. Для путей MetaCyc существует 89 (подмышками), 103 (шея) и 83 (голова) путей, которые соответствуют указанным выше критериям. Процент считываний, назначенных семействам и путям генов, а также считываний без назначения можно найти в Дополнительном файле 2: Таблица S9. Вклад каждого таксона в семейство генов и путь также определяли на основе таксономического назначения каждого считывания из выходов HUMAnN2.Вклад в семейство генов был визуализирован путем сопоставления идентификаторов UniRef90 с идентификаторами ортологической группы KEGG в путях KEGG [42] (версия обновлена в феврале 2016 г.).
Статистический анализ
Многомерный анализ для оценки ассоциаций между интенсивностью запаха, возрастом и микробными сообществами до и после тренировки был выполнен с использованием подхода канонического анализа основных координат (с несходством Брея-Кертиса), реализованного в веганском R-пакете ( версия 2.4-3).Существенные связи между таксонами / функциями микробов и неприятным запахом были выявлены с помощью комбинации статистических тестов, в которых (i) коэффициент корреляции Спирмена между интенсивностью запаха и таксонами / функциями микробов использовался для поперечного анализа и (ii) ранговый критерий Вилкоксона для анализа численность до и после тренировки использовалась для продольного анализа. Значения p были скорректированы с использованием подхода Бенджамини-Хохберга, и все статистические анализы были выполнены в R.Для путей, которые считались обнаруженными, было проведено ассоциативное тестирование для молодежи, детей и подростков, чтобы выявить те, у которых скорректированные по FDR значения p <0,1, по крайней мере, в двух из шести сравнений в качестве возможных путей для дальнейшего анализа на уровне генов.
Выделение микробов из подмышечной области у субъектов
В этом исследовании микробы были собраны в асептических условиях путем мазка подмышечной области с использованием предварительно увлажненного (стерильного 0,15 M NaCl + 0.1% раствор Твин 20) тампоны из хлопка (Puritan Med). Образец мазка от субъекта с наивысшей интенсивностью запаха помещали на кровяной агар TSA (Thermo Fisher Scientific) и инкубировали при 37 ° C в течение ночи. Репрезентативные одиночные колонии на основе морфологии были отобраны и недавно субкультивированы для масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF (Bruker) для идентификации видов. Идентификация видов была дополнительно подтверждена секвенированием 16S рРНК (Charles River). Выбранные представляющие интерес бактерии ( Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus hominis, Cutibacterium acnes и Micrococcus luteus ) затем суспендировали в криогенных гранулах (Thermo Fisher Scientific) и хранили в морозильной камере — 80 ° C.
Сбор пота и эксперименты по культивированию
Человеческий пот собирали из области подмышек и шеи у нескольких человек в этом исследовании, используя 1,5 мл пробирки Эппендорфа, объединяли в стерильные 50 мл пробирки и хранили при 4 ° C. Затем смесь секрета пота стерилизовали центрифугированием 3000, г, × 10 мин и стерильными шприцевыми фильтрами с размером пор 0,2 мкм (Millipore). Бактериальные изоляты были свежеприготовлены в течение ночи и собраны на следующий день, когда OD 600 достигнет 1.0. После этого следовало центрифугирование при 3000 g в течение 10 мин, полученный осадок промывали стерильным 0,01 М фосфатным буфером (pH 6,0) и повторно суспендировали в 10 мл свободного от бактерий пула пота. Эти свежеприготовленные образцы пула бактерий и пота инкубировали в орбитальном шейкере в аэробных условиях при 120 об / мин, 37 ° C в течение 24 часов. Каждый эксперимент включал отрицательные контроли (10 мл стерилизованного фильтром пула пота без бактериальной инокуляции) в тех же условиях, что и выше. Все эксперименты проводились в аэробных условиях.
Аналитическое определение кислых предшественников и отдушек
Лейцин и изолейцин измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Вкратце, 0,2 мл образца вносили пипеткой в центрифужную пробирку на 15 мл. После этого добавляли 4,8 мл 0,05 н. Соляной кислоты и диспергировали образец с помощью вихревой мешалки. Полученный раствор фильтровали через шприц из ПВДФ 0,45 мкм и смешивали с 0,1 мл натрий-боратного буфера (pH 10,2) и 0,2 мл раствора NBD-F в 2-миллилитровом желтом флаконе для ВЭЖХ.После плотного закрытия крышки флакон нагревали в печи при 60 ° C в течение 5 минут, затем охлаждали перед добавлением 0,4 мл 0,05 н. Соляной кислоты и вводом в ВЭЖХ для анализа. Измерение глицерина проводилось с помощью GC-FID. Пять миллилитров пота лиофилизировали в течение ночи с последующим добавлением в пробирку 0,2 мл воды и 1,8 мл экстракционного растворителя. Затем образец фильтровали через шприц из ПВДФ 0,45 мкм в пробирку для ГХ для анализа.
Чтобы измерить уровень молочной кислоты в поту, сначала создайте калибровочную кривую, используя 0.0, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0 и 5,0 частей на миллион стандарта молочной кислоты были установлены путем мониторинга массы иона m / z89 в выбранном ионном режиме (SIM) в анализе ЖХ / МС (ABSciex 4000 QTRAP). Затем образцы пота разбавляли в 500 раз с использованием метанола / воды (1: 1) и вводили в систему ЖХ / МС для анализа, и из образцов получали площади пиков массового числа молочной кислоты (m / z89). . Уровни молочной кислоты определяли путем сравнения площадей пиков образцов и откликов калибровочной кривой.
pH собранной пробы пота (10 мл) доводили до 12,0 добавлением NaOH (Wako), и лиофилизацию проводили в течение 2 дней. После лиофилизации в каждую пробирку с остатками добавляли 1 мл HCl (50% разбавление 37% HCl) (Sigma) с последующим встряхиванием и центрифугированием при 4000 об / мин и 20 ° C в течение 20 минут. Полученный супернатант переносили в пробирку Эппендорфа, добавляли 150 мкл хлороформа (Sigma) с последующим встряхиванием и центрифугированием при 14800 об / мин и 4 ° C в течение 20 мин.Затем фракции хлороформа объединяли и 10 мкл объединенной среды вводили в прибор GCMS для анализа. Agilent GC 7890B / MSD 5977A (Agilent, Wilmington, DE, USA) с автосамплером Gerstel MPS2 -TDU-CIS4 (Gerstel, Германия) использовали для разделения и анализа соединений запаха тела. ГХ-МС был оснащен колонкой DB-Wax, 60 мм × 0,25 мм с толщиной пленки 0,25 мкм (Agilent, Делавэр, США). Использовался режим впрыска жидкости большого объема — начальная температура инжектора была на уровне 10 ° C, уравновешенная на 0.В течение 5 минут использовали линейное изменение скорости 12 ° C / мин до конечной температуры 220 ° C, затем выдерживали в течение 5 минут. Объем инъекции составлял 10 мкл. Температуру печи поддерживали на уровне 40 ° C в течение 2 минут, повышали до 220 ° C со скоростью 3 ° C / мин и выдерживали в течение 4 минут. Расход газа-носителя гелия был постоянным и составлял 1,2 мл / мин. Масс-спектрометр работал при энергии ионизации 70 эВ со скоростью четыре сканирования / с в диапазоне м / z 29–450 и температуре источника ионов 230 ° C. Идентификацию структур / соединений проводили с использованием библиотеки Национального института стандартов и технологий (NIST’11) и внутренней библиотеки P&G MS с коммерчески доступными стандартами.ГХ-ольфактометрия выполнялась при первом запуске. Обонятельные измерения проводились тем же профессиональным парфюмером, который оценивал характеристики и интенсивность запаха у участников этого исследования.
Дополнительные файлы
Дополнительные файлы 2: (92K, zip)Таблица S2. Оценка запаха и данные метагеномного секвенирования для всех образцов в этом исследовании. Таблица S5. GC-ольфактометрия пота, взятого у детей и подростков. Таблица S6. Обнаруженные пути MetaCyc, которые, как было установлено, связаны с неприятным запахом, на основании значений обилия путей из HUMAnN2.Для области головы значимой ассоциации не обнаружено. Таблица S7. Ключевые пути, связанные с производством неприятного запаха, и их таксономические факторы. Таблица S8. Информация о том, как образцы были распределены в партиях для подготовки библиотеки и секвенирования, чтобы избежать эффекта партии. Таблица S9. Считывает сопоставленные (%) семейств генов UniRef90 и пути MetaCyc. (ZIP 92 кб)
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Серену Хейз и Сару Аршад за помощь в проверке содержания рукописи.
Финансирование
Эта работа финансировалась грантом SPF для сотрудничества A * STAR-P&G (APG2013 / 032). Финансовая поддержка компании Procter & Gamble, Цинциннати, Огайо, была использована для разработки и проведения части исследования.
Сокращения
3M2H | 3-метил-2-гексеновая кислота |
3M3SH | 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-3-сульфанилгексанол 3-метил-гексанол 3-метил-4-гексановая кислота |
HPLC | Высокоэффективная жидкостная хроматография |
LC / GCMS | Жидкостная хроматография и газовая хроматография-масс-спектрометрия |
Вклад авторов
YL, DS, PLN, JL, DS, PLN и задумал это исследование.PB, AHQN и DS участвовали в метагеномном секвенировании. PH, JT, RK, TMUT, JL и MO участвовали в культивировании и масс-спектрометрическом анализе. THL и DV проанализировали метагеномные данные под наблюдением PL и NN. THL и NN написали рукопись при участии всех авторов. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.
Примечания
Утверждение этических норм и согласие на участие
Исследование было проведено, и все образцы были собраны PRICEPTS Inc. (PRICE Product Testing Services Incorporated) в Маниле с одобрения Институционального обзора Сингапурского инновационного центра Procter & Gamble (Сингапур) Правления и в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (поправка 1996 г.).Руководства ICH по надлежащей клинической практике (GCP) были соблюдены, и добровольное информированное согласие было предоставлено с одобрения Совета по этике исследований P&G. Это клиническое исследование соответствовало руководящим принципам STROBE для наблюдательных исследований на людях. Матери, которые согласились принять участие в исследовании своих детей, подписали форму информированного согласия, а подростки, которые согласились участвовать, подписали форму согласия.
Согласие на публикацию
Не применимо.
Конкурирующие интересы
Несколько соавторов (Л.Y. D.S. P.L. J.L. P.B. P.H. J.T. R.K. T.T. M.O.) участвовал и / или проводил это исследование, будучи сотрудником компании Procter & Gamble. Эти соавторы могут владеть акциями компании, но прямой финансовой выгоды или убытков от публикации этой рукописи не ожидается. Согласно требованиям трудовых обязательств компании Procter & Gamble по соблюдению конфиденциальности, эти соавторы не могут заявлять о патентной деятельности.
Примечание издателя
Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и принадлежностей организаций.
Информация для авторов
Цзе Хау Лам, электронная почта: [email protected].
Давиде Верзотто, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@dottozrev.
Пурбита Брахма, электронная почта: [email protected].
Аманда Хуэй Ци Нг, электронная почта: [email protected].
Пин Ху, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@aqhgn.
Дэн Шнелл, электронная почта: [email protected].
Джей Тисман, электронная почта: [email protected].
Ронг Конг, электронная почта: [email protected].
Thi My Uyen Ton, электронная почта: [email protected].
Цзяньцзюнь Ли, электронная почта: [email protected].
May Ong, электронная почта: [email protected].
Ян Лу, электронная почта: [email protected].
Дэвид Суэйл, электронная почта: [email protected].
Пинг Лю, электронная почта: [email protected].
Цзицюань Лю, электронная почта: [email protected].
Ниранджан Нагараджан, электронная почта: gs.ude.rats-a.sig@nnajaragan.
Ссылки
1. Такахаши Л.К., Накашима Б.Р., Хонг Х., Ватанабэ К. Запах опасности: поведенческий и нейронный анализ страха, вызванного запахом хищника.Neurosci Biobehav Rev.2005; 29: 1157–1167. DOI: 10.1016 / j.neubiorev.2005.04.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Стокли П., Боттелл Л., Херст Дж. Л. Проснитесь и почувствуйте конфликт: запаховые сигналы в соревнованиях женщин. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2013; 368: 20130082. DOI: 10.1098 / rstb.2013.0082. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Киёкава Ю. Социальные запахи: феромоны тревоги и социальная буферизация. Curr Top Behav Neurosci. 2017; 30: 47–65. DOI: 10.1007 / 7854_2015_406. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4.Портер Р. Х., Чернох Дж. М., Балог Р. Д.. Сигнатуры запаха и распознавание родства. Physiol Behav. 1985; 34: 445–448. DOI: 10.1016 / 0031-9384 (85)-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Боудон Дэниел, Кокс Диана С., Эшфорд Дэвид, Джеймс А. Гордон, Томас Гэвин Х. Идентификация подмышечного стафилококка. участвует в производстве зловонного тиоспирта 3-метил-3-суфанилгексан-1-ола. Письма о микробиологии FEMS. 2015; 362 (16): fnv111. DOI: 10.1093 / femsle / fnv111. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Джеймс А.Г., Остин С.Дж., Кокс Д.С., Тейлор Д., Калверт Р.Микробиологическое и биохимическое происхождение запаха из подмышек человека. FEMS Microbiol Ecol. 2013; 83: 527–540. DOI: 10.1111 / 1574-6941.12054. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Fredrich E, Barzantny H, Brune I, Tauch A. Ежедневная борьба с запахом тела: в сторону активности подмышечной микробиоты. Trends Microbiol. 2013; 21: 305–312. DOI: 10.1016 / j.tim.2013.03.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Бек ХК, Хансен AM, Лауритсен FR. Катаболизм лейцина в жирные кислоты с разветвленной цепью у Staphylococcus xylosus.J Appl Microbiol. 2004. 96: 1185–1193. DOI: 10.1111 / j.1365-2672.2004.02253.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Troccaz M, et al. Картирование подмышечной микробиоты, ответственной за запах тела, с использованием независимого от культуры подхода. Микробиом. 2015; 3: 3. DOI: 10.1186 / s40168-014-0064-3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Джеймс А.Г., Хилиандс Д., Джонстон Х. Генерация летучих жирных кислот подмышечными бактериями. Int J Cosmet Sci. 2004. 26: 149–156. DOI: 10.1111 / j.1467-2494.2004.00214.Икс. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Лу К., Фукс Э. Предшественники потовых желез в развитии, гомеостазе и заживлении ран. Перспективы Колд-Спринг-Харбор в медицине. 2014; 4 (2): a015222 – a015222. DOI: 10.1101 / cshperspect.a015222. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Вилке К., Мартин А., Терстеген Л., Биль СС. Краткая история биологии потовых желез. Int J Cosmet Sci. 2007. 29: 169–179. DOI: 10.1111 / j.1467-2494.2007.00387.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Тибуто Д.Регулирование работы сальных желез человека. J Invest Dermatol. 2004; 123: 1–12. DOI: 10.1111 / j.1523-1747.2004.t01-2-.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Harker M, et al. Функциональная характеристика SNP в аллеле ABCC11 — влияние на метаболизм кожи в подмышечных впадинах, формирование запаха и связанное с ним поведение. J Dermatol Sci. 2014; 73: 23–30. DOI: 10.1016 / j.jdermsci.2013.08.016. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Мартин А. и др. Функциональный аллель ABCC11 играет важную роль в биохимическом формировании запаха из подмышечных впадин человека.J Invest Dermatol. 2010; 130: 529–540. DOI: 10.1038 / jid.2009.254. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Chng KR, et al. Профилирование всего метагенома выявляет зависимую от микробиома кожи восприимчивость к обострению атопического дерматита. Nat Microbiol. 2016; 1: 16106. DOI: 10.1038 / nmicrobiol.2016.106. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Чибани-Ченнуфи С., Бруттин А., Диллманн М.Л., Брюссоу Х. Взаимодействие фага-хозяина: экологическая перспектива. J Bacteriol. 2004. 186: 3677–3686. DOI: 10.1128 / JB.186.12.3677-3686.2004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Шу М. и др. Ферментация Propionibacterium acnes, комменсальной бактерии в микробиоме кожи человека, в качестве кожных пробиотиков против метициллин-резистентных
Staphylococcus aureus . ПлоС один. 2013; 8: e55380. DOI: 10.1371 / journal.pone.0055380. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Christensen GJ, et al. Антагонизм между Staphylococcus epidermidis и Propionibacterium acnes и его геномная основа.BMC genomics. 2016; 17: 152. DOI: 10.1186 / s12864-016-2489-5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Natsch A, Gfeller H, Gygax P, Schmid J, Acuna G. Специфическая бактериальная аминоацилаза расщепляет предшественники одоранта, секретируемые в подмышечной впадине человека. J Biol Chem. 2003; 278: 5718–5727. DOI: 10.1074 / jbc.M210142200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Эмтер Р., Натч А. Последовательное действие дипептидазы и бета-лиазы требуется для высвобождения одоранта человеческого тела 3-метил-3-сульфанилгексан-1-ола из секретируемого конъюгата Cys-Gly- (S) посредством Коринебактерии.J Biol Chem. 2008; 283: 20645–20652. DOI: 10.1074 / jbc.M800730200. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Ионеску Г., Константиниу С. Биология рода Acinetobacter. Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol. 2004. 49: 157–174. [PubMed] [Google Scholar] 26. Урбан Дж. И др. Влияние привычного и экспериментального использования антиперспирантов и дезодорантов на микробиом подмышек. PeerJ. 2016; 4: e1605. DOI: 10.7717 / peerj.1605. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Callewaert C, et al.Характеристика скоплений стафилококков и коринебактерий в подмышечной области человека. ПлоС один. 2013; 8: e70538. DOI: 10.1371 / journal.pone.0070538. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 28. Совет Сара Э., Сэвидж Эми М., Урбан Джули М., Элерс Меган Э., Скин Дж. Х. Пейт, Платт Майкл Л., Данн Роберт Р., Хорват Джули Э. Разнообразие и эволюция микробиома кожи приматов. Труды Королевского общества B: биологические науки. 2016; 283 (1822): 20152586. DOI: 10.1098 / РСПБ.2015.2586. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Troccaz M, et al. Гендерные различия между концентрациями нелетучих (R) / (S) -3-метил-3-сульфанилгексан-1-Ol и (R) / (S) -3-гидрокси-3-метил-гексановой кислоты предшественников запаха в подмышечные выделения. Chem Senses. 2009; 34: 203–210. DOI: 10.1093 / chemse / bjn076. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Прокоп-Пригге К.А., Грин К., Варалло Л., Высоцкий К.Дж., Прети Г. Влияние этнической принадлежности на производство одоранта в подмышечных впадинах человека.J Chem Ecol. 2016; 42: 33–39. DOI: 10.1007 / s10886-015-0657-8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 32. Йошиура К. и др. SNP в гене ABCC11 является детерминантом типа ушной серы человека. Нат Жене. 2006. 38: 324–330. DOI: 10,1038 / нг1733. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33. Abubucker S, et al. Метаболическая реконструкция метагеномных данных и ее применение к микробиому человека. PLoS Comput Biol. 2012; 8: e1002358. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1002358. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34.van der Ark KCH, van Heck RGA, Martins Dos Santos VAP, Belzer C, de Vos WM. Больше, чем просто интуиция: основанные на ограничениях метаболические модели в масштабе генома для прогнозирования функций кишечных микробов человека. Микробиом. 2017; 5: 78. DOI: 10.1186 / s40168-017-0299-х. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Тилинг Х, Глокнер Ф. Текущие возможности и проблемы в анализе микробного метагенома — биоинформатическая перспектива. Краткий биоинформ. 2012; 13: 728–742. DOI: 10,1093 / bib / bbs039.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Франк Дж. А. и др. Улучшенные сборки метагеномов и таксономическое объединение с использованием данных длинных циклических согласованных последовательностей. Научный доклад 2016; 6: 25373. DOI: 10,1038 / srep25373. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 40. Ли Х, Дурбин Р. Быстрое и точное согласование короткого чтения с преобразованием Барроуза-Уиллера. Биоинформатика. 2009; 25: 1754–1760. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btp324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 42.Kanehisa M, Sato Y, Kawashima M, Furumichi M, Tanabe M. KEGG как справочный ресурс для аннотации генов и белков. Nucleic Acids Res. 2016; 44: D457 – D462. DOI: 10.1093 / нар / gkv1070. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]Гликолевая кислота в качестве дезодоранта: дерматолог весит
Гликолевая кислота является основным ингредиентом пилингов для лица и очищающих средств благодаря своей способности устранять гиперпигментацию и удалять омертвевшую кожу клетки. И теперь энтузиасты красоты на TikTok нашли новое применение модной кислоте для ухода за кожей, заявив, что она работает как натуральный дезодорант.
Тег #glycolicacidasdeodorant набрал 4,6 миллиона просмотров, и многие люди сказали, что они отказались от дезодоранта в пользу формулы на основе гликолевой кислоты. Пользователи утверждают, что он может остановить потоотделение, уменьшить запах и даже помочь с обесцвечиванием подмышек.
Мы всегда ищем новые способы сохранить наши подмышки сухими и пахнуть свежими, особенно в летнюю жару. Вот почему мы обратились к доктору Марисе Гаршик, сертифицированному дерматологу из Нью-Йорка, чтобы узнать ее мнение о вирусной тенденции.
Что такое гликолевая кислота?
Гликолевая кислота — это альфа-гидроксикислота (AHA), полученная из сахарного тростника. Он действует как химический эксфолиант, удаляя омертвевшие клетки кожи и осветляя цвет лица. По словам Гаршика, он также может помочь уменьшить участки обесцвечивания и улучшить внешний вид тонких линий и морщин, что делает его популярным ингредиентом в формулах для ухода за кожей.
Можно ли использовать гликолевую кислоту в качестве дезодоранта?
Хотя многие пользователи TikTok утверждали, что формулы гликолевой кислоты могут стать хорошей заменой вашему део, на самом деле они не будут держать ваши подмышки сухими в жаркие дни.«Применение гликолевой кислоты не уменьшит потоотделение», — сказал Гаршик. «Чтобы считаться антиперспирантом или продуктом, блокирующим пот, продукт должен содержать соединение на основе алюминия, которое образует пробку, блокирующую выделение пота».
Тем не менее, это может помочь избавиться от запаха. «Считается, что гликолевая кислота помогает уменьшить запах тела, снижая pH кожи и затрудняя выживание вызывающих запах бактерий», — сказал Гаршик. «Отшелушивая омертвевшие клетки кожи и снижая pH кожи, он также может помочь предотвратить запах тела, предотвращая накопление и уменьшая вероятность того, что бактерии будут вызывать неприятный запах.
Дерматолог доктор Линдси Зубрицки (она же @dermguru) назвала тенденцию «законной» в видео, которое с тех пор набрало более 23 000 просмотров. Она сказала, что это не только избавляет от запаха, но также может помочь с вросшие волосы и гиперпигментация в этой области.
Есть ли какие-либо риски?
Гликолевая кислота, как и другие отшелушивающие кислоты, может вызывать раздражение кожи, особенно при нанесении на подмышки, где кожа тонкая, и складки натирают каждую другое, сказал доктор Гаршик.Это может привести к покраснению, шелушению и повышенной чувствительности.
Чтобы снизить вероятность раздражения, следует придерживаться более низких концентраций. «Максимальная концентрация гликолевой кислоты, которую можно использовать в этой области, составляет от 8 до 10 процентов, но даже это может вызывать раздражение, поэтому чем ниже концентрация, тем лучше», — сказал Гаршик. И его следует использовать экономно, только один-два раза в неделю.
Как попробовать:
Тонизирующий раствор с гликолевой кислотой от Ordinary — фаворит среди сторонников этой тенденции.И хотя Гаршик сказал, что раствор — отличный вариант для вашего лица, он не предназначен для использования в качестве дезодоранта и, как следствие, может вызвать раздражение. Вместо этого вам, вероятно, лучше использовать дезодорант, в состав которого входит гликолевая кислота, поскольку он может содержать другие ингредиенты, которые минимизируют чувствительность.
Surface Deep Anti-Odorant Pads
Если вы хотите проверить на себе предполагаемую способность гликолевой кислоты подавлять запах, Гаршик сказал, что эти дезодорирующие салфетки могут помочь.«[Они] содержат гликолевую кислоту в форме биоразлагаемых салфеток, но также содержат пробиотики, сок листьев алоэ и глицерин, которые помогают увлажнить кожу и уменьшить вероятность раздражения», — сказала она. В набор входит 30 салфеток в индивидуальной упаковке, которые можно упаковать в ручную кладь, сумочку или спортивную сумку, чтобы вы могли освежиться в дороге.
«Сработало отлично и продолжало работать до следующего дня (примерно через 20 часов до следующего душа)», — написал один обозреватель Amazon. «Я даже бегал и поднимал в течение этого 20–24-часового окна, и это все равно работало! Ни сыпи, ни зуда, ни чего-либо еще.»
Boscia Prebiotic + Probiotic Освежающий дезодорант для всего тела
Этот дезодорант, содержащий гликолевую кислоту, а также смесь пребиотиков и пробиотиков, уменьшает неприятный запах и укрепляет кожу. Универсальную формулу можно использовать для устранения любых проблем потные области, от груди до ног, и предотвращают натирание.
Чтобы узнать больше о подобных историях, посетите:
Подпишитесь на наши информационные бюллетени «Что мы любим» и «One Great Find» и загрузите наше приложение СЕГОДНЯ, чтобы узнать о предложениях , советы по покупкам, рекомендации по недорогим продуктам и многое другое!
Эмма Стессман — помощник редактора Shop TODAY.
6 советов по уменьшению запаха тела
Когда-нибудь был момент, когда вы задавались вопросом, пахнет ли вы, ну, не так ли хорошо? Такое случается. Но вы можете сделать несколько вещей, чтобы избавиться от запаха тела.
1. Держите себя в чистоте
Принимайте душ не реже одного раза в день, и вы смоете пот и избавитесь от некоторых бактерий на коже.
Пот сам по себе практически не имеет запаха. Но когда бактерии, живущие на вашей коже, смешиваются с потом, они быстро размножаются и вызывают сильный запах.
Тщательное мытье, особенно тех мест, где вы склонны потеть, может помочь избавиться от запаха тела.
2. Используйте антибактериальное мыло
Тщательное мытье кусочком антибактериального мыла поможет избавиться от некоторых бактерий, которые могут помочь с запахом.
Ищите слово «антибактериальный» на упаковке мыла.
3. Отсек для полотенец
После душа полностью вытрите себя, уделяя особое внимание тем местам, где вы сильно потеете.
Если ваша кожа сухая, на ней сложнее размножаться бактериям, вызывающим запах тела.
4. Используйте антиперспиранты «Industrial Strength»
После того, как вы очиститесь и высохнете, нанесите сильный антиперспирант на подмышки. В них есть хлорид алюминия, химическое вещество, которое помогает удерживать пот, и часто в них также есть дезодорант. Используйте его дважды в день — утром и вечером.
Чтобы получить мощный антиперспирант, не нужен рецепт. Ищите те, которые говорят, что они более сильные.
Если вы считаете, что вам нужна дополнительная помощь, спросите своего врача о рецептурных антиперспирантах.
5. Следите за чистотой одежды
Часто меняйте одежду, когда сильно потеете. Свежая одежда помогает избавиться от запаха тела.
Не забудьте также сменить носки, особенно если у вас часто пахнет ногами. Используйте дезодоранты в обуви, часто меняйте стельки и по возможности ходите босиком.
6. Избавьтесь от некоторых продуктов или напитков или сократите их употребление
То, что вы едите, влияет на запах вашего тела. Пища, которая заставляет вас больше потеть, например острый перец или другая острая пища, также может вызывать неприятный запах тела.А аромат таких продуктов, как лук или чеснок, может передаваться в поту. Напитки с кофеином или алкоголем также могут вызвать усиление потоотделения.